蛋白质纯化仪的使用 (1)
DuoFlow 层析系统简明使用教程
鼠标点击该按钮，切换到 Local 位置，分别按 maximizer 上的按钮选择 A1，A2，B1 和 B2 管，分别进行灌注。
4、Maximizer 和 Pathfinder 系统缓冲液自动配制：点击程序 Manual 界面工具栏的右边 Setup 按钮， 进入缓冲液配制界面。
点击该按钮，进入缓冲 液配制界面，如下图
白质具有彼此不同的电荷数目，从而与离子交换层析介质上的配基的相互作用不同，以不同离子
强度或连续离子强度梯度的盐溶液将结合能力不同的蛋白质依次洗脱下来。蛋白质与离子交换介
质之间的相互作用方式是多种多样的，不仅与蛋白质所带的净电荷有关，而且与蛋白质分子的空
间结构和电荷分布等因素有关，每一种蛋白质具有其独特的性质，因此，在分离制备蛋白质时要
选择不同的介质和不同的条件，主要有层析介质及其孔径和载量，如 UNOsphere Q/S，MacroPrep
High Q/S, DEAE 和 CM 等，层析条件主要有缓冲液、pH 值、离子强度等等。
2、凝胶过滤(Gel Filtration Chromatography，GFC)：一种纯粹按蛋白质分子在溶液中的体积大小
用的分子不能保留而先流出层析柱，再改变洗脱液的条件，如 pH 值、组成等，把吸附在层析柱 上的蛋白质分子以纯品或较纯的形态洗脱下来。
5、疏水作用层析（hydrophobic interaction chromatography, HIC）：蛋白质分子时一个外部有一亲 水层包围、内部有疏水核并具有高级结构的复杂体系。尽管蛋白质表面亲水性很强，但也存在一
将针筒插入 A 泵的 Priming 口，如图所示，逆时 针旋转 Priming 接头 1 圈，用针筒将 A 液抽出管 道，第一次抽出管道时大部分是管道和泵的空气， 将旋转接头顺时针旋紧，拔出针筒，打掉针筒中 的溶液，再如上述操作一次，直到泵和管道充满 溶液；然后按上述操作灌注 B 泵及其管道。
蛋白质的分离纯化(1)
白质的净电荷为零时的pH称等电点（pI）。
蛋白质等离子点： 没有其他盐类干扰时, 蛋白质质子供体基团解离出来
的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等 离子点。
二、蛋白质的紫外吸收性质
蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外光，主要是由带 芳香环的氨基酸决定的。其在280nm处对紫外吸收能力 的强弱顺序为：
电
电
泳
泳
方
方
向
向
等电聚焦电泳
SDS-PAGE
双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映 出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。
所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等 电点相同而分子量不同的蛋白质分开。
5.层析聚焦(P310)
是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。
(polyacrylaminde gel electrophoresis) 电泳
PAGE
样品浓缩成很薄的起始区带（0.1mm）
它以聚丙烯酰胺 凝胶为支持物，一般 制成凝胶柱或凝胶板 （不连续体系）。
浓缩胶 分离胶
凝胶的浓度（孔径大小）、 缓冲液组分和离子强度、 pH以及电场强度都是不同的
分离成单区带
依次洗脱收集后， 通过紫外吸收法测定吸 收峰。
这样大小不同的蛋白 质就被分离开来了。
（二）根据蛋白质溶解度不同的纯化方法
（蛋白质的胶体和沉淀性质）
主要方法： 1：等电点沉淀和PH值控制 2：蛋白质的盐溶和盐析 3：有机溶剂分级分离法 4：改变温度
1.等电点沉淀和PH值控制
即在不改变其它条件的情况下，PH处于等电点时的蛋白质 溶解度达到最低点。而位于等电点两侧的PH条件下蛋白质的溶
蛋白质纯化仪安全操作及保养规程
蛋白质纯化仪安全操作及保养规程蛋白质纯化仪是生物化学研究领域中常用的一种实验设备，也是一项需谨慎操作的任务。
本文将详细介绍蛋白质纯化仪的安全操作及保养规程。
1. 蛋白质纯化仪的安全操作1.1 实验环境安全1.工作地点应保持干燥、通风、整洁，操作人员不得食用、吸烟、饮水等。
2.仪器放置于平稳的地面上，工作时不得拆卸、改装、修理仪器。
3.进行操作前，应先进行仪器检查，发现任何问题应及时联系技术人员处理。
1.2 实验操作安全1.对于每种实验设备，首次使用前应仔细阅读说明书并请专业人员指导操作。
2.佩戴适当的个人防护装备，如实验手套、防护眼镜等。
3.冷却剂和热水等应谨慎使用，避免溅伤。
4.避免将样品直接接触皮肤、眼睛等敏感部位。
1.3 实验废料处理安全1.废料应妥善处理，按照实验室废物分类和安全管理的要求分类投放。
