基因表达调控

③ 协调表达
• 在一定机制控制下，功能相关的一组基因，无论 其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达。
（如人血红蛋白亚基因的表达）
四、基因表达调控
• 定义：基因开启或关闭以及基因表达的增强或减 弱所受到的严格控制。 • 基因控制点：转录起始（本质是控制RNA聚合酶 与启动子的识别和结合）。
基本调控要素1
第五、六章 基因表达调控
Regulation of Gene Expression
一、基因表达（gene expression）
• 即基因转录及翻译的过程，也是基因携带的遗 传信息表现为表型的过程（在细胞内合成有功能 意义的各种蛋白质或RNA）。
DNA
转录
mRNA tRNA rRNA
翻译
protein
miRNA作用的后果
① 植物：miRNA与靶基因mRNA序列完全匹 配：靶基因mRNA被切割、降解； ② 动物：miRNA与靶基因mRNA序列不完全互 补：靶基因mRNA翻译成蛋白质受到抑制， 但其稳定性不受影响。 比较灵活：一个miRNA可调控多个mRNA, 一个mRNA可被多个miRNA调节。
人Dicer酶结构域
• DEXHc：负责dsRNA 的解螺旋作用，区分miRNA 底物与 siRNA 底物并能与pre-miRNA 的环状结构结合； • DUF283(Domain of unknown function 283) ：确切功能尚 不清楚，可能与剪切活性有关； • PAZ(Piwi-Argonaute-Zwille) ：负责siRNA 和miRNA 前体 的识别和结合； • RNase Ⅲ (RNase Ⅲa and RNase Ⅲb) ：作为活性中心，负 责剪切dsRNA； • dsRBD(dsRNA-binding domain) ：辅助Dicer 完成对底物的 识别和结合。
siRNA
主要来源于转座子、转基因 或病毒的外源性转录基因 （外源、异常） 由长dsRNA经Dicer酶切割形 成
加工
ห้องสมุดไป่ตู้
Argonaute蛋白 存在形式 与靶mRNA配对 特异性 生物学功能 主要以单链形式存在 完全或不完全互补配对
各有不同的Ago蛋白 主要以双链形式存在 完全互补配对 较高，一个突变即引起RNAi沉 默效应的改变 参与机体的生长发育
原核生物——E. coli 乳糖操纵子调节机制
• 操纵子(operon)：功能相关的多个编码序列及其 上游的调控序列串联而成的一个转录协调单位。 • 多顺反子：功能相关的结构基因在同一调控 序列控制下转录生成的一个mRNA。
乳糖操纵子的基本组件及其作用
表达 阻遏蛋白
RNA聚合酶结合部位 β-半乳糖苷酶 阻遏蛋白结合部位 乳糖透过酶
因此，Dicer 酶、Ago 蛋白及20～25 nt 双链 RNAs 被认为是RNA 沉默的特征结构。
miRNA和siRNA经典沉默机制（不同点）
miRNA
来源 细胞内固有的且有目的表达的内源 性转录基因（内源、正常） 由RNA聚合酶Ⅱ催化生成primiRNA，经DCL1（植）/Drosha （动）切割为pre-miRNA，再由 DCL1（植）/Dicer（动）加工而成
CpG岛主要处于基因5’端调控区域。 启动子区域的 CpG 岛一般是非甲基化状态的， 其非甲基化状态对相关基因的转录是必须的。
DNA甲基化的意义
• DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、 DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改 变，从而调控基因表达。
DNA甲基化一般与基因沉默相关联； 非甲基化一般与基因的活化相关联； 而去甲基化往往与一个沉默基因的重新 激活相关联。
③ 协调调节
• 乳糖操纵子3个结构基因（Z、Y、A）的是否转录 ——受到cAMP-CAP（正性调节）和阻遏蛋白（负 性调节）的协调调节。
• 影响因素：生存环境中是否有E. coli 生长繁殖所 必需的葡萄糖、乳糖等营养物质。
没有乳糖
葡萄糖低 cAMP浓度高 CAP
RNA聚合酶
有乳糖
I
CAP
RNA聚合酶
葡萄糖高 cAMP浓度低
