分子诊断知识点
第十三章分子诊断
正常探针 异常探针
20
Leber 病患者 PCR/SSCP分析 分析
﹣
+
正常人
纯合突变
杂合突变
PCR/单链构象多态性分析（SSCP） PCR/单链构象多态性分析（SSCP） 单链构象多态性分析 原理
将经扩增的DNA片段变性形成单链，由于序列不同， 将经扩增的DNA片段变性形成单链，由于序列不同，单 DNA片段变性形成单链 链构象就有差异， 链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率 不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。 不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。
三、分子诊断常用技术
核酸分子杂交技术 等位基因特异寡核苷酸探针(allele 等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific oligonucleotide, ASO) DNA限制性长度多态性(restriction DNA限制性长度多态性(restriction 限制性长度多态性 fragment length polymorphism, RLFP)分析 RLFP)分析 PCRPCR-SSCP DNA测序 DNA测序 DNA芯片技术 DNA芯片技术
DNA分析中常用的遗传性多态性标记有3类： DNA分析中常用的遗传性多态性标记有3 分析中常用的遗传性多态性标记有
RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记； 1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记； 重复序列多态性（VNTR） STR其重复次数在人群中存在 2）重复序列多态性（VNTR）：如STR其重复次数在人群中存在 变异， 为第二代多态性标记； 变异，形成多态即 VNTR ，为第二代多态性标记； 单碱基多态性（SNP） 3）单碱基多态性（SNP）：发生在基因组中的单个核苷酸的替 为第三代多态性标记。 代，为第三代多态性标记。
分子诊断学 期末复习资料
1.（一）真核生物基因组：①有细胞核基因组和细胞器基因组之分；②核基因组以线状DNA分子的形式存在于染色质上；③基因多数为断裂基因，有内含子结构和大量重复序列；④单顺反子，基因家族；⑤核基因组由染色体DNA组成，分子量大，结构复杂，与蛋白质结合。
（二）原核生物基因组：①基因组相对较小，通常为一条双链DNA分子②功能相关的基因高度集中，构成操纵子③重复序列少，大多数的蛋白质基因保持单拷贝形式，而RNA基因常是多拷贝④没有内含子，基因是连续的⑤多顺反子，构成转录单位⑥绝大部分DNA都是用于编码蛋白质的，只有很少不编码序列⑦DNA分子中有各种功能区（三）病毒基因组：①只有一种核酸，4种类型，为双链DNA、单链DNA、双链RNA、单链RNA ②核酸大小差别较大③具有启动子和操纵子结构④具有重叠结构2.核酸提取总原则和过程：1)分离制备总原则：①保证核酸一级结构的完整性②尽量排除其他的污染，保证核酸的纯度2)核酸提纯步骤：①破碎细胞：超声破碎，匀浆法、低渗法②提取：采用酶学或化学试剂酚等去除蛋白质及其他大分子；③纯化：3.核酸分子杂交基本原理：利用核酸变性和复性的性质，使具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下按照碱基互补配对原则形成异质双链的过程。
（可发生在同源或异源的DNA链与DNA链之间，也可在RNA链与DNA链）4.理想探针的特点：①高度特异性②易于标记和检测③灵敏度高④稳定且制备方便5.核酸探针的种类和优缺点：1)基因组DNA探针：优点：制备方法简便、省时、易得，稳定不易降解，标记方法多样也较成熟缺点：杂交中可能会自我复性2)cDNA探针：优点：具有基因组DNA优点，且不存在内含子和其他高度重复序列，尤其适用于基因表达研究。
缺点：制备困难。
3)RNA探针：优点：不含高度重复序列，可降低非特异性杂交，复杂性低，杂交反应效率高；缺点：不稳定，标记方法复杂。
4)寡核苷酸探针：优点：①短的探针比长探针杂交速度快，特异性好；②可以在短时间内大量制备；③可以在合成过程中进行标记制成探针；④可合成单链探针，避免用双链DNA探针在杂交中的自我复性，提高了杂交效率；⑤可以检测小DNA片段缺点：长度有局限性，短链优于长链。
分子诊断学重点1
分子诊断：应用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术，称为分子诊断。
分子诊断学：是临床检验诊断学的一个重要分支，它利用分子生物学技术来研究机体外源性和内源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的改变，从而为疾病的预测、预防、诊治和转归提供分子水平信息。
基因：基因是一段携带功能产物（多肽、蛋白质、tRNA、rRNA和某些小分子RNA）信息的片段基因组：是指生物体的一套完整的单倍体遗传信息，包括所有基因和基因间的区域。
基因组学：指对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录图谱）、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一门科学。
人类基因组多样性：即人类基因组的个体差异。
生物大分子：指分子体内由分子量较低的基本结构单位首位相连形成的多聚化合物。
CsCl-EB密度梯度超速离心法：CsCl-EB法是一种沉降平衡离心法，经超速离心，离心介质CsCl形成一连续的密度梯度，在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。
(CsCl-EB法分离质粒和染色体DNA就取决于溴化乙锭与线状及闭环DNA分子的结合量有所不同)。
Western印迹：蛋白质印迹，又称免疫印迹，是一种通过标记的抗体检测经SDS-PAGE分离的特定蛋白质的技术。
克隆载体：能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子，用于在宿主细胞中克隆和扩增外援DNA片段表达载体：能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子，用于在宿主细胞中获得外援基因的表达产物。
重组DNA技术：是指在基因水平上，将目的DNA在体外重组于能自我复制的载体DNA分子上，然后将重组DNA导入宿主细胞中进行增生，以获得大量的目的DNA片段，或以此为基础，通过基因的诱导表达，得到大量相应蛋白质产物的过程。
基因组文库：将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后导入宿主细胞进行克隆。
分子诊断复习
名词解释：Molecular diagnosis ：分子诊断，是指通过检测基因的结构异常或其表达异常，对人体的健康状态和疾病做出诊断的方法，属于病因学诊断。
评估基因的存在和缺陷通常以DNA为材料，而评估基因的表达量则以基因转录或翻译的产物RNA或蛋白质为材料来分析评估个体的生理/病理状态。
目前PCR、寡核苷酸探针杂交、DNA测序仍然是分子诊断的主流技术。
Molecular cloning：分子克隆，是指按照人的意愿， 在体外将制备的DNA片段与载体重组, 然后导入受体细胞, 并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝。
此技术称为分子克隆技术或DNA重组技术。
Molecular hybridization：核酸分子杂交，是在核酸变性与复性的基础上建立起来的一种分子生物学技术。
具有一定同源性的两条DNA链或两条RNA链或一条DNA链和一条RNA链在一定条件下按照碱基互补配对原则形成异质双链的过程称为分子杂交。
PCR：聚合酶链反应，是已知特异性DNA序列的体外引物定向酶促扩增技术。
RT-PCR：逆转录PCR，先将RNA用逆转录酶逆转录成cDNA，然后再加入特异引物对目标片段进行扩增，扩增产物的分析与其他常见PCR方法类似。
常用的逆转录酶有AMV逆转录酶（最适温度42℃)和MoMLV逆转录酶（最适温度37℃)，常用的逆转录引物有三种：随机引物、Oligo(dT)和特异性引物。
FQ-PCR：实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
Gene chip：基因芯片，又称DNA芯片或DNA微阵列，即将大量的基因片段有序地、高密度地固定排列在玻璃片、硅片或纤维膜等载体上制成点阵。
Genetic engineering：基因工程，是指将基因进行克隆, 并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白质或多肽产物, 或定向改造细胞和个体的特性所用的方法及相关工作。
分子诊断学复习