2.废液不得随意倒入下水道等公共场所。
2. 蛋白质纯化仪的保养规程2.1 清洗维护1.定期清理仪器表面的灰尘和杂物。
2.使用洁净布擦拭仪器表面的药液和水系液体。
3.液面极低时，不得在仪器中添加或抽出新液体，以免磨损泵头。
4.养护泵头，应将管道内部洗净，并进行泵头清洗养护。
2.2 润滑维护1.若发现仪器存在异常响声或运转阻力加大等现象，应及时检查和更换部件。
2.应定期加注润滑油，确保仪器良好的工作状态。
3.更换润滑油时，应注意控制切削油量和使用清洁油之后再加注新油。
2.3 储存维护1.仪器在使用后，应及时清洗彻底并进行干燥处理，以避免出现腐蚀、霉变等现象。
2.在长期不使用时，应将仪器存放于干燥、通风、无尘的地方，并尽量避免阳光直射和高温影响。
3. 总结蛋白质纯化仪是生化实验室中常见的一种实验设备，使用时需要我们仔细遵守安全操作规程和维护保养规程，以保障实验的正常开展和操作人员的安全。
除此之外，我们也应该定期参加实验室安全培训，提高安全意识和技能，保障实验室的安全和生产。
实验二 蛋白质的纯化-透析实验
实验二蛋白质的纯化-透析实验【实验目的】1. 学习透析的基本原理和操作；2. 掌握盐析沉淀蛋白质后，蛋白质的脱盐处理技术；3. 了解透析袋的使用方法。
【实验原理】透析是利用小分子能通过而大分子不能通过半透膜的原理而把它们分开的一种重要手段，是食品分离提纯过程中经常使用的基本操作技术之一。
蛋白质是大分子物质，不能透过透析膜而小分子物质可以自由透过。
在分离提纯蛋白质的过程中，常利用透析的方法使蛋白质与其中夹杂的小分子物质分开。
【实验仪器与试剂】烧杯；玻璃棒；离心机；离心管；冰箱；电炉。
1％氯化钡溶液；硫酸铵粉末；1mol/L EDTA；2%NaHCO3。
透析管（宽约2.5cm，长12－15cm）或玻璃纸; 皮筋；鸡蛋清溶液：将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用六层纱布过滤。
【实验步骤】1. 透析管（前）处理：先将一适当大小和长度的透析管放在1mol/L EDTA溶液中，煮沸10分钟，再在2％NaHCO3溶液中煮沸10分钟，然后再在蒸馏水中煮沸10分钟即可。
2. 取5ml蛋白质溶液于离心管中，加4g硫酸铵粉末，搅拌使之溶解。
然后在4℃下静置20分钟，出现絮状沉淀。
3. 离心：将上述絮状沉淀液以1000转/分的速度离心20分钟。
4. 装透析管：离心后倒掉上清夜，加5ml蒸馏水溶解沉淀物，然后小心倒入透析管中，扎紧上口。
5. 将装好的透析管放入盛有蒸馏水的烧杯中，进行透析，并不断搅拌。
6. 每隔适当时间（5－10分钟），用氯化钡滴入烧杯的蒸馏水中，观察是否有沉淀现象。
【结果与讨论】记录并解释实验现象。
【思考题】在透析袋处理过程中，EDTA和NaHCO3起何作用？。
蛋白纯化仪操作流程
蛋白纯化仪操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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以下是一般的蛋白纯化仪操作流程：1. 准备工作：确保蛋白纯化仪处于正常工作状态，检查仪器的各个部件是否完好。
蛋白纯化AKTA操作说明(二)
蛋白纯化AKTA操作说明（二）引言概述：本文档旨在提供关于蛋白纯化AKTA操作的详细说明。
蛋白纯化是生物化学和生物技术中常用的实验技术之一，能够用于从复杂的生物样品中纯化目标蛋白质。
AKTA操作是常用的蛋白纯化系统，本文将介绍该系统的操作步骤和注意事项，帮助用户顺利进行蛋白纯化实验。
正文：一、AKTA操作之仪器准备1. 确保AKTA蛋白纯化系统已经连接好电源，并打开主机电源开关。
2. 检查液氮罐中的液氮是否充足，并确保液位高于所需运行温度。
3. 打开冰盒，准备好所需的离心管、移液器和其他实验器材。
二、AKTA操作之列柱装配1. 按照实验要求选择合适的色谱柱和填料，并正确装配到AKTA系统中。
2. 使用力学手套松开色谱柱底部的螺丝，将填料注入色谱柱中，确保填料均匀。
3. 同时，注意将填料与色谱柱的连接口处用黑色硅胶密封，以免液体泄漏。
三、AKTA操作之流程设置1. 打开AKTA系统的软件界面，并选择“新建方法”。
2. 在方法设置界面中，设定蛋白纯化的各个步骤，如进样、洗脱等流程参数。
3. 根据实验需求，选择合适的梯度洗脱方案，并输入相应的洗脱液体浓度。
四、AKTA操作之样品处理1. 将待纯化的生物样品进行预处理，如离心、过滤等，以去除杂质。
2. 根据纯化需求，可进行某些特定试剂的添加，如酶切剂、亲和标记剂等。
3. 根据方法设置，将样品装入进样器中，并调整进样量和进样流速。
五、AKTA操作之运行实验1. 保存并加载所设置的方法，确保参数设定正确。
2. 启动AKTA系统，开始实验运行，并监控过程中的各项参数指标。
3. 及时记录实验数据，并根据需要进行样品采样、保存等操作。