RNA聚合酶
mRNA
I
RNA聚合酶
五、表观遗传与基因表达调控
表观遗传（epigenetics）：
——指DNA序列不发生变化，但基因功能 却发生了可遗传的改变。
三个层面：
DNA修饰 ：DNA共价结合一个修饰基团，使 具有相同序列的等位基因处于不同的修饰状 态。如DNA甲基化。 蛋白修饰：通过对特殊蛋白修饰或改变蛋白的 构象实现对基因表达的调控。如组蛋白修饰。 非编码RNA调控：通过某些机制实现对基因转 录的调控，如RNA干扰等。
未甲基化的C会变成U
甲基化特异性PCR(MS-PCR)
甲基化特异性PCR(MS-PCR)
（二）RNA干扰(RNA interference, RNAi)
• 定义：指在进化过程中高度保守的、由双链RNA （double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA 高效特异性降解的现象。 • 属于转录后水平的基因沉默（ Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS）。 • RNAi是细胞内普遍存在的一种重要的表观遗传现象。
Dicer酶
• 一种核糖核酸内切酶，RNase III 家族成员、包 含多个功能结构域。 • 可特异识别、并以ATP依赖的方式逐步切割由 外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式 引入的双链RNA（dsRNA），形成小的short interfering RNAs（siRNAs）或microRNAs （miRNA），并将这些产物加载到RISC上。
三、基因表达的方式
① 组成性表达
• 管家基因 这类基因在一个生物个体的几乎所有细胞中均持 续、稳定表达，其表达水平受环境因素影响较小； 其产物对维持细胞基本生命活动是必需的。
② 诱导表达或阻遏表达
• • 光修复酶(photolyase)基因被300~600nm可见光激活表达； 胆固醇能抑制HMG-CoA还原酶基因表达。
与RNA干扰相关的小分子RNA
2. piRNA（Piwi-interactingRNA）：是近年来从 哺乳动物生殖细胞中分离得到的一类长度约为30nt 的非编码RNA；通过与Ago蛋白家族中的Piwi亚家 族成员相结合发挥调控作用。 ——主要在生殖细胞中表达，与生殖系统 DNA 完 整性、翻译过程、转座子转录和动物生育能力的 调节等有关。
RdRP（ RNA 依赖RNA 聚合酶）机制
• 在线虫的研究中发现， siRNA 是合成 dsRNA 的特 殊引物， 在RdRP作用下， 以靶mRNA 为模板合成 dsRNA 。 • 新生成的dsRNA 在Dicer 酶的作用下， 裂解产生新 的siRNA , 新生成的siRNA 又可进入上述循环。 • 大量集中的siRNA 可以形成RISC复合物， 这样可以 提高mRNA 降解的效率。
基因表达水平的变化
• 细菌基因组约4000个基因，人类基因组约2.5万 个基因，但在某一特定时期或生长阶段，基因 组中只有小部分基因处于表达状态，其余大多 数基因不表达或表达水平极低。 • 基因表达水平的高低不是固定不变的，会随时 间、环境而变化。
二、基因表达的特点
① 时间特异性（阶段特异性）
② 空间特异性（细胞或组织特异性） • 如胰岛素基因的表达
I P O Z Y
转录
A
mRNA 阻遏蛋白
别乳糖 β-半乳糖苷酶 乳糖透过酶 半乳糖苷乙酰转移酶
RNA聚合酶
② cAMP-CAP对乳糖操纵子的正性调节
+ + + + 转录 CAP
CAP CAP CAP CAP
无葡萄糖，cAMP浓度高时
CAP
有葡萄糖，cAMP浓度低时
cAMP-CAP减少，与CAP位点结合效率低，对转录的激活效应弱
SAM
SAH
DNA甲基转移 酶（DNMT）
胞嘧啶
5-甲基胞嘧啶
胞嘧啶甲基化反应
5mC
• 哺乳动物基因组中5mC占胞嘧啶总量的2%~7%， 约70%的5mC存在于CpG双核苷酸。
• CpG双核苷酸存在形式： 分散于DNA中； 高度聚集形成CpG岛（CpG islands）
CpG 频率
5’
Rb基因
3’
半乳糖苷乙酰转移酶 cAMP活化蛋白（CAP）结合位点