名词解释 1. DNA 测序：基因是遗传信息的物理和功能单位，含有产生一条多肽链或功能 RNA 所必需的全部核苷酸序列，即一段 DNA 序 列2. 蛋白质组（proteome ）:源于蛋白质（protein ）与 基因组（genome ）两个词的杂合，意指"一种基因组所表达的全套蛋 白质”，即包括一种细胞或一个组织乃至一种生物所表达的全部蛋白质。
3. 蛋白质组学（proteomics ）:蛋白质组学就是对机体或组织或细胞的所有蛋白质进行鉴定和结构功能分析的一个研究领域。
基因：是一段携带功能产物信息的 DNA 片段，是控制某种性状的遗传单位。
4. 基因组（genome ）:是指一个细胞或生物体的一套完整的单倍体遗传物质。
5. 基因组学（Ge no mics ）:指对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录图谱，核苷酸序列分析，基因定 位和基因功能分析的一门科学。
6. 基因扩增：定义：指基因拷贝数增加的现象，基因扩增是基因表达增加的一种重要机制。
7. 聚合酶链反应（PCR :利用DNA 聚合酶催化一对引物间的特定 DNA 片段在体外进行快速、大量扩增的方法，也称无细胞克 隆技术。
8. 增色效应:DNA 变性后，双螺旋解体，碱基堆积不复存在，螺旋内部的碱基暴露，致变性后的 DNA 对260nm 紫外光的吸光 率明显增加，这种现象称为增色效应。
9. 熔解温度：将DNA 解链达到50%或 OD260达到最大值的50%寸的温度，称为解链温度或熔解温度。
10. 溴化乙锭（ethidium bromide ，EB ）是一种荧光染料，可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下发岀红色荧光。
11. 引物：与靶基因片段两侧互补的寡核苷酸，其本质是单链 DNA 它决定扩增产物的特异性和长度。
12. 短产物片段：的长度严格限定在 2个引物链的5 '端之间，是需要扩增的特定片段，以指数形式扩增 （2n ）。
分子诊断学
分子诊断学：以分子生物学理论为基础，利用分子生物学技术和方法研究人体内/外源性生物大分子体系的存在、结构或表达调控变化，为疾病的预防诊断治疗和转归提供信息和依据。
基因：有功能的DNA片段，含有合成有功能的蛋白质多肽琏或RNA所必需的全部核苷酸序列，是遗传的结构和功能单位。
基因组：细胞或生物体的一套完整单倍体的遗传物质的总和。
操纵子：操纵基因与其控制下的结构基因共同组成的功能单位。
断裂基因：指基因的内部存在间隔区，间隔区的DNA序列与该基因所决定的蛋白质没有关系。
间隔区又称为内含子。
出现在成熟RNA中的有效区段称为外显子。
SNP：是指单个核苷酸变异而形成的DNA分子多态性。
根据SNP在基因组中的位置，可分为编码区SNP（cSNP）、基因周边区SNP（pSNP）、基因间SNP（iSNP）。
转座因子/可转座元件：能在基因组中从一个位点移至另一个位点的DNA序列。
克隆：细胞通过无性繁殖所产生的与亲代细胞完全相同的子代群体称克隆。
分子克隆：将某一特定的DNA片段通过重组DNA技术插入到一个载体中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片段的“群体”。
基因工程：将基因进行克隆，并利用克隆的基因在受体细胞内复制、转录和翻译表达，制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造细胞和个体的特性所用的方法及相关工作。
DNA重组：将不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键将末端连接形成重组DNA。
载体：是携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具，本质为DNA。
克隆载体：能将目的基因在受体细胞中复制扩增并产生大量目的基因的载体。
表达载体：能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体。
穿梭载体：能够在两类不同宿主中复制、扩增和选择的载体。
转染：将噬菌体、病毒或以他们为载体的DNA重组体导入真核细胞的过程转化：将重组的DNA分子引入细菌（原核细胞），使其在细菌体内扩增及表达的过程。
DNA复性：当变性因素解除后，两条DNA链又可通过碱基互补配对形成DNA双螺旋结构。
分子诊断1
名词解释分子诊断学（molecular diagnostics）：分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法来研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、诊断、治疗和转归提供信息和依据的一门学科。
基因组(Genome)：指生物体全套的遗传信息。
基因组学是研究生物基因组的组成、组内各基因的结构、功能及表达调控的科学，包括基因组核苷酸序列测定、基因组作图、基因定位及基因功能分析等。
基因组学（genomics）：是研究生物基因组的组成，组内各基因的结构、功能及表达调控的科学，包括基因组核苷酸序列测定、基因组作图、基因定位及基因功能分析等。
包括结构基因组学和功能基因组学。
人类基因组多样性（human genome diversity）同一种或不同种基因组均存在或多或少的差异，这种差异称人类基因组多样性。
微卫星DNA多态性：微卫星DNA的排列方式有的三种：完全重复（无间隔），不完全重复（有非重复序列的间隔）和混合重复（2个或多个重复序列彼此毗连连续出现）。
完全出现最多见的方式。
转座因子：能在基因组中从一个位点移至另一位点的DNA序列，称为转座因子或转座元件。
黏性末端：对于双链DNA病毒而言，基因组双链两端具有能够互补的单链DNA部分，称为黏性末端。
重叠基因（overlapping gene）：是指两个或两个以上基因的ORF共有一段DNA序列，即某段DNA序列成两个或两个以上基因的共有的组成部位。
分段基因（segnented genome）：是指病毒基因组中由几条不同的核酸分子组成，另见于tRNA病毒、RNA病毒及双链RNA病毒。
人类基因组计划（HGP）：是旨在测出人类基因组30亿碱基对的核苷酸序列，发现所有人类基因并确定他们在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息，发展基因组学新技术，探讨人类基因组研究的社会、法律和伦理等问题的一个国际性研究项目。
分子诊断知识科普
分子诊断知识科普分子诊断是一种基于分子生物学和遗传学原理的诊断方法，通过分析个体的基因、蛋白质或其他分子水平的信息，来判断其是否患有某种疾病或具有某种特定的遗传变异。
分子诊断可以通过检测基因突变、基因表达水平、蛋白质标记物等来识别疾病的存在或发展状态。
与传统的疾病诊断方法相比，分子诊断具有更高的准确性和灵敏度。
传统的诊断方法主要依靠临床症状、体征和影像学检查等，但这些方法往往无法提供足够的信息来进行准确的诊断。
而分子诊断则可以直接检测疾病相关的分子标记物，从而提供更为准确的诊断结果。
一、分子诊断的基本原理分子诊断的基本原理是通过检测和分析个体的基因组、转录组和蛋白质组等分子信息，来确定是否存在某种疾病或病理状态。
这种方法通常需要从患者的血液、体液或组织样本中提取并分析分子，并与正常个体或已知疾病个体的分子信息进行比对。
分子诊断的核心技术包括基因测序、PCR(聚合酶链式反应)、核酸杂交等。
其中，基因测序是一种通过测定DNA序列来获取个体基因信息的方法。
PCR是一种通过扩增DNA片段来增加检测灵敏度的方法。
核酸杂交则是一种通过将目标序列与一段互补的DNA或RNA序列结合来检测目标序列的方法。
通过这些技术，分子诊断可以检测到包括遗传疾病、感染病、肿瘤等在内的多种疾病。
例如，通过检测BRCA1和BRCA2基因的突变可以判断一个人是否患有乳腺癌或卵巢癌的遗传风险。
通过检测某种病原体的DNA或RNA可以确定感染者的感染状态。
通过检测肿瘤细胞中的特定基因突变可以确定肿瘤的类型和治疗策略。
二、分子诊断的应用领域分子诊断在医学领域有着广泛的应用。
下面将介绍一些常见的应用领域。
1. 遗传疾病诊断：分子诊断可以通过检测个体的基因突变来确定遗传疾病的存在和风险。
例如，通过检测孩子的基因突变可以确定其是否患有遗传性疾病，如先天性心脏病、遗传性失聪等。
2. 传染病诊断：分子诊断可以通过检测病原体的DNA或RNA来确定感染病的存在和类型。
分子诊断学知识点总结
分子诊断学知识点总结分子诊断学是指利用分子生物学的技术和方法，对生物体内的DNA、RNA、蛋白质等分子水平进行诊断和检测的一门学科。
随着分子生物学技术的不断发展和进步，分子诊断学在临床诊断、疾病预防和治疗等方面发挥着越来越重要的作用。
下面将对分子诊断学的基本原理、常见技术和应用进行概述。
一、基本概念1. DNA、RNA和蛋白质的基本结构和功能DNA是生物体内的遗传物质，包含了细胞的遗传信息，主要存在于细胞核中。
RNA是一种中间体分子，可以将DNA中的遗传信息转录成蛋白质。
蛋白质是生物体内的重要分子，是细胞结构和功能的基本单位。