总结：通过本文所述的蛋白纯化AKTA操作说明，用户可以了解到系统准备、列柱装配、流程设置、样品处理和运行实验等关键步骤。
合理而正确的操作，将帮助用户获得高质量的蛋白纯化结果。
同时，用户还需根据实际操作中的具体情况，进一步优化实验参数，以满足各自的研究需求。
硫酸铵分级纯化蛋白质原理操作
硫酸铵分级纯化蛋白质原理操作硫酸铵分级沉淀蛋白质原理与操作一，基本原理硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
这种方法称之为盐析。
盐浓度通常用饱和度来表示。
硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。
二，试剂及仪器1 . 组织培养上清液、血清样品或腹水等2. 硫酸铵（ NH 4 ） SO 43. 饱和硫酸铵溶液（ SAS ）4. 蒸馏水5. PBS( 含 0.2g /L 叠氮钠 )6. 透析袋7. 超速离心机8. pH 计9. 磁力搅拌器三，操作步骤以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。
各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。
通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50% 。
（一）配制饱和硫酸铵溶液（ SAS ）1.将 767g （ NH 4 ） 2 SO 4 边搅拌边慢慢加到 1 升蒸馏水中。
用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。
此即饱和度为 100% 的硫酸铵溶液（ 4.1 mol/L, 25 ° C ）.2.其它不同饱和度铵溶液的配制（二）沉淀1.样品（如腹水） 20 000 ′ g 离心 30 min ，除去细胞碎片；2.保留上清液并测量体积；3.边搅拌边慢慢加入等体积的 SAS 到上清液中，终浓度为 1 ： 1 （4.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜（ 4 ° C ），使蛋白质充分沉淀。
（三）透析1.蛋白质溶液 10 000 ′ g 离心 30 min （ 4 ° C ）。
弃上清保留沉淀；2.将沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 叠氮钠中。
蛋白分离纯化实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质分离纯化的基本原理和操作方法。
2. 学习不同分离纯化技术的应用。
3. 提高实验操作技能和数据处理能力。
二、实验原理蛋白质是生物体内重要的生物大分子，具有复杂的结构和功能。
蛋白质分离纯化是研究蛋白质结构和功能的重要手段。
本实验采用多种分离纯化技术，包括：材料预处理、细胞破碎、离心分离、沉淀分离、膜过滤分离和色谱分离等，实现对蛋白质的分离纯化。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌细胞、质粒DNA、限制性内切酶、DNA连接酶、PCR产物、琼脂糖、电泳缓冲液、考马斯亮蓝R-250等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、玻璃棒、培养箱、无菌操作台等。
四、实验步骤1. 蛋白质提取（1）将大肠杆菌细胞培养至对数生长期。
（2）收集细胞，用玻璃棒搅拌，加入预冷的提取缓冲液，低温条件下进行细胞破碎。
（3）离心分离，取上清液即为蛋白质粗提液。
2. 蛋白质沉淀（1）向蛋白质粗提液中加入一定量的硫酸铵，搅拌溶解。
（2）离心分离，收集沉淀，即为蛋白质沉淀。
3. 蛋白质溶解（1）将蛋白质沉淀溶解于适量的缓冲液中。
（2）调整pH值，使蛋白质处于适宜的溶解状态。
4. 蛋白质分离纯化（1）离子交换色谱：将蛋白质溶液上样至离子交换柱，用不同浓度的盐溶液进行梯度洗脱，收集目标蛋白峰。
（2）凝胶过滤色谱：将蛋白质溶液上样至凝胶过滤柱，用缓冲液进行洗脱，收集目标蛋白峰。
5. 蛋白质鉴定（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，分析蛋白质分子量。
（2）考马斯亮蓝R-250染色：观察蛋白质条带，判断蛋白质纯度。
五、实验结果与分析1. 蛋白质提取：通过细胞破碎和离心分离，成功提取出大肠杆菌细胞中的蛋白质。
2. 蛋白质沉淀：硫酸铵沉淀法成功地将蛋白质从粗提液中分离出来。
3. 蛋白质溶解：调整pH值后，蛋白质成功溶解于缓冲液中。
4. 蛋白质分离纯化：离子交换色谱和凝胶过滤色谱成功地将目标蛋白从粗提液中分离出来。
重组蛋白质的分离纯化 (1)
重组蛋白质的分离纯化摘要：90年代以来基因重组技术得到很大的发展，基因工程产品的分离纯化的成本约占其全部成本的60%～80%，因此重组蛋白的分离纯化技术越来越重要。
