蛋白质纯化与结晶的原理

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血浆清蛋白的分离纯化与鉴定实验原理不同的蛋白质的分子量

血浆清蛋白的分离纯化与鉴定实验原理不同的蛋白质的分子量、溶解度、以及在一定条件下带电的情况有所不同，可以更据这些性质的差别，分离及提纯各种蛋白质。

利用硫酸铵分段盐析法将血清中的清蛋白及球蛋白分离，清蛋白液再利用葡聚糖凝胶过滤法除盐，即可得到较纯的清蛋白。

纯化后的清蛋白可利用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。

盐析：是指将中性盐（如硫酸铵）加入蛋白质溶液中，中和Pr蛋白质表面电荷及破坏水化膜，使蛋白质相互聚集在析出。

分段盐析：各种蛋白质盐析时所需的盐浓度和PH不同，利用不同盐浓度下Pr溶解度不同，将蛋白质分段沉淀下来。

半饱和硫酸铵沉淀血清中球蛋白（清蛋白溶解）将血清清蛋白和球蛋白初步分离。

常用的除盐方法：半透膜透析；凝胶过滤（层析）。

在葡聚糖凝胶层析柱中，由于蛋白质和盐的分子量不同，洗脱速度也不同，大分子蛋白质不能进入凝胶的网孔内而先流出，小分子盐则可进入网孔滞留在凝胶内，收集蛋白洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。

用三氯醋酸液鉴定洗脱的蛋白液，以BaCL2检测硫酸铵。

纯化后的清蛋白用醋酸纤维薄膜电泳鉴定蛋白质分离效果。

实验试剂1．饱和硫酸溶液：称固体硫酸铵85g于100ml蒸馏水中，在70～80℃水浴中搅拌溶解，用浓氨水调PH为7.2，室温放置过夜，瓶底析出白色结晶，上层液即为饱和硫酸铵液。

2．生理盐水：称取分析纯NaCl 0.89克，蒸馏水稀释至1000ml.3．葡聚糖凝胶Sephadex G-25: 称取10克Sephadex G-25，加入200ml 0.02mol/lPH6.5磷酸盐缓冲液溶胀24小时。

4．10％三氯醋酸。

5．1％氯化钡溶液6．pH8.6，离子强度0.06巴比妥电极缓冲液：称取巴比妥钠12.76g，巴比妥1.66g，蒸馏水加热溶解后再加水至1000ml。

7．氨基黑10B染色液：称取氨基黑10B 0.5g，用甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸馏水40ml 溶解。

8．漂洗液：95％乙醇45ml，加冰醋酸5ml及蒸馏水50ml。

基础生化实验-蛋白质纯化

蛋白质纯化一、目的:利用金属亲和性管柱(metal affinity column)来大量纯化带有affinity tag的基因重组蛋白。

二、原理:由于六个Histidine 所组成的His Tag (metal affinity tag)可与Ni2+ bind，所以利用基因重组技术在表现的蛋白质加上His Tag，再以金属亲和性管柱(Ni-NTA) (此His- tag序列可与带二价正电的阳离子相螯和)及liquid chromatography来大量纯化蛋白质。

三、试剂与器材:1.loading(binding) buffer (10mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HClPh7)✧细菌回溶成为蛋白质的载体以保持活性2.wash buffer (20mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)3.elution buffer (20mM EDTA,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)上课补充:✧蛋白质很脆弱，需要在特殊的buffer里。

四、仪器与设备:FPLC(速液相色谱仪)五、步骤:1.将管柱架在铁架上，把亲和性胶体悬浮装填于管柱内。

2.以2~3倍CV loading buffer清洗管柱后，注入蛋白质样本。

3.以wash buffer梳洗，2到3倍column体积。

4.用wash buffer和elution buffer进行线性梳洗，并收集流出液体，以FPLC UV monitor上的OD280数据读取样品流出与否，并观察冲离液之曲线图。

上课补充:✧胞内型分泌需要用超音波破菌，因为会放热所以要放在冰中使用。

✧线性梳洗为加入elution buffer会有颜色变化会把镍离子跟imidazole冲洗掉，剩下胶体溶液。

✧其中imidazole和Histidine类似也会和镍离子结合所以会竞争，可拿来洗涤蛋白质。

蛋白质结晶方法大总结

蛋白质结晶方法大总结1.1结晶方法（Crystallization Techniques)1。

1.1 分批结晶（Batch Crystallization）这是最老的最简单的结晶方法，其原理是同步地在蛋白质溶液中加入沉淀剂，立即使溶液达到一个高过饱和状态。

幸运的话,不需进一步处理即可在过饱和溶液中逐渐长出晶体.一个用于微分批结晶的自动化系统已被Chayen等人设计出（1991，1992），其微分批方法中，他们在1—2μl包含蛋白质和沉淀剂的液滴中生长晶体。

液滴被悬浮在油（如石蜡）中，油的作用是作为封层以防止蒸发,它并不干扰普通沉淀剂，但是干扰能溶解油的有机溶剂（Chayen, 1997; see also Chayen， 1998）。

1.1.2 液—液扩散（Liquid–Liquid Diffusion）这种方法中，蛋白质溶液和含有沉淀剂的溶液是彼此分层在一个有小孔的毛细管中，一个测熔点用的毛细管一般即可（如图1.2）。