2. 基因突变与疾病基因是决定生物性状的遗传信息的单位，基因突变是指基因序列发生了变化，可能导致蛋白质功能异常，甚至引发疾病。
3. 分子诊断学的基本原理分子诊断学利用分子生物学技术对生物体内的分子进行检测和分析，从而实现疾病的诊断、预防和治疗。
二、常见技术1. 聚合酶链式反应（PCR）PCR是一种在体外扩增DNA片段的技术，可以从少量的DNA样本中扩增出大量的DNA片段，是分子诊断学中常用的技术手段。
2. 核酸杂交技术核酸杂交技术是一种通过DNA或RNA的互补配对进行检测的方法，可以用于寻找特定基因或病毒的存在。
3. 蛋白质质谱分析蛋白质质谱分析是一种通过蛋白质的质量和结构来对蛋白质进行分析和检测的技术。
4. 基因测序技术基因测序技术是一种对DNA序列进行测定和分析的技术，可以帮助人们了解基因的结构和功能。
5. 基因芯片技术基因芯片技术是一种可以在一个芯片上同时检测多个基因的技术，可以用于疾病的诊断和预测。
三、应用领域1. 临床诊断分子诊断学在临床诊断中可以对各种疾病进行快速和精准的诊断，如肿瘤、遗传病、感染病等。
2. 疾病预防分子诊断学可以通过对病原体的检测和分析，帮助人们预防感染性疾病的发生和传播。
3. 个体化治疗分子诊断学可以根据个体的基因信息，为患者提供个性化的治疗方案，提高治疗的效果和减少副作用。
分子诊断学重点内容
分子诊断学重点内容（Navy）1、分子诊断学（molecular diagnostics）是利用分子生物学技术来研究机体外源性和内源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的改变，从而为疾病的预测、预防、诊治和转归提供分子水平信息。
2、基因：是一段携带功能产物（多肽，蛋白质，tRNA和rRNA和某些小分子RNA）信息的DNA片段，是控制某种性状的的遗传单位。
3、密码子偏爱（codon bias ）指在不同物种的基因中经常为某种氨基酸编码的只是其中的一个密码子。
当鉴别到一个ORF时，密码子偏爱常常用来确定这个ORF是否是一个基因。
4、基因组（genome）：指一个细胞或生物体的一套完整的单倍体遗传物质。
5、C值矛盾：生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象称为C值矛盾也称C值佯谬（ C value paradox）6、N值矛盾：基因组中基因数目与生物进化程度或复杂程度的不对称性，称为N值矛盾或N值佯谬（N value paradox）。
7、基因组计划是指以获得某物种基因组全序列为主要目标的科学计划。
8、厘摩尔根（cM）即重组频率为1%的两个基因间的遗传距离9、基因组学（Genomics）指对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录图谱）核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学。
10、鉴别蛋白质编码基因的五项标准是什么？开放阅读框、密码子偏爱、序列保守性、转录产物、基因失活11、原核生物是细菌等原始生物的总称，是最简单的细胞生物体12、质粒：独立于细菌细胞染色体以外，能自主复制并稳定遗传的共价闭合环状DNA（cccDNA）分子，称为质粒(plasmid)13、琼脂糖凝胶电泳泳动速度：超螺旋DNA分子>线性DNA分子>半开环DNA分子14、接合作用(conjugation)当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA 从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作(conjugation)。
分子诊断学
分子诊断学【基因】也称为遗传因子，是控制性状的基本遗传单位（突变单位、重组单位和功能单位），是指线性排列在染色体上的，携带有一定遗传信息，具有一定结构，并能进行自我信息复制与传递，控制生物个体性状表现的一段DNA或RNA序列常常称为“染色体基因”。
【基因特点】①自我复制（半保留复制）②基因决定性状③能够突变④不同物种，其基因大小不同⑤原核生物：基因数目少，结构简单、紧凑，常具有操纵子结构，序列利用效率高，易突变，大多为多顺反子。
⑥真核生物：基因数目很多，结构复杂，常含重复序列和非编码序列，机制复杂，相对稳定，大多为单顺反子。
【断裂基因】指基因编码区域的不连续性，是真核基因的结构特点，即基因的外显子被内含子间隔成不连续、按顺序镶嵌排列在基因的ORF区域（外显子和内含子交替出现，每个内含子具有5‘-GT------AG-3’边界序列）.【重叠基因】有两个或两个以上的基因共用一段DNA序列，或一段DNA序列成为两个或两个以上基因的组成部分。
重叠基因有编码序列，也有调控序列，仅见于线粒体和质粒DNA。
【操纵子（Operon）】原核基因功能单位，含有一个启动子序列和多个结构基因。
指数个功能上相关的基因串联在一起，连同上游的调控区和下游的转录终止信号构成基因的表达单位。
【基因表达特点、方式和调控基本原理】1.特点①时间特异性：单细胞生物：特定基因表达严格按特定时间顺序发生。
多细胞生物：基因表达在不同的发育阶段严格按特定时间顺序开启或关闭。
又称为阶段特异性②空间特异性：在某发育阶段，同一基因在不同组织器官其表达有差异。
又称为细胞特异性。
2.方式①组成性表达：某些基因的表达不受内外环境的影响，在个体生长过程中，几乎在所有的组织中持续表达或变化很小。
这些基因一般为看家基因②诱导和阻遏表达：诱导：基因受环境刺激而开启表达增强。
阻遏：基因受环境刺激而表达受到抑制和减弱③协调表达：在一定控制机制下，功能相关的一组基因进行协调共同表达。
分子诊断学完整终结版
1.分子诊断学:是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法来研究人体内源性或外源性生物大分子和2.SNP：单核苷酸多态性，指在基因组上单个核苷酸的变异，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。
3．基因(gene)：是有功能的DNA片段，含有合成有功能蛋白质多肽链或RNA所必学的全部核苷酸序列，是遗传的结构和功能单位。
分为结构基因和调控基因。
4．结构基因：编码蛋白质或RNA的编码序列调控基因：保证转录功能起调控作用的非编码序列5．操纵子（operon）操纵基因与其控制下的结构基因共同组成的功能单位6．断裂基因：指基因的内部存在间隔区，间隔区的DNA序列与该基因所决定的蛋白质没有关系。
间隔区又称为内含子。
出现在成熟RNA中的有效区段为外显子。
7.重叠基因：指基因的开放阅读框（ORF）存在一个或多个核苷酸重叠的基因8.跳跃基因：又称转座子，基因在染色体上的位置不固定，能由一条染色体跳到另一条染色体上。
9.必须基因：生物体中存在的一些维持生物细胞生长所必需的基因，缺少或突变这些基因均能导致生物体死亡10.基因组（genome）：细胞中一套完整单倍体的遗传物质的总和.11.基因组结构主要指不同的DNA功能区在DNA分子中的分布和排列12．多顺反子（polycistron）：操纵子中常常有一至多个功能相关的结构基因串连一起，受同一个调控区调控，转录在同一个mRNA分子中。
13.黏性末端：基因组双链两端具有能够互补的单链DNA部分14.末端正向重复序列：又称末端冗余，指病毒双链DNA分子两端有一段相同的核苷酸15.末端反向重复序列（ITR）：指病毒基因组两端的反向互补重复序列16.重叠基因：指两个或两个以上基因的ORF共有一段DNA序列17.分段基因：指病毒基因组由几条不同的核酸分子组成，多冗于tDNA病毒，RNA病毒及双链RNA病毒18.LTR：即长末端重复序列，逆转录病毒逆转录后生产的dsDNA中，两端有LTR结构19.DNA重组：是指将不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键将末端连接形成重组DNA.20.DNA克隆（分子克隆）：将某一特定DNA片段通过重组DNA技术插入到一个载体（质粒和病毒等）中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片段的群体。
分子诊断学重点内容
分子诊断学重点内容（Navy）1、分子诊断学（molecular diagnostics）是利用分子生物学技术来研究机体外源性和内源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的改变，从而为疾病的预测、预防、诊治和转归提供分子水平信息。
2、基因：是一段携带功能产物（多肽，蛋白质，tRNA和rRNA和某些小分子RNA）信息的DNA片段，是控制某种性状的的遗传单位。
3、密码子偏爱（codon bias ）指在不同物种的基因中经常为某种氨基酸编码的只是其中的一个密码子。
当鉴别到一个ORF时，密码子偏爱常常用来确定这个ORF是否是一个基因。
4、基因组（genome）：指一个细胞或生物体的一套完整的单倍体遗传物质。