本文主要介绍了沉淀、液液萃取、层析等常用分离重组蛋白方法的原理及应用，旨在为开展蛋白质的制备及其应用研究提供理论依据。
关键词：重组蛋白质；分离；纯化；沉淀；液液萃取；层析；包涵体随着基因重组技术的发展，出现了很多基因工程产品，而作为基因工程技术的下游工程中的基因重组蛋白的分离纯化技术越来越显示其重要性。
据有人统计,基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60%～80%[1]。
由此可见产品的分离纯化是获得目的产物的关键一步，也是比较困难的一步，它标志着生物产业的高低。
纯化重组蛋白质和普通蛋白质的不同就在于要选择合适的表达系统，因为表达系统决定了细胞培养过程中产物的性质以及可能产生的杂蛋白，而纯化重组蛋白质的主要目的是去除杂蛋白质，通常对一种重组蛋白质的纯化会采用多个系统[2]。
但是重组蛋白有几种不同的表达形式，如细胞外的分泌表达；细胞内可溶性表达以及包涵体形式的存在，因此对于重组蛋白的纯化要依据其表达形式的不同，采取不同的纯化工艺。
与传统方式相似，重组蛋白的分离纯化也是利用其物理和化学性质的差异，即以分子的大小、形状、溶解度、等电点、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等性质建立起来的。
目前主要的纯化方法有浓缩沉淀法，层析和电泳技术。
重组蛋白质在分离纯化的过程中，必须维持一定的浓度和生物活性形式，以及防止被降解。
因此从生物体中有效分离纯化重组蛋白质一直是个难题。
90 年代以来,国内外许多科学工作者在蛋白质分离纯化技术和工艺上进行了大量的研制和开发,将原有的纯化技术水平提高到一个新的高度。
本文将简单介绍一些传统的分离纯化方法，并介绍近10 年来重组蛋白分离纯化中的新进展和一些新出现的技术。
1 沉淀分离技术1.1 盐析法其原理是蛋白质在高浓度盐溶液中，随着盐浓度的逐渐增加，由于蛋白质水化膜被破坏、溶解度下降而从溶液中沉淀出来。
蛋白纯化超声破碎的步骤
蛋白纯化超声破碎的步骤
蛋白纯化是生物化学实验中常见的步骤，超声破碎是其中一种
常用的方法。
在进行蛋白纯化超声破碎时，通常会按照以下步骤进
行操作：
1. 样品制备，首先需要准备含有目标蛋白的样品。
这可能涉及
到细胞培养、组织提取或其他方法来获取蛋白样品。
2. 超声破碎前处理，在进行超声破碎之前，通常需要对样品进
行预处理，例如使用低速离心去除细胞碎片或其他杂质。
3. 超声破碎，将经过预处理的样品置于超声波破碎仪中，通过
超声波的作用产生高频振动，从而引起样品中的细胞破裂，释放蛋
白质。
4. 控制破碎条件，在超声破碎过程中，需要控制超声波的功率、破碎时间和温度，以避免过度破碎导致蛋白变性或降解。
5. 样品处理，超声破碎后，样品可能需要经过离心等步骤，以
去除残余的细胞碎片和细胞核等杂质。
6. 蛋白提取，最后，可以使用适当的方法（如离心、过滤、亲
和层析等）来提取目标蛋白，以便进行后续的纯化步骤。
在进行蛋白纯化超声破碎时，需要注意操作过程中的卫生与安全，以及对超声波破碎仪的正确使用，确保获得高质量的蛋白样品。
此外，根据具体的实验要求和样品特性，可能需要对以上步骤进行
适当的调整和优化。
蛋白质纯化系统AKTAPurifer10操作规程
仪器操作规程-蛋白质纯化系统 AKTA Purifer 10
一、标准操作规程
1.检查各部件连接是否正常（电源开关，仪器部件，流动相，色谱柱等）。
2.打开AKTA purifierTM10蛋白层析仪和计算机电源。
3.双击UNICON 5.11图标，进入实时方法编辑、实时运行、结果分析界面。
4.编辑新方法:
1)编辑方法：点击文件，点击新建方法，编辑方法（运行时间，流动相选择，流速，
检测波长等）。
2)保存方法：点击文件，点击另存方法为（输入文件名）。
3)运行方法：选择文件，点击右键，点击RUN，进行方法运行。
4)平衡色谱柱，一般约1—2个柱体积。
5)手动单针进样：在Load状态，将样品注入进样环，完毕后，点击Inject状态。
6)批处理进样：编辑方法，选择A—905自动进样器，进入scouting界面，利用向
导进行批处理编辑，保存批处理文件，点击批处理运行图标。
7)数据处理：点击第四个谱图分析图标，进入数据处理界面，打开要处理的文件，
点击积分向导图标进行数据处理（还可点击界面顶部的手动积分进行手动处理）。
保存数据处理方法。
5.运行已有方法：在实时分析界面点击文件，打开方法文件，点击RUN即可。
6.清洗色谱柱，在方法文件中调出自动清洗方法，点击RUN即可。
二、注意事项
1.流动相的溶剂须使用色谱纯，水为超纯水，缓冲盐需用0.45um的滤膜过滤。
2.清洗泵后的保护液为20%乙醇，一周更换一次。
3.如经常使用仪器，在线过滤器中的滤芯需每周超声清洗一次。
三、送样要求
初级纯化过滤后的样品。
his蛋白纯化操作步骤全