① 阻遏蛋白对乳糖操纵子的负性调节
I P O Z Y A
mRNA 转录不启动 阻遏蛋白
RNA聚合酶
无产物
但是，有诱导剂存在时：
生理诱导剂：乳糖
可与阻遏蛋白结合，使其变构失活而 与操纵序列O解聚，失去阻遏作用。
实验室常用诱导剂：异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)
与RNA干扰相关的小分子RNA
3. siRNA：病毒感染时产生的一类miRNA，通过 与Ago蛋白等结合形成RISC，抑制病毒复制。 ——有的转座子也可产生siRNA，作用是沉默转座 子。
miRNA与siRNA的区别
• miRNAs可内源性调控体内基因的表达； • siRNA是为了保护体内基因组不受病毒感染、转座子活
与RNA干扰相关的小分子RNA
1. 微RNA（microRNA, miRNA）：是一类由内源 基因编码的、长度约20~24个核苷酸的非编码单 链RNA 分子。 ——可通过序列配对，结合到靶基因mRNA上（特 别是mRNA的3’-UTR），促使靶基因mRNA被降解 或其翻译被抑制，从而参与转录后基因表达调控。 ——广泛存在于各种动植物（截止2014年，在动植 物及病毒中已发现的miRNA 分子有28645 个），参 与细胞生长、增殖、分化、凋亡、代谢等一系列重 要的生命过程。
Gisela Storz, Science, 296(5571):1263-1265, 2002.
RISC（RNA induced silencing complexes ）
• 即RNA诱导的沉默复合体 • 包含多个蛋白复合物，可将与之连接的siRNA 或miRNA定位到其靶点并抑制基因的表达。
（一）DNA甲基化(DNA methylation)
• 是目前研究最清楚、也是最重要的表观遗传 修饰形式。 • DNA甲基化：指生物体在DNA甲基转移酶 （DNMT）的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸（SAM） 为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上的过程。
最常见的DNA甲基化
主要是基因组 DNA 上的胞嘧啶第 5 位碳原子和甲基间的 共 价 结 合 ， 胞 嘧 啶 由 此 被 修 饰 为 5- 甲 基 胞 嘧 啶 (5methylcytosine，5mC)。
动或人工转基因等外源性因素影响。
miRNA与siRNA经典沉默机制（相同点）
① 结构：都在22 nt左右， 5’是磷酸，3’是羟基； ② 加工：都依赖Dicer酶（RNA沉默的钥匙）； ③ RISC的形成：都需要Argonaute 蛋白（RNA 沉默的核 心）； ④ 作用方式：可阻遏靶基因mRNA翻译，也可导致mRNA 降解； ⑤ 进化关系：（可能的推论）siRNA是miRNA的补充， miRNA在进化过程中代替了siRNA。
• 顺式作用元件（cis-acting element）：是基因序 列的一部分，是RNA聚合酶或转录因子在DNA上 的结合位点，如启动子、终止子、增强子、沉默 子等。
基本调控要素2
• 反式作用因子（trans-acting factor）：是调控基 因（或称反式作用元件）的表达产物，本质是蛋 白质（即转录因子）和RNA（即调控RNA），以 转录因子为主。功能是调控基因表达。 • 反式作用因子的功能：通常以特定的方式识别并 结合在顺式作用元件上，实施精确的基因表达调 控。 • 真核生物有些调节蛋白不能直接与DNA相互作用， 而是先形成蛋白质-蛋白质复合物，然后再与 DNA结合参与基因表达调控。
Dicer酶的作用机制
• 第一步：Dicer结合到dsRNA，dsRNA被加工成许多短片 段，每个片段约22nt。 • 第二步：Dicer通过PAZ与含有PAZ的Argonaute蛋白结合， 而RNase与后者形成多个亚单元的复合物，这样使得22nt siRNA 特异性的决定靶基因的降解反应。这个22nt siRNA被称为引导RNA，它可以将多单元复合物引到靶 基因mRNA处。因为有引导siRNA在起作用，所以只要 有少量的dsRNA就可以引发大量的切割mRNA反应。