5、C值矛盾：生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象称为C值矛盾也称C值佯谬（ C value paradox）6、N值矛盾：基因组中基因数目与生物进化程度或复杂程度的不对称性，称为N值矛盾或N值佯谬（N value paradox）。
7、基因组计划是指以获得某物种基因组全序列为主要目标的科学计划。
8、厘摩尔根（cM）即重组频率为1%的两个基因间的遗传距离9、基因组学（Genomics）指对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录图谱）核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学。
10、鉴别蛋白质编码基因的五项标准是什么开放阅读框、密码子偏爱、序列保守性、转录产物、基因失活11、原核生物是细菌等原始生物的总称，是最简单的细胞生物体12、质粒：独立于细菌细胞染色体以外，能自主复制并稳定遗传的共价闭合环状DNA （cccDNA）分子，称为质粒(plasmid)13、琼脂糖凝胶电泳泳动速度：超螺旋DNA分子>线性DNA分子>半开环DNA分子14、接合作用(conjugation)当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作(conjugation)。
分子诊断重点
名词解释1、基因：基因是一段携带功能产物（多肽，蛋白质，tRNA和rRNA和某些小分子RNA）信息的DNA片段，是控制某种性状的的遗传单位。
2、类核：原核生物基因组DNA位于细胞的中央区，与支架蛋白和RNA结合在一起，以复合体的形式存在，经高度盘旋聚集形成一个较为致密的区域，称为类核。
质粒：是细菌细胞染色体以外的能独立复制并能稳定遗传的共价闭合环状DNA分子。
重叠基因（o v e r l a p p i n g g e n e）：病毒基因组的一段D N A序列有两个或两个以上的开放读码框架，可以编码两种或两种以上的多肽链，称为重叠基因。
载体（vector）:是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。
指在P C R扩增过程中荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。
荧光定量P C R：在P C R反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个P C R进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
淬火：将热变性DNA骤然冷却的处理过程。
核酸探针：是指能与待测的靶核酸序列互补杂交的已知序列的核酸片段。
一般带有某种适当的标记以便检测。
基因芯片：指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量基因探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传信（基因序列及表达的信息）。
S o u t h e r n印迹杂交：DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。
荧光原位杂交（F I S H）：是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。
通过荧光标记的探针与待测标本的核酸进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异常的细胞、组织标本进行检测和诊断。
运用分子生物学技术直接检出微生物的DNA／RNA，判断有无感染和何种病原体感染。
16、完整检出策略：运用分子生物学技术直接检出微生物的DNA／RNA，判断有无感染和何种病原体感染，并能对病原体进行分类、分型（亚型）和耐药性鉴定。
分子诊断学概论
分子诊断学概论一、分子诊断的基本概念与历史发展二、分子诊断的现状三、分子诊断的主要技术四、分子诊断的标准化与质量控制五、分子诊断的未来趋势分子诊断基本概念◆1953年，Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构模型，为揭开人类生命现象的本质奠定了基础，标志着分子生物学的开端，也使得对疾病发病机制的认识从整体、细胞水平逐渐深入到分子水平◆分子诊断学（Molecular diagnostics），是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法，研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、诊断、治疗和转归提供信息和依据的一门学科◆通常所称的基因诊断，指针对DNA或RNA的分子诊断技术临床检验诊断体外诊断（IVD ）报告，影响约70%临床决策影像学诊断临床诊断疾病的检验诊断核磁共振辅助检验B 超CT体格检查病史临床检验诊断（实验室检验诊断）临床体液、血液检验临床化学检验临床免疫、血清学检验临床微生物学检验（细菌室）临床细胞分子遗传学检验CT （computed tomography ，电子计算机断层扫描）临床检验诊断发展阶段发展阶段历史时期技术类型典型特征简单划分第一代早期细胞形态学检验诊断•以疾病的表型改变为依据•非特异、滞后•难以早期诊断传统的临床检验诊断学学科第二代1950年代生物化学检验诊断第三代1960年代免疫学检验诊断第四代1970年代末基因检验诊断 (分子生物学检验诊断)•以疾病基因为探测对象•特异、敏感•早期诊断、预测新型的临床检验诊断学学科分子诊断（临床分子生物学检验诊断）分子生物学医学检验（临床检验诊断）分子生物学（molecular biology）1953年Watson&Crick发现DNA双螺旋结构模型70年代以来，成为生命科学最具活力的学科前沿分子医学（molecular medicine）、基因诊断（genetic diagnosis）分子生物学理论和技术方法被应用于临床分子生物学与医学的交叉和渗透国际首例基因诊断1970年代末美籍华裔简悦威（Yuet Wai Kan）分子杂交技术，α地中海贫血、镰状红细胞贫血我国基因诊断里程碑1984年，上海市儿童医院曾溢滔点杂交技术，α地中海贫血，发表在《Lancet》•以基因突变位点 (导致单基因遗传病) 为靶标第一代•核心技术：DNA或RNA分子杂交技术•以基因组特异性核酸序列 (DNA、RNA) 为靶标第二代•核心技术：Sanger测序技术、PCR技术•以基因组特异性核酸序列、蛋白质分子为靶标第三代•核心技术：生物芯片技术(高通量)•以基因组特异性核酸序列、蛋白质分子、代谢物为靶标第四代•核心技术：新一代测序技术、质谱技术分子诊断生物标志物◆核酸序列信息•个体差异基因：微卫星、SNP、mtDNA等•病原体基因组：病毒、细菌、真菌等•基因转录水平：mRNA、microRNA、lncRNA、circRNA、cfRNA等◆核酸序列变化•染色体变异：T21、T18、T13、CNV等•基因突变：点突变、插入/缺失突变、倒位突变、重复突变等◆核酸修饰•DNA甲基化•RNA甲基化◆蛋白质表达水平、修饰◆代谢产物、多糖链和脂质分子分子诊断学任务、特点、辨别◆任务•利用基础医学和生命科学的理论和方法，研究疾病发生和发展的分子机制•确定在疾病过程中特异的分子标志物•建立分子标志物的临床检验方法和评价体系•建立分子生物学检验的质量控制◆特点•主要是直接以疾病基因为探查对象，属于病因学诊断•对基因的检测结果不仅具有描述性，更具有准确性•可准确诊断疾病的基因型变异、基因表型异常以及由外源性基因侵入引起的疾病◆辨别•临床分子生物学检验技术=临床分子诊断技术•分子诊断VS基因诊断•分子诊断学包括：核酸诊断（DNA/RNA）、蛋白质检测诊断等分子诊断学概论一、分子诊断的基本概念与历史发展二、分子诊断的现状三、分子诊断的主要技术四、分子诊断的标准化与质量控制五、分子诊断的未来趋势医疗机构临床检验项目（2013版）临床体液、血液专业临床化学检验专业临床免疫、血清学专业临床微生物学专业临床细胞分子遗传学专业哪些专业含有基因诊断项目？