His蛋白的纯化一目的蛋白样液的收集1：-20度冰箱中取出pet30a-p26甘油菌2：菌种复苏，将5ul P26菌种加入到5ml K+ LB培养基中(1:1000加入卡纳抗生素的LB培养基)，以未加菌的K+ LB培养基作空白对照，37度摇床培养12-16h。
3：扩大培养，将5ml过夜培养的P26菌液按照1:100的比例接种到500ml K+ LB培养基中,摇床培养至OD值为0.6（2h左右）4：诱导表达，扩培后的菌种中加入1mg/ml iptg，使iptg最终浓度1ug/ml(1mmol/l ) 37度摇床培养4h，置-70度保存或立即进行下步操作5:收集包涵体，离心，5000r 15min,弃去上清液(可置于-20度保存)6:溶解包涵体，用PBS重悬细胞沉淀（约每毫升沉淀加5mlPBS）,放在冰上用超声波细胞粉碎机破菌（有效时间30-40min，超5s,停10s,及时换冰防止温度过高使蛋白质变性）7：蛋白提取液的收集，离心，5000r 15min取上清（可4度保存），菌体保存，测菌体中目的蛋白含量大小使用8：介质处理，取出底帽滴出多余液体，柱子顶部朝上直立固定好，蒸馏水洗涤一次，再用2倍树脂体积的1*binding buffer平衡柱子，最后用1*binding buffer配置成50%的树脂。
9：介质与核酸结合，从柱子上部加入蛋白提取液，4度旋转混匀1h，收集流出液(若需要流出液再重新过柱一次，以最大限度提高结合力)10：取10ml 1*binding buffer洗树脂，洗2次，流出液标记洗涤顺序保存11：样品的收集，取10个1.5mlEP管分别标记1,2,3……10，每次取1ml 1*elution buffer加入树脂内滴入标记1-10的EP管内每管6滴（第8管的目的蛋白含量已经很低,10管即可，若需要可适当增加）12：树脂的保存，若样品体积大于柱子体积，树脂10倍体积的PBS重新平衡后可马上使用，若不使用可用蒸馏水洗涤树脂，加入20%乙醇10ml -20度保存（一种蛋白树脂可重复使用，注意不要超过树脂的结合能力）二检测收集的样品中目的蛋白量的大小13：取13个1.5mlEP管，分别标记1#，2#，3#……10#，A,B,C从1号EP 管内取30ul样液于1#号EP管内，依次移取至10号于10#号，取30ul 10步中第一次收集的流出液于标记 A 的EP管中，取30ul第二次收集的流出液于标记 B 的EP管中,将7步中保留的菌体用少量pbs稀释并取30ul于标记C的EP管内。
蛋白质纯化仪的使用 (1)资料
蛋 白 质 纯 化 仪 使 用 说 明1.认识机器本机器常规流程图：使用机器前所有端口请按如图所示连接，将“A 泵溶液进口线”“B 泵溶液进口线”放进超纯水中。
按如图所示先不要连接柱子。
建议一般使用A 泵进液，如需梯度洗脱时才用B 泵。
***除上样样品（14000 rpm/12000 rpm 离心30min ）外，所有在此机器上要用的溶液必须要经过0.22 μm 滤膜过滤。
***样品泵A 泵B 泵 多波长检测器 pH 计 混合池 层析柱 切换阀进样环 溶液由A/B 泵进入仪器 进样阀层析柱切换阀多波长检测处 自动收集器 废 液 出 口A 泵溶液进口线B 泵溶液进口线 整合电导检测2.开机打开计算机、蛋白质纯化仪（电源在右侧下角）、自动收集器（电源在后面右侧）。
此时蛋白质纯化仪上部分指示灯会亮，有黄色的、有蓝色的，开机较慢，请稍等，当蛋白质纯化仪上所有指示灯不亮时，才可进行操作。
3.启动电脑“ChromLab”软件双击电脑“ChromLab”应用程序，进入如下界面：4.洗泵单击“Manual Run”进入：我们主要看右下方这块（图中所示模块均可双击设置参数）：双击“样品泵”模块出现如图所示对话框：双击“层析柱切换阀”模块如下图所示：此步骤主要是洗泵工作，请确保层析柱不在程序中，点击“Bypass ” 点击此处可让可更改溶液的流动方向。
点击1-5可设置连接不同的层析柱端口 设置流速 设置压力，小于选择的柱子承受最大压力。
在下面“控制流速以防止超压”前面打对勾，以保护柱子。
不特殊设置，默认A 泵工作此处可控制机器的运行与停止。
双击“样品泵”模块出现如下图所示：选择“System Pump Waste”模式后，轻按仪器上“A泵”的“Purge”按钮，稍等片刻，即将进行A泵的洗泵工作，此时流速将会达到最大10 mL/min。
如果想洗B泵（凝胶过滤时不需要），轻按仪器上“B 泵”的“Purge”按钮即可。
his蛋白纯化操作步骤全
His蛋白的纯化一目的蛋白样液的收集1：-20度冰箱中取出pet30a-p26甘油菌2：菌种复苏，将5ul P26菌种加入到5ml K+ LB培养基中(1:1000加入卡纳抗生素的LB培养基)，以未加菌的K+ LB培养基作空白对照，37度摇床培养12-16h。
3：扩大培养，将5ml过夜培养的P26菌液按照1:100的比例接种到500ml K+ LB培养基中,摇床培养至OD值为0.6（2h左右）4：诱导表达，扩培后的菌种中加入1mg/ml iptg，使iptg最终浓度1ug/ml(1mmol/l ) 37度摇床培养4h，置-70度保存或立即进行下步操作5:收集包涵体，离心，5000r 15min,弃去上清液(可置于-20度保存)6:溶解包涵体，用PBS重悬细胞沉淀（约每毫升沉淀加5mlPBS）,放在冰上用超声波细胞粉碎机破菌（有效时间30-40min，超5s,停10s,及时换冰防止温度过高使蛋白质变性）7：蛋白提取液的收集，离心，5000r 15min取上清（可4度保存），菌体保存，测菌体中目的蛋白含量大小使用8：介质处理，取出底帽滴出多余液体，柱子顶部朝上直立固定好，蒸馏水洗涤一次，再用2倍树脂体积的1*binding buffer平衡柱子，最后用1*binding buffer配置成50%的树脂。
9：介质与核酸结合，从柱子上部加入蛋白提取液，4度旋转混匀1h，收集流出液(若需要流出液再重新过柱一次，以最大限度提高结合力)10：取10ml 1*binding buffer洗树脂，洗2次，流出液标记洗涤顺序保存11：样品的收集，取10个1.5mlEP管分别标记1,2,3……10，每次取1ml 1*elution buffer加入树脂内滴入标记1-10的EP管内每管6滴（第8管的目的蛋白含量已经很低,10管即可，若需要可适当增加）12：树脂的保存，若样品体积大于柱子体积，树脂10倍体积的PBS重新平衡后可马上使用，若不使用可用蒸馏水洗涤树脂，加入20%乙醇10ml -20度保存（一种蛋白树脂可重复使用，注意不要超过树脂的结合能力）二检测收集的样品中目的蛋白量的大小13：取13个1.5mlEP管，分别标记1#，2#，3#……10#，A,B,C从1号EP 管内取30ul样液于1#号EP管内，依次移取至10号于10#号，取30ul 10步中第一次收集的流出液于标记 A 的EP管中，取30ul第二次收集的流出液于标记 B 的EP管中,将7步中保留的菌体用少量pbs稀释并取30ul于标记C的EP管内。
ATKA 蛋白质纯化系统操作规程
Esc按Esc一次返回一级菜单，或重复地回到主菜单。
5.主菜单概要(Main menu overview)
反复按Esc键可从任何子菜单进入主菜单平面。
Templates.该菜单出现在自检后启动时，用于运行应用模板和方法模板。Program Method用于编辑用户专用方法。
SetParameters用于对检测紫外(UV)、电导、PH、温度、和运转泵及混合器设置参数。
Check用于检测系统内部参数，例如序列号、泵运行时间、和灯亮度。
Manual Run用于手工运行系统。
关机步骤
结束运行(Finishing the run)
在Method Complete即时按OK结束运行。
Method Complete
Press OK to continue
在结束前中断运行，按End，用选择yes来确认后面的信息，并按OK。
5.当使用危险化学品时，在维护和维修前应确保整个系统已用蒸馏水彻底冲洗过。
ATKA prime蛋白质纯化系统
型号：AKTAprime
厂家：GE
价格：13万元
主要功能：用于蛋白质的分离纯化
操作规程
开机骤
启动系统并进行系统自检如下：(Selftest自检)
1．打开系统后面板的主电源开关。系统开始进行自检。
2．首先将显示系统名称和软件版本号。然后在自检期间显示AKTA prime信息。如果检测到错误，则在显示器上显示出错误信息。
3．自检约需30-40秒钟。当启动无误地完成时，显示屏显示模板菜单Template模版并准备好使用。系统可以立即使用。但是直到使用一小时后才能达到全部技术指标。
4．操作用户界面(Operation the user interface)
蛋白纯化AKTA操作说明(一)
蛋白纯化AKTA操作说明（一）引言概述：蛋白纯化是生物技术研究中常用的一种重要技术手段，通过纯化目标蛋白，可以实现对其结构、功能和相互作用的进一步研究。
AKTA是一种常用的蛋白纯化设备，本文将介绍如何进行AKTA操作以获得高纯度的蛋白样品。
本文分为五个大点：设备准备、准备实验材料、样品制备、纯化操作步骤、数据处理和总结。
正文：一、设备准备：1. 查看设备状况：检查AKTA设备的各个组件是否齐全，并确保设备正常工作。
2. 设备消毒：使用适当的消毒剂对AKTA设备进行消毒，确保实验过程的无菌。
二、准备实验材料：1. 缓冲液：根据实验需要选择不同的缓冲液，并准备足够的量。
2. 标记抗体：根据实验需要选择适当的标记抗体，并准备足够的量。
3. 标记亲和树脂：根据实验需要选择适当的标记亲和树脂，并准备足够的量。
4. 标准品：准备适当浓度的标准品作为纯化过程中的参考。
三、样品制备：1. 细胞裂解：采用适当的方法对细胞进行裂解，获得含有目标蛋白的裂解液。
2. 预处理：根据裂解液的性质，进行适当的预处理，如去除杂质、调整pH值等。
3. 样品加载：将预处理后的样品加载到纯化系统中，确保样品的均匀分布。
四、纯化操作步骤：1. 初始化设备：打开AKTA软件，选择纯化方法，并设置相关参数。
2. 样品加载：将样品加载到设备中，并根据实验要求选择适当的柱子和纯化方案。