临床免疫、血清学专业（摘录）序号项目名称1甲型肝炎病毒(HAV)RNA检测2乙型肝炎病毒(HBV)DNA测定3乙型肝炎病毒(HBV) YMDD变异检测4乙型肝炎病毒(HBV)前核心变异检测5乙型肝炎病毒(HBV)核心变异检测6乙型肝炎病毒(HBV)基因分型测定7丙型肝炎病毒(HCV)RNA测定8丙型肝炎病毒(HCV)分型9丁型肝炎病毒(HDV)RNA测定10庚型肝炎病毒核糖核酸定性(HGV-RNA)测定11戊型肝炎病毒(HEV)RNA测定12弓形体核酸测定13风疹病毒RNA测定14巨细胞病毒(CMV)DNA测定15水痘—带状疱疹病毒核酸测定16人乳头瘤病毒(HPV)基因检测17呼吸道合胞病毒核酸测定18流行性出血热病毒核酸测定19EB病毒核酸测定20副流感病毒核酸测定21人轮状病毒核酸测定22狂犬病毒核酸测定23乙型脑炎病毒核酸测定序号项目名称26柯萨奇病毒核酸测定27森林脑炎病毒(TBE)核酸测定28甲型流感病毒核酸测定29乙型流感病毒核酸测定30SARS冠状病毒核酸测定31BK病毒核酸测定32禽流感病毒核酸测定33埃可病毒核酸测定34西尼罗河病毒核酸测定35斑疹伤寒杆菌核酸测定36布氏杆菌核酸测定37结核分枝杆菌核酸测定38脑膜炎奈瑟菌核酸测定39幽门螺杆菌核酸测定40淋球菌核酸测定41嗜肺军团菌核酸测定42肺炎支原体核酸测定43生殖道支原体核酸测定44解脲脲原体核酸测定45肺炎衣原体核酸测定46鹦鹉热衣原体核酸测定47沙眼衣原体核酸测定48立克次体核酸测定临床细胞分子遗传学专业（摘录）序号项目名称备注1利用Southern blot分子杂交技术的白血病融合基因检查包括血友病A、血友病B、血菅性血友病、其它凝血因子缺陷症基因分析2利用Southern blot分子杂交技术的白血病融合基因检查1、 Ph染色体的分子杂交检查2、 RARA基因的分子杂交检查3、 AML1基因的分子杂交检查4、 E2A基因的分子杂交检查5、 MLL基因的分子杂交检查3利用RT-PCR或real time PCR技术的白血病融合基因检查1、Bcr-abl融合基因检查2、 AML1－EVI1融合基因检查3、 PML-RARA融合基因检查4、 DEK－CAN融合基因检查5、 AML1-MTG8融合基因检查6、 E2A－PBX1融合基因检查4单基因遗传病基因突变检查包括:1、进行性肌营养不良基因突变检查2、遗传性舞蹈病的基因突变检查3、其它5遗传性凝血因子缺陷症基因突变包括：1、血友病A的基因突变检查2、血友病B的基因突变检查3、混合型血友病的基因突变检查6α地中海贫血的基因突变检查7β地中海贫血的基因突变检查8苯丙酮尿症的基因突变检查9HLA低分辨基因分型检查10HLA高分辨基因分型检查序号项目名称备注12SRY的基因检查13P53基因的基因突变检查14K-Ras基因的基因突变检查15视网膜母细胞瘤RB1基因的基因突变检查16家族性乳腺癌基因的基因突变检查包括：1、BRCA1基因的基因突变检查2、BRCA2基因的基因突变检查3、其它17多发性内分泌腺瘤RET基因的基因突变的检查18遗传性非息肉性大肠癌的基因突变检查1、hMLH1基因的基因突变检查2、hMSH2基因的基因突变检查3、PMS1基因的基因突变检查4、PMS2基因的基因突变检查19遗传性大肠癌微卫星不稳定性(MSI)的基因检测20大肠癌易感基因的基因检测1、APC基因的基因检测2、DCC基因的基因检测21用于病毒、细菌用药指导的基因检测1、拉米夫定用药指导的基因检测2、结核病用药指导的基因检测3、肠球菌耐万古霉素用药指导的基因检测22用于化学药物用药指导的基因检测1、硝酸甘油用药指导的基因检测2、5-氟尿嘧啶用药指导的基因检测P450家族代谢酶基因的基包括CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、全国医疗服务项目技术规范（2023年版）◆检验+病理诊断项目合计1818项，增加了近60%，成为了11个大类中新增比例最高的板块实验室自建检测项目 (LDT)2022年12月《国家药监局综合司国家卫生健康委办公厅关于开展医疗机构自行研制使用体外诊断试剂试点工作的通知》，试点医疗机构包括：北京协和医院、北京医院、中日友好医院、中肿、阜外医院、北大一院等6家医院LDT（Laboratory developed test，实验室自建检测项目）感染领域：临床病原体检测方法微生物学检测：病原体培养/涂片病原体颗粒检测免疫学检测：检测血清学标志Ag、Ab分子诊断：检测DNA/RNA•耗时长•阳性率低•难培养•简便、快速•适于大规模筛查•可定性/定量检测•存在“窗口期”问题•不能早期诊断•灵敏度较低•快速、高通量•灵敏、特异•早期（缩短窗口期）•可分型•检测病原体突变•检测耐药基因•治疗监测病原体分子诊断检测病原体是否存在病原体分型（包括亚型）耐药基因检测相关的人类基因多态性检测标本类型外周血有核细胞血清血浆组织器官体液分泌物排泄物适宜分子诊断病原体类型难培养的如CT 、MG 、病毒培养较慢的如TB镜检容易弄错的如NG 、阴道毛滴虫免疫交叉反应较多的如CT 需要分型的如HPV 、HSV胞内病原体如衣原体、支原体、病毒CT （Chlamydia trachomatis ，沙眼衣原体）MG （Mycoplasma genitalium ，生殖支原体）TB （Mycobacterium tuberculosis ，结核分枝杆菌）NG （Neisseria Gonorrhoeae ，淋病奈瑟菌）HPV （human papillomavirus ，人乳头瘤病毒）遗传领域：镰状红细胞贫血症◆红血球不正常带来严重后果，问题在于血红蛋白ß链一个谷氨酸残基变成了缬氨酸残基◆常染色体隐性遗传病•基因点突变•Mst II 限制性内切酶位点改变•RFLP技术：酶切+电泳胚胎着床前分子诊断◆取1-2个囊胚期细胞进行基因诊断，从而将人类的遗传缺陷控制在最早期阶段无创产前诊断（NIPT ）19972008卢煜明发现母体外周血中存在胎儿游离DNA高通量测序分析胎儿游离DNA 用于唐氏综合征筛查2009中国开始NIPT 临床试验2011中国、美国开始NIPT 临床服务2012美国妇产科协会推荐高危人群进行NIPT 201520172016中国无创单病开始临床应用卫计委推出NIPT 临床应用指南美国多种单基因疾病NIPT 临床服务2022美国妇产科协会推荐全人群进行NIPT国家药监局发布NIPT 注册指南◆胎儿游离DNA ◆高通量测序肿瘤领域：肿瘤靶向治疗◆高通量测序为主循环肿瘤DNA（ctDNA）年份事件1948血中游离DNA的发现1965肿瘤与血中游离DNA的相关性1966-1973系统性红斑狼疮等疾病患者血中游离DNA水平增高1977血中游离DNA水平与肿瘤病程及疗效相关1989发现血中游离DNA与原发肿瘤突变相似1994-1999更多证据表明血中游离DNA与原发肿瘤基因突变的一致性1997孕妇血中胎儿DNA的发现1998移植器官核酸可称为游离核酸成分的发现2000-2010游离DNA与多种疾病的诊断和预后相关2010游离DNA致癌性的确定ctDNADNA文库构建捕获扩增DNA&质控富集效率高通量测序和数据分析个体化用药领域：药物基因组药物作用靶点相关基因药物代谢相关基因药物副作用相关基因药物相关基因◆P53：50%以上人类肿瘤会发生p53基因突变◆BRCA1和BRCA2：乳腺癌易感基因1和2◆EGFR：表皮生长因子受体，细胞增殖和信号传导功能◆细胞色素P450超家族：人体内最大的药物代谢系统分子诊断学概论一、分子诊断的基本概念与历史发展二、分子诊断的现状三、分子诊断的主要技术四、分子诊断的标准化与质量控制五、分子诊断的未来趋势DNA->RNA->蛋白质->代谢产物◆基因(产物) 修饰•甲基化•乙酰化•磷酸化◆代谢及代谢调控分子诊断主要技术1. 分子杂交技术•遗传性疾病的基因诊断2. PCR技术•感染性疾病的基因诊断3. 生物芯片技术•复杂性疾病的基因诊断4. 基因测序技术•复杂性疾病的基因诊断5. 质谱技术•核酸质谱、蛋白质组学6. 人工智能辅助•AI辅助的分子诊断（AI+）1. 分子杂交技术杂交类型检测目的及范围Southern印迹杂交经凝胶电泳分离且转移至膜上，DNA分子Northern印迹杂交经凝胶电泳分离且转移至膜上，RNA分子菌落杂交固定在膜上，经裂解从细菌释放，DNA分子斑点杂交固定在膜上，DNA或RNA分子原位杂交（FISH）细胞或组织中，DNA或RNA分子液相分子杂交在溶液中，DNA或RNA分子，引入磁珠2. PCR技术◆痕量核酸模板体外扩增，提高了检测灵敏度和反应特异性•1971年，Korana提出核酸体外扩增的设想•1985年，Mullis发明聚合酶链反应，Klenow片段•1988年，Keohanog，T4DNA聚合酶•1988年，Saiki，TaqDNA聚合酶•1993年，Mullis因聚合酶链反应技术获得诺贝尔奖荧光定量PCR 技术◆也称为real-time PCR ，实现了核酸的实时定量检测◆Log 浓度与循环数呈线性关系，根据达到阈值的循环数计算样品所含模板量•荧光染料：SYBR green•荧光探针：Taqman 、molecular beacon 、复合探针•举例：新冠病毒检测荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---Ct 循环数标准曲线10410310610510210数字PCR技术◆dPCR，又称为单分子PCR，近年来迅速发展起来的绝对定量PCR技术◆不依赖于扩增曲线的循环阈值进行定量，不受扩增效率的影响，也不必采用看家基因和标准曲线，具有很好的准确度和重现性，可以实现绝对定量分析3. 生物芯片技术◆广义指在微小空间中能够高通量处理或分析生物相关物质的集成式技术◆狭义指微阵列芯片技术，将大量基因探针／基因片段／蛋白／多肽，按特定的排列方式固定在支持物表面上，实现高通量处理或分析功能•固相芯片（玻片、硅片、塑料等）、液相芯片（微珠）•特点：高通量、微型化、自动化微流控芯片技术◆Microfluidics 技术，指的是使用微管道（尺寸为数十到数百微米）处理或操纵微小流体（体积为微升到纳升）的系统所涉及的科学和技术，是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科◆也被称为芯片实验室（lab on a chip ）和微全分析系统（micro-total analytical system ），具有微型化、集成化等特征优势集成小型化与自动化样本量需求少试剂消耗少高通量污染少不足缺规范与标准技术难度不低生产成本较高开发周期较长4. 