3. 洗脱：使用缓冲液进行洗脱，去除非目标蛋白和杂质。
4. 目标蛋白回收：使用适当的缓冲液洗脱目标蛋白，并将其收集到已经标记好的收集管中。
5. 清洗设备：使用适当的缓冲液对设备进行清洗，防止交叉污染。
五、数据处理和总结：1. 数据记录：记录纯化过程中的各项数据，如流速、吸光度和洗脱峰。
2. 数据分析：对纯化结果进行分析和比较，评估纯化效果。
3. 总结经验：根据纯化结果总结操作经验，以优化蛋白纯化的流程和效率。
总结：本文介绍了蛋白纯化AKTA操作的基本步骤。
通过设备准备、准备实验材料、样品制备、纯化操作步骤和数据处理，可以获得高纯度的蛋白样品，为后续的蛋白研究提供了可靠的基础。
蛋白纯化仪器的原理和应用
环境科学：在环境科学领域，蛋白纯化仪器可用于分离和纯化环境样品中的蛋白质， 以研究环境污染对生态系统的影响
农业研究：在农业研究领域，蛋白纯化仪器可用于分离和纯化农作物中的蛋白质，以 了解农作物的生长和发育过程以及抗病性
食品科学：在食品科学领域，蛋白纯化仪器可用于分析和纯化食品中的蛋白质，以了 解食品的营养价值和安全性
20XX
蛋白纯化仪器 的原理和应用
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1 蛋白纯化仪器的原理 2 蛋白纯化仪器的应用
1
蛋白纯化仪器的原理
蛋白纯化仪器是一种用于分 离和纯化蛋白质的设备
其原理基于色谱技术，是一 种高效分离蛋白质的方法
以下是蛋白纯化仪器的基本 原理
蛋白纯化仪器的原理
固定相和流动相：在色谱法中，有一个固定相和一个流动相。固定相是色谱柱中的介质，而
1
流动相是经过色谱柱的液体。蛋白质通过与固定相和流动相之间的相互作用进行分离
2
色谱柱：色谱柱是色谱法中的核心部分，其中装有固定相。流动相携带待分离的蛋白质流 经色谱柱，与固定相进行相互作用
3
洗脱：经过与固定相的作用后，蛋白质在流动相中的溶解度降低，从而被洗脱出色谱柱。 通过收集洗脱液，可以得到各个组分的蛋白质
药物研发：在药物研发过程中，往往需要纯化的蛋白质作为药物的目标分子。蛋白纯 化仪器可以帮助研究人员快速、准确地分离和纯化蛋白质，为药物研发提供重要的支 持
蛋白纯化仪器的应用
疾病研究
在疾病研究中，了解病变蛋白质的 性质和功能非常重要。蛋白纯化仪 器可以帮助科学家们从生物样品中 分离出病变蛋白质，以便进一步研
法医学：在法医学领域，蛋白纯化仪器可用于分离和纯化生物样本中的蛋白质，以进 行身份鉴定和案件调查
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蛋 白 质 纯 化 仪 使 用 说 明
1.认识机器
本机器常规流程图：
使用机器前所有端口请按如图所示连接，将“A 泵溶液进口线”“B 泵溶液进口线”放进超纯水中。
按如图所示先不要连接柱子。
建议一般使用A 泵进液，如需梯度洗脱时才用B 泵。
***除上样样品（14000 rpm/12000 rpm 离心30min ）外，所有在此机器上要用的溶液必须要经过0.22 μm 滤膜过滤。
***
样品泵
A 泵
B 泵 多波长检测器 pH 计 混合池 层析柱 切换阀
进样环 溶液由A/B 泵进入仪器 进样阀
层析柱切换阀
多波长检测处 自动收集器 废 液 出 口
A 泵溶液进口线
B 泵溶液进口线 整合电导检测
2.开机
打开计算机、蛋白质纯化仪（电源在右侧下角）、自动收集器（电源在后面右侧）。
此时蛋白质纯化仪上部分指示灯会亮，有黄色的、有蓝色的，开机较慢，请稍等，当蛋白质纯化仪上所有指示灯不亮时，才可进行操作。
3.启动电脑“ChromLab”软件
双击电脑“ChromLab”应用程序，进入如下界面：
4.洗泵
单击“Manual Run”进入：
我们主要看右下方这块（图中所示模块均可双击设置参数）：
双击“样品泵”模块出现如图所示对话框：
双击“层析柱切换阀”模块如下图所示：
此步骤主要是洗泵工作，请确保层析柱不在程序中，点击“Bypass ” 点击此处可让可更
改溶液的流动方向。
点击1-5可设置连接
不同的层析柱端口 设置流速 设置压力，小于选择的柱子承受最大压力。
在下面“控制流速以防止超压”前面打对勾，以保护柱子。
不特殊设置，默认A 泵工作
此处可控制机器的运行与停止。
双击“样品泵”模块出现如下图所示：
选择“System Pump Waste”模式后，轻按仪器上“A泵”的“Purge”按钮，稍等片刻，即将进行A泵的洗泵工作，此时流速将会达到最大10 mL/min。
如果想洗B泵（凝胶过滤时不需要），轻按仪器上“B 泵”的“Purge”按钮即可。
注意此时废液将从“样品泵”模块上的“Waste 2”出口处留出，拿好废液缸。
目的：洗A、B泵目的：Loop环上样
A、B泵洗完后，选择“Manual Load Loop”点击“Start”让超纯水在机身内流动片刻，此时废液将从自动收集器那边的废液口流出。
点击“Stop”再选择“System Pump Inject Loop”此时再开始，将冲洗样品环。
最后停止。
将A、B泵溶液进口线分别放入后续实验需要用的缓冲液中，重复以上过程。
嗯，洗完泵以后，把A泵溶液进口线放入超纯水中。
5.Developing a Method
单击“New Method ”进入如下界面：
首先，我们先选择合适模块运行程序，如1中的流程图所示是最佳选择：
如图所示是Ni-Affinity 1mL 柱体积的最佳模式：
选择运行模块按钮 选择柱子类型 选择柱子型号 柱子体积
柱子所承受最大压力 选择柱子连接端口处 自动收集器板块，目前实验室只能选择这个 控制程序默认流速处，一定要勾选第一个，防止操作不当导致压力过大，对柱子造成损伤。
第二个不必选中，本机器没有购买空气检测器。
此处勾选，pH 计才正常工作 设置
波
长
检
测处 可设置按柱体积（CV ）走溶液的用量，还是按ml 数走溶液用量 260
如图所示是Gel-filtration ENrichTM SEC 650的最佳模式：
当创建好上述内容后，我们就开始设置具体的步骤，一般来说一个纯化过程以下步骤是不可少的，如图：（此时可以点击左侧需要步骤按住不放，拖到右侧即可创建，添加洗脱步骤时一般选择“Colum Wash”创建）
柱平衡
进样
洗柱
洗脱样品
把鼠标放在右侧过程图中，单击右键可修改步骤名称。
下图流程仅供参考。
Ni-Affinity 模式 Gel-filtration 模式：
可根据情况适当调整
下一步就是设置每一步的流速和溶液用量了（点击你所要设置的步骤，在右侧就会出现相应的设置条件）：
例如，水洗、挂Ni 2+、柱平衡、不同浓度咪唑洗脱、EDTA 洗脱、20% 乙醇冲柱等过程设置如图：
20 % ethanol 水洗
20 % 乙醇
此处设置流速，打钩为默认流速，可不勾选，设置自需流速 单一溶液洗脱时，双击此按钮，当B 溶液为
100%时，说明溶液全部从B 泵进入。
为0时，溶液均从A 泵进。
当设置梯度洗脱时双击此按钮。
连续梯度洗脱，不设B 溶液的百分比，只设置洗脱溶液体积即可；阶段性梯度洗脱，需设置B 溶液的百分比和洗脱体积。
例图所示代表含义为：50%的A 溶液和50%的B 溶液混合后洗脱，洗脱体积为10个柱体。
勾选此处可设置，自动收集。
全部收集 设置收集体积， 图例为0.2 mL 每管 单击此处，可设置按波峰收集。
一般不建议用。
除非已对所纯化蛋白出峰位置非常了解。
样品进样设置如下：
按如上过程设置好自己需要的流程后，即可开始程序：
点击上方第二行的“Star Run ”→“OK ”即可。
运行以后会出现如下图画面，等待机器运行：
设置进样环体积1ml/5ml 首先单击这里 选择进样环进样 设置流速，建议不要太快，影响挂柱效率 设置进样环体积1ml/5ml
程序运行以后，先不要急着休息，点击下图左上角的“Hold Step”，此时连接柱子。
将“层析柱交换阀”上相互连接的两根线从中间拧开，接柱子。
注意：
1.注意柱身上标示的溶液流动方向（上端→下端）。
2.旋开柱子顶端和下端的螺母，让纯化仪的出水端先连接柱子的下端，让水从柱子的上端流出，待柱子上端有水滴停留时，将纯化仪的出水端接到柱子的上端，此时再连接柱子的下端。
目的：防止有气泡进入柱子内。
3.如果用凝胶过滤柱时，除了要特别注意防止气泡进入，还要，注意的摆放姿势一定要保持垂直，否则会影响纯化的效率。
4.顺便说一下，柱子使用完毕后，应在保持液体流动的情况下，先拆卸柱子的下端，再拆卸柱子的上端，防止柱内保护液体的损失。
4℃保存。
柱子安装完毕后，在“Hold Step”点击“Resume”开始运行你预先设置好的程序。
嗯，当然，咱们的机器也不是全自动的，开头和结尾还是需要动身换一下相应的溶液的。
1.记好是A泵还是B泵进液。
2.换溶液时，
注意将仪器暂停以后再操作，手不要抖，动作尽可能的慢一点。
3.换溶液时，还要注意看看溶液进口处有没有空气进入，有的话，可以用注射器加点液体到细管内。
好了，那就可以安心的让它运行了。
*记得柱平衡步骤时，调零。
此时如果无聊的话，你就可以将样品倒吸入样品环了，反正早晚也要弄。
顺便把注射器、进样针、Loop环和自制的出液口细管（连接在样品泵“Waste 2”的出口上）再用缓冲液多洗两遍以防止污染。
*注意你的样品要提前在14000 rpm（最好，还可冷冻离心）/12000 rpm离心30 min，重新将上清转移到新的离心管中，以确保样品中不含微小颗粒，防止阻塞仪器和柱子。
*上样技巧：
1.确定你的样品量：以1 mL进样环为例，最好样品体积为800-900 μl最佳，此时倒吸一定不要人为引入气泡。
2.然后用200-100 μl的蛋白缓冲涮洗离心管。
1 mL你懂得，千万不能超。
3.加样后，进样针就不可以离开进样孔了，否则样品将会从被吸上来的地方流出去。
冲洗离心管时让它留在那就行了。
4.倒吸涮洗离心管的溶液时，可将溶液都吸完，还可以稍微多吸那么一点点，但也仅仅那么一点点，为了是不让样品浪费，你要保证空气不能进入进样环哦~
5.
11。