基因测序技术◆核酸测序技术，是分子诊断中基因序列确定的金标准ABI Prism310 1986年Roche 4542005年Illumina GA2006年ABI SOLiD2007年Helicos HeliScope2008年PacBio RS2010年ONT MinION2013年第一代（Sanger）第二代（NGS）第三代第四代或合称第三代（TGS）Sanger测序和NGS测序双脱氧末端终止法可逆终止、边合成边测序法单分子测序技术◆SMRT单分子实时合成测序技术，零模波导孔，荧光◆纳米孔单分子测序技术，纳米孔，电信号5. 质谱技术质量分析器离子源检测器多肽离子化 真空环境获得质谱图进样系统引入样品根据荷质比分离离子 检测记录离子信号计算机数据处理系统◆离子源•电子电离•快原子轰击离子化（FAB)•电喷雾离子化（ESI ）•基质辅助激光解析离子化（MALDI)◆质量分析器•四极杆质谱（直流电极+射频电极，共4组）•飞行时间质谱（TOF)•离子阱质谱◆离子源与质量分析器组合•MAIDL-TOF-MS （基质辅助激光解析电离飞行时间质谱）•ESI-四极杆MS •ESI-串联MS6. AI辅助分子诊断◆AI+自动化流水线（包含分子诊断）•打通从标本到检验到临床的数据通路•及时准确地将“标本信息”转化为“检验数据”•再将“检验数据”转化为“临床诊疗信息”•大幅提高实验室咨询服务能力•医学检验工作向着更精准、高效的方向发展分子诊断学概论一、分子诊断的基本概念与历史发展二、分子诊断的现状三、分子诊断的主要技术四、分子诊断的标准化与质量控制五、分子诊断的未来趋势临床分子诊断方法性能评价◆定量检测方法和程序的分析性能验证内容，至少应包括准确度、精密度、可报告范围等◆定性检测项目验证内容，至少应包括检出限及符合率等，验证结果应经过授权人审核分子诊断存在的问题及原因◆假阳性问题◆假阴性问题◆重复性问题•同一实验室不同批次间重复测定，结果存在差异•不同实验室对同一标本检测，结果存在差异◆检测对象的多态性◆标本采集◆诊断试剂方法•准确性•特异性•检测限•检测范围•重复性•稳定性◆微量反应体系◆测定操作 (人员素质)◆仪器设备的维护校准 (定期)◆数据处理及结果报告个体差异样本量差异检测平台差异样本采集差异样本保存、运输差异分子诊断技术监管◆申请获批医疗器械证，有严格的管理•项目报批：卫健委批准•实验室：通过验收，定期校验仪器与器材•试剂：国家食品药品监督管理局（NMPA）批准•工作人员：经过培训，持证上岗•质量控制：室内质量控制（IQC），室间质量评价（ EQA）◆LDT？国内正在摸索监管➢推荐“微专业-体外诊断与大数据分析”，《体外诊断产品注册与监管》，由项光新、李伟、连国军等老师授课国家如何监管医疗器械NMPA产品上市许可制度企业医疗器械生产企业许可国家机构法规生产质量管理规范规范性文件法律规章法规不良事件检测和报告医疗器械召回稽查局、法规司省和县级药监器械司、注册司质量监督机构技术审评机构分子诊断学概论一、分子诊断的基本概念与历史发展二、分子诊断的现状三、分子诊断的主要技术四、分子诊断的标准化与质量控制五、分子诊断的未来趋势将成为本世纪检验医学的主导技术◆应用面更广：扩展到复杂性疾病，检测未知病原体◆使用更便捷：自动化、智能化、普及化◆诊断更准确：致病根源、致病机制，定性->定量◆诊断更早期：早发现、早治疗，诊已病->诊未病•病原体的确认和定量、分型、耐药性检测1. 感染性疾病分子诊断•对遗传病进行确诊、分型和早期诊断2. 遗传病分子诊断•肿瘤的早期诊断、分型和伴随诊断3. 肿瘤分子诊断•药物基因组学、用药指导4. 个体化用药指导•公共卫生、器官移植、个体识别、基因治疗5. 其他领域美国《2030年全球趋势》未来分子诊断学的准确性将促使医疗体系变革基因检测方法将加速疾病诊断，同时帮助医师确定个性化最佳治疗方案感染领域：病原体检测⚫国内总体：年均非新冠的标本量约为1亿例⚫常规感染样本量：约为9000万例/年⚫危重感染样本量：约为1000万例/年，多数病原不明WHO 公布2019年全球十大健康威胁，与感染密切相关有6个：流感、耐药、埃博拉、登革热、艾滋病、疫苗犹豫临床宏基因组测序遗传领域：人类基因组临床应用Collins, FS & McKusick VA. Implications of the Human Genome Project for medical science. JAMA, 2001, 285: 540-554.单基因病无创产前筛查◆利用母体外周血中的胎儿游离DNA 的进行分子生物学检验，开展无创性性产前诊断，取代羊膜穿刺或采集绒毛进行无创性产前诊断方法8000病种多1%发病率高20%致死率高治疗方式少1%努南综合征1:2500 -1:1000Rett综合征（女性）1:23000 -1:10000Kabuki 综合征1:32000致死性骨发育不良1:10000-1:5000CHARGE 综合征1:15000 -1:8500软骨发育不全1:10000结节性硬化1:5,800马凡综合征1:10000 -1:5000单基因病占总出生缺陷的22.2%（染色体10%）复杂性疾病诊断。
分子诊断学`1
分子诊断学：以分子生物学理论为基础，利用分子生物学技术和方法研究人体内/外源性生物大分子体系的存在、结构或表达调控变化，为疾病的预防诊断治疗和转归提供信息和依据。
断裂基因：指基因的内部存在间隔区，间隔区的DNA序列与该基因所决定的蛋白质没有关系。
间隔区又称为内含子。
出现在成熟RNA中的有效区段称为外显子。
SNP：是指单个核苷酸变异而形成的DNA 分子多态性。
根据SNP在基因组中的位置，可分为编码区SNP（cSNP）、基因周边区SNP（pSNP）、基因间SNP（iSNP）。
转座因子/可转座元件：能在基因组中从一个位点移至另一个位点的DNA序列。
克隆：细胞通过无性繁殖所产生的与亲代细胞完全相同的子代群体称克隆。
分子克隆：将某一特定的DNA片段通过重组DNA技术插入到一个载体中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片段的“群体”。
基因工程：将基因进行克隆，并利用克隆的基因在受体细胞内复制、转录和翻译表达，制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造细胞和个体的特性所用的方法及相关工作。
载体：是携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具，本质为DNA。
克隆载体：能将目的基因在受体细胞中复制扩增并产生大量目的基因的载体。
表达载体：能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体。
穿梭载体：能够在两类不同宿主中复制、扩增和选择的载体。
转染：将噬菌体、病毒或以他们为载体的DNA重组体导入真核细胞的过程转化：将重组的DNA 分子引入细菌（原核细胞），使其在细菌体内扩增及表达的过程。
DNA复性：当变性因素解除后，两条DNA链又可通过碱基互补配对形成DNA双螺旋结构。
核酸探针：能与特定靶基因序列发生特异性互补结合，并可用特殊方法检测的被标记的已知核苷酸序列。
核酸变性：指维系核酸双链互补碱基对之间的氢键断裂变成单链的过程荧光阈值：指设定在荧光扩增曲线上处于荧光信号指数扩增阶段时的任意一个值。
一文了解分子诊断常用技术
一文了解分子诊断常用技术随着分子生物学和分子遗传学的发展，越来越多的分子诊断学技术应用于疾病的诊断，彻底打破常规的诊断方式，不再以疾病的表型为主要依据推测疾病的发生发展及相关机制。
分子诊断学技术，通过检测遗传物质的结构或表达水平，不但发现了疾病与特定基因存在、转录及表达有关，而且个体基因多态性与疾病特定用药密切相关。
下面让我们深入了解一下分子诊断以及常用技术。
一、什么是分子诊断分子诊断（Molecular diagnosis）是指应用分子生物学方法检测生物体内遗传物质（DNA/RNA）的结构或表达水平的变化而做出诊断的技术，也可称为基因诊断（Gene diagnosis)。
狭义上的分子诊断主要是指核酸诊断，即对病人个体DNA或RNA样本的病原性突变的检测，根据这些依据对疾病做出诊断，涉及分子生物学中的多种高尖端技术，如PCR、分子杂交、生物芯片等；广义上的分子诊断则包括基因治疗、生物治疗以及分子靶向治疗。
在临床上，分子诊断最早只应用于器官移植分子配型和传染病诊断领域。
随着技术不断进步，其应用领域持续扩大，分子诊断逐步应用于遗传病和肿瘤的早期筛查、诊断。
以后分子诊断将进一步扩大应用领域，适用于人类基因库的建立和大规模人群疾病筛查。
原理是应用分子生物学方法，检测病人的DNA、RNA或蛋白质的检测，再根据检测结果对疾病做出诊断。
二、分子诊断特点与传统诊断方法相比，分子诊断技术具有以下特点：（1）提高了准确性、精确性、灵敏度和特异性。
（2）与传统方法相比诊断时间早，可以做到早期诊断。
（3）所需样本量少。
（4）产前诊断和个体化治疗。
三、分子诊断技术及应用场景分子诊断领域主要包括PCR(qPCR 和 dPCR)、二代测序技术（NGS)、荧光原位杂交（FISH）和基因芯片等。
（1）PCR：原理：DNA在高温下形成单链，低温下按照碱基互补配对原则生成双链。
优缺点：灵敏度高、特异性强、简便快捷，但检测位点单一，仅能检测已知突变。
分子诊断重点
1、基因——DNA分子中含有特定遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。
合成有功能的多肽链或RNA所必需的全部核酸序列（通常是DNA序列）。
2、基因组：广义：一物种的全部遗传物质及其携带的遗传信息。
狭义：单倍体细胞中的全套染色体（人：22条常染色体+ X，Y + 线粒体DNA）3、断裂基因：基因的编码序列在DNA上不是连续的，而是被不编码的序列隔开。
4、重叠基因：基因组DNA中某些序列被两个或两个以上的基因所共用。
基因重叠现象在病毒基因组中普遍存在。
5、跳跃基因：即转座子，在哺乳动物体内一般含有几十万个跳跃基因DNA；6、基因家族指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的一组基因7、假基因（pseudogene): 在多基因家族中有的成员并不能表达出有功能的产物，用ψ表示。
8、SNP：单核苷酸多态性指单个核苷酸变异而形成的DNA分子多态9、质粒：细菌细胞染色体以外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子10、转座因子又称转座元件（transposable element），是一类在细菌染色体、质粒或噬菌体之间自行移动并具有转位特性的独立的DNA序列11、微卫星：广泛分布在原核和真核生物基因组中，常出现在基因的非编码区和染色体末端，重复序列长度仅为1—6bp，呈串联重复排列。
12、黏性末端:对于双链DNA病毒而言，基因组双链两端具有能够互补的单链DNA部分，称为粘性末端13、原核生物基因组的特点1.原核生物基因组：DNA原核生物基因组DNA较小,基因数目较少原核生物基因组中只有一个DNA复制起点;2原核生物的操纵子结构;操纵子结构是原核生物基因组的功能单位, 原核生物的结构基因大多数按功能相关性成簇地串联排列于染色体上;3.原核生物的结构基因多数是单拷贝基因，只有编码rRNA和tRNA的基因有多个拷贝;4原核生物结构基因的编码顺序一般不重叠;5.具有编码同工酶的不同基因6.GC含量差异大7.非编码区内主要是一些调控序列;8.具有可移动的DNA序列第三章分子克隆1、分子克隆：按照人的意愿，在体外将制备的DNA片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝，此过程称为分子克隆，也称基因克隆或DNA克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。
分子诊断资料
分子诊断学复习资料1.分子诊断学:是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法来研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、诊断、治疗和转归提供信息和依据。
①主要特点：属于病因学诊断；灵敏度高，便于早期诊断及疾病预防；以基因分析为基础，特异性高。
③主要应用：感染性疾病、遗传性疾病、肿瘤的分子诊断，个体化医疗，其他如耐药性、疗效监测，多基因疾病 .2.真核生物的DNA复制方式：半保留复制，双向复制，半不连续复制。
3.外显子：指编码序列，DNA分子编码mRNA某一部分序列的基因。
4.内含子：位于编码序列之间，通常指基因中能被转录呈前体转录物，但却不能成为mRNA 组成部分的区域。
5.密码子：从mRNA编码区5’到3’端每三个相邻碱基一组连续分组，每组碱基构成一个遗传密码，称为密码子。
6.终止密码：UAA,UAG,UGA 起始密码：AUG7.开放阅读框架：ORF:指从AUG开始到终止密码子处的正确可读序列。
8.启动子：指RNA聚合酶识别、结合和启动转录的一段DNA序列，具有方向性。
9.终止子：DNA上与转录终止有关的序列。
10.增强子：能使与其临近的基因转录频率明显增加的DNA序列。
11.基因（gene）：是有功能的DNA片段，含有合成有功能蛋白质多肽链或RNA所必学的全部核苷酸序列，是遗传的结构和功能单位。
分为结构基因和调控基因。
12.基因组（genome）：生物体全套的遗传信息。
13.C值：一个物种的单倍体基因组的DNA总量。
14.C值矛盾：又称C值悖论，生物的进化程度与基因组大小不完全成比例的现象15.真核生物基因组特征：①核基因组由染色体DNA组成，分子量较大，结构复杂，与蛋白质结合②基因多数为断裂基因，有内含子结构③大量重复序列④单顺反子，基因家族。
16.人类基因组计划（HGP）：旨在测出人类基因组30亿碱基对的核苷酸序列，发现所有人类基因并确定它们在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息，发展基因组学新技术，探讨人类基因组研究的社会法律与伦理等问题的一个国际性研究项目。
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分子诊断知识点1、基因（gene）是含有生物信息的DNA 功能片段，根据这些生物信息可以编码具有生物功能的产物，包括RNA 和蛋白质（多数）.2、基因组genome, 指细胞或生物体一套完整的遗传物质，包括所有基因和基因间的区域（序列）。
3、基因组学genomics 以基因组为研究对象的一门学科，包括基因组作图、基因组测序、基因定位、基因功能分析4、结构基因：编码RNA 或蛋白质的核苷酸序列5、基因表达：DNA 携带遗传信息通过转录传递给RNA，mRNA 通过翻译将基因的遗传信息在细胞内合成具有生物功能的各种蛋白质的过程6、C 值基因组DNA 全部碱基（对）数。
C 值是物种的一个重要特性常数。
C 值矛盾，C 值悖论：生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象7、N 值矛盾，N 值悖论：基因组中的基因数目与生物进化程度或复杂程度的不对称性8、必需基因（致死基因）关系到生物体存活的基因。
可通过基因突变实验确定必需基因。
：9、原核生物基因组1、细菌、支原体、立克次体、衣原体、螺旋体、放线菌、蓝绿藻等10、重叠基因:是指两个或两个以上的基因共有一段DNA 序列，或是指一段DNA 序列为两个或两个以上基因的组成部分。
11、操纵子：由一组功能相关的结构基因连同其上游调控序列共同组成一个转录单位12、质粒的分类致育质粒F 质粒）编码性菌毛，介导细菌之间的接合传递；耐药性质粒R 质粒）编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性；毒力质粒Vi 质粒）编码与该菌致病性有关的毒力因子；细菌素质粒编码细菌产生细菌素；代谢质粒编码产生相关的代谢酶。
13、严紧控制型拷贝数少，一般<10 个，分子量大；调节因子是蛋白质，复制受限，受染色体DNA 复制系统的控制；严谨控制机理（低拷贝原因），认为是该质粒可以产生阻遏蛋白，反馈抑制自身DNA 合成。
松弛控制型拷贝数多，10-200 个，分子量小；调节因子是RNA，复制不受染色体DNA 复制系统限制基因工程使用松弛型（高拷贝数）质粒，以获得较多的基因产物。
14、质粒性质1、质粒的转移：可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个细菌细胞中，使两个细胞都成为带有质粒的细胞；质粒转移时，它可以单独转移，也可以携带着染色体（片段）一起进行转移，所以它可成为基因工程的载体。
2、质粒具有选择性标记：质粒有抗药性基因、营养缺陷型基因、抗重金属盐基因等多种选择性标记3、质粒的不相容性：质粒已成为分子克隆的有用工具，是目的DNA 的载体。
载体质粒大多是在天然质粒基础上经人工构建而成，15、质粒特点：1、有限制性核酸内切酶单一切口，可用以重组外源DNA；2、有筛选标记，如抗药基因等；3、插入外源DNA 后，仍能转化宿主细胞，并能复制。
16、质粒基因转移的方式1.接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DN 从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA 转移称为接合作用 2.转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用3、转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA 转移及基因重组即为转导作用4、转染作用通过感染方式将外来DNA 引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection) 。
转染是转化的一种特殊形式。
17、完整的病毒颗粒包括：衣壳、基因组（DNA 或RNA）、被膜、病毒颗粒中的其他内容物18、病毒分段基因组：流感病毒属分段RNA 病毒：意义：a）降低包装压力b）降低了造成断裂的可能性，提高编码能力c) 有分段基因组的病毒一般感染效率较低，只有全部基因组核酸片段存在时，病毒才具有感染能力。
植物病毒d) 由于分段基因组易发生重组，故病毒容易变异。
19、病毒基因组特点：1、有特殊的末端序列：粘性末段、反向互补序列、长末端重复序列、帽和尾结构等；2、结构紧密，体现在不仅非编码序列少，而且有重叠基因的存在；真核生物20、染色体的包装：（1）染色体的一级结构—核小体（2）染色体的二级结构—螺线管3）染色体的三级结构—超螺线管（4）染色体的四级结构—染色单体21、真核生物染色体基因组一般特征1、真核生物的基因组比较庞大；2、线性双链DNA 和二倍体；3、真核细胞基因转录产物为单顺反子。
4、存在重复序列，重复次数可达百万次以上5、基因是不连续的（断裂基因）22、单顺反子：一个结构基因经过转录生成一个mRNA 分子，再翻译生成一种蛋白质；23、重复序列：指多拷贝的相同或近似序列的DNA 片段高度重复序列：按其结构特点分为三种：1、反向重复序列2、卫星DNA 由于这类序列的碱基组成不同于其他部份，可用等密度梯度离心法将其与主体DNA 分开，因而称为卫星DNA （或随体DNA）3、较复杂的重复单位组成的重复顺序中度重复顺序：依据重复顺序的长度，中度重复顺序可分为：短散布元件和长散布元件Alu 家族是哺乳动物基因组中含量最丰富的一种中度重复顺序家族（短分散元件），Alu 家族每个成员的长度约300bp ，每个单位长度中有一个限制性内切酶AluⅠ的切点（AG↓CT），Alu 可将其切成长130 和170bp 的两段，因而定名为Alu 序列（或Alu 家族）24、断裂基因（split gene）：真核生物的结构基因，由若干个编码区和非编码区相间隔但又连续镶嵌而成，为一连续的氨基酸组成的完整的蛋白质编码，或为具有特殊功能的tRNA 或rRNA 编码，因此称为断裂基因。
并非真核生物所有的结构基因均为splitting gene 例：组蛋白基因家族、干扰素、酵母中多数基因25、线粒体DNA 的遗传特性：母系遗传、突变率高、异质性、阈值效应、半自助复制与协同效应26、阈值效应：mtDNA 突变导致氧化磷酸化水平降低，当突变的mtDNA 达到一定比例时，使得线粒体总的能量供应降低到维持组织正常功能所需能量的最低值时，才可能引起某组织或器官的功能异常而出现临床症状。
27、DNA 分子多态性的主要方式：微卫星DNA 多态性（同一位点不同个体之间有不同长度的微卫星DNA）、单个核苷酸的变异—单核苷酸多态性（SNP）等28、STR 结构：微卫星DNA 又称短串联重复STR，指以1－6 个碱基为核心单位串联重复而成的一类序列。
微卫星DNA 结构序列由中间的核心区（重复序列）和外围的侧翼区（非重复序列）组成，其核心序列为1～6bp，为高度重复序列。
成因：1.姊妹染色单体的不均等交换 2.复制滑移29、SNP：SNP 是基因组中散在的单个核苷酸的变异形成的一种DNA 分子多态性位置：编码区SNP cSNP）、基因周边区SNP pSNP ）基因间SNP iSNP ）SNP 非编、码区：SNP 编码区= 5：1 成因：单个核苷酸（碱基）置换：转换：嘧啶—嘧啶，嘌呤—嘌呤；颠换：嘧啶—嘌呤,嘌呤—嘧啶转换：颠换=3：1。
蛋白质组1、蛋白质组：生物体的全套蛋白质；或一个生命单位的全套蛋白质2、蛋白质组特性：与基因组相比，蛋白质组有高度动态性：有组织特异性、生长发育特异性、生理病理状态特异性。
3、研究的必要性：1、蛋白质的数量比基因的数量多（转录、翻译、翻译后水平的调控）2、基因组是静态的，蛋白质组是动态的3、蛋白质之间及其与其它各种大、小分子之间的广泛作用形成的犹如网络状的复杂系统。
4、蛋白质组学是研究生物体全套蛋白质的组成、结构与功能的科学5、蛋白质的分离：双向凝胶电泳及图像分析技术1、双向凝胶电泳2-DE：第一向的固相pH 梯度等电聚焦电泳IPG-IEF 第二向SDS-PAGE 组成的分离系统：电泳速度只与蛋白质分子质量有关。
原理：等电聚焦电泳:基于蛋白质等电点（pI）的差异进行分离；聚丙烯酰胺凝胶电泳:是根据蛋白质分子量（Mw）的不同进行分离6、质谱技术MS：（用于蛋白质的鉴定）是在高真空系统中样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比差异，以确定样品相对分子质量及分子结构的技术。
7、质谱：化合物分子受到电子流冲击后，形成的带正电荷分子离子及碎片离子，按照其质荷比大小依次排列而被记录下来的图谱，称为质谱。
8、质谱仪的组成：离子源、质量分析器、检测器核酸分子杂交1、核酸变性：在理化因素作用下，维系DNA 二级结构的氢键和碱基堆积力遭到破坏，DNA 双螺旋的两条互补链松散而分开成为单链，从而导致DNA 的理化性质及生物学性质发生改变2、核酸复性：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。
3、分子杂交：不同来源的核酸变性后，合并在一起，只要这些核酸分子含有可以形成碱基互补配对的序列，复性也会发生在不同来源的核酸链之间，形成杂化双链4、分子杂交技术：用标记的已知DNA 或RNA 片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来的技术。
待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA 和组织细胞的DNA、RNA。
5、核酸探针：指能与特定核酸序列发生特异性互补杂交，杂交后可用特殊方法检测的、带有标记的、并已知碱基序列的核酸片段。
6、原位杂交：以特定标记的已知序列的核酸分子作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其检测的方法7、寡核苷酸探针的特点及设计原则？特点: （1）根据需要来合成相应的核酸序列，避免了天然探针的缺点；（2）大多数寡核苷酸探针长度较短,一般为10~50bp,其序列复杂度低，所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短；（3）寡核苷酸探针尤其适合点突变的检测(短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm 值)；（4）探针的长度较短，特异性较低，杂交信号较弱。
设计原则: （1）探针长度：一般要求在10～50bp; （2）G／C 含量为40％～60％; （3）探针分子中应避免互补序列; （4）避免同一碱基连续出现，一般不能多于 4 个;（5）探针与非靶基因序列的同源性不能超过70％或8 个以上连续的碱基同源。
8、一个理想的探针标记物应具备的特性？1、灵敏度高2、标记物与探针结合后，应不影响杂交反应，尤其是杂交特异性、稳定性和Tm 值3、标记物对检测方法无干扰4、检测方法要灵敏、特异、稳定、简便5、标记物对环境污染小，对人体无损伤，价格低廉。
9、Southern 印迹杂交的基本步骤？其毛细管转膜的原理？Southern 印迹指将电泳分离的DNA 片段转移到一定的固相支持物上的过程。
基本步骤：1、基因组DNA 经限制酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳2、将含有DNA 片段的凝胶放入变性溶液使DNA 变性3、将固体支持物放在凝胶上，通过毛细管虹吸或电转移将脚上的DNA 片段转移到固体支持物上，转移过程中，各DNA 片段间的相对位置保持不变，然后通过加热使DNA 固定于膜上4、加入探针使之与膜上的DNA 杂交5、冲洗掉为杂交的探针，检测杂交信号10、毛细管虹吸印迹法其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl 和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA 片段垂直向上运动，凝胶中的DNA 片段移出凝胶而滞留在膜上11、原位杂交时组织和细胞应固定处理，理想固定液应具备哪些条件？1、保持组织细胞的形态2、对核酸无抽提，修饰与降解作用3、不改变核酸在组织细胞内的定位4、不阻碍核酸与探针的杂交过程5、对杂交信号无遮蔽作用6、理化性质稳定12、如何增强组织的通透性和核酸探针的穿透性？组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体，影响探针的穿透和杂交体的形成；去垢剂和蛋白酶K 去除核酸表面的蛋白质；控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻片上脱落分子克隆（也称基因克隆或DNA 克隆）：指按照人的意愿，在体外将制备的DNA 片段与载体DNA 重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA 分子的大量拷贝的技术。