下层是密度大的溶液,例如浓硫酸铵或PEG溶液。

如果有机溶剂如MPD被用作沉淀剂，它会在上层。

以1：1混合,沉淀剂的浓度应该是所期最终浓度的二倍.两种溶液（各自约5μl)通过注射器针头导入毛细管，先导入下层的。

通过一个简易的摇摆式离心机去除气泡。

再加入上层，进而两层之间形成一个明显的界面，它们会逐渐彼此扩散。

Garc´？a-Ruiz and Moreno（1994）已经发展液—液扩散技术至针刺法。

蛋白质溶液通过毛细力被吸入狭窄的管中，管的一端是封闭的。

接着，开放端被插入置于小容器的凝胶中,凝胶使得管竖直，蛋白质溶液与凝胶接触。

含有沉淀剂的溶液被倒在凝胶上,整个装置被保存于封闭的盒子以防蒸发。

沉淀剂通过凝胶和毛细管的扩散时间可以由毛细管插入凝胶的深度控制，从而蛋白质溶液中即可形成过饱和区域，毛细管底部高而顶部低。

这也可作为一个筛选最佳结晶条件的额外信息。

1.1.3 蒸气扩散（Vapor Diffusion)1。

蛋白质提取与纯化技术

蛋⽩质提取与纯化技术蛋⽩质提取与纯化技术选择材料及预处理以蛋⽩质和结构与功能为基础，从分⼦⽔平上认识⽣命现象，已经成为现代⽣物学发展的主要⽅向，研究蛋⽩质，⾸先要得到⾼度纯化并具有⽣物活性的⽬的物质。

蛋⽩质的制备⼯作涉及物理、化学和⽣物等各⽅⾯知识，但基本原理不外乎两⽅⾯。

⼀是得⽤混合物中⼏个组分分配率的差别，把它们分配到可⽤机械⽅法分离的两个或⼏个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；⼆是将混合物置于单⼀物相中，通过物理⼒场的作⽤使各组分分配于来同区域⽽达到分离⽬的，如电泳，超速离⼼，超滤等。

在所有这些⽅法的应⽤中必须注意保存⽣物⼤分⼦的完整性，防⽌酸、硷、⾼温，剧烈机械作⽤⽽导致所提物质⽣物活性的丧失。

蛋⽩质的制备⼀般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、⼲燥和保存。

微⽣物、植物和动物都可做为制备蛋⽩质的原材料，所选⽤的材料主要依据实验⽬的来确定。

对于微⽣物，应注意它的⽣长期，在微⽣物的对数⽣长期，酶和核酸的含量较⾼，可以获得⾼产量，以微⽣物为材料时有两种情况：（1）得⽤微⽣物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利⽤菌体含有的⽣化物质，如蛋⽩质、核酸和胞内酶等。

植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和⽣长发育状况不同，其中所含⽣物⼤分⼦的量变化很⼤，另外与季节性关系密切。

对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进⾏绞碎、脱脂等处理。

另外，对预处理好的材料，若不⽴即进⾏实验，应冷冻保存，对于易分解的⽣物⼤分⼦应选⽤新鲜材料制备。

蛋⽩质的分离纯化⼀，蛋⽩质（包括酶）的提取⼤部分蛋⽩质都可溶于⽔、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋⽩质则溶于⼄醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采⽤不同溶剂提取分离和纯化蛋⽩质及酶。

（⼀）⽔溶液提取法稀盐和缓冲系统的⽔溶液对蛋⽩质稳定性好、溶解度⼤、是提取蛋⽩质最常⽤的溶剂，通常⽤量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋⽩质的溶解。

蛋白质结晶

1.3 结晶方法(Crystallization Techniques)1.3.1 分批结晶(Batch Crystallization) 这是最老的最简单的结晶方法，其原理是同步地在蛋白质溶液中加入沉淀剂，立即使溶液达到一个高过饱和状态。

幸运的话，不需进一步处理即可在过饱和溶液中逐渐长出晶体。

一个用于微分批结晶的自动化系统已被Chayen等人设计出（1991，1992），其微分批方法中，他们在1-2μl包含蛋白质和沉淀剂的液滴中生长晶体。

液滴被悬浮在油（如石蜡）中，油的作用是作为封层以防止蒸发，它并不干扰普通沉淀剂，但是干扰能溶解油的有机溶剂(Chayen, 1997; see also Chayen, 1998)。

1.3.2 液-液扩散(Liquid–Liquid Diffusion) 这种方法中，蛋白质溶液和含有沉淀剂的溶液是彼此分层在一个有小孔的毛细管中，一个测熔点用的毛细管一般即可（如图1.2）。

下层是密度大的溶液，例如浓硫酸铵或PEG溶液。

如果有机溶剂如MPD被用作沉淀剂，它会在上层。

以1：1混合，沉淀剂的浓度应该是所期最终浓度的二倍。

两种溶液（各自约5μl）通过注射器针头导入毛细管，先导入下层的。

通过一个简易的摇摆式离心机去除气泡。

再加入上层，进而两层之间形成一个明显的界面，它们会逐渐彼此扩散。

Garc´?a-Ruiz and Moreno （1994）已经发展液-液扩散技术至针刺法。

蛋白质溶液通过毛细力被吸入狭窄的管中，管的一端是封闭的。

接着，开放端被插入置于小容器的凝胶中，凝胶使得管竖直，蛋白质溶液与凝胶接触。

含有沉淀剂的溶液被倒在凝胶上，整个装置被保存于封闭的盒子以防蒸发。

沉淀剂通过凝胶和毛细管的扩散时间可以由毛细管插入凝胶的深度控制，从而蛋白质溶液中即可形成过饱和区域，毛细管底部高而顶部低。

这也可作为一个筛选最佳结晶条件的额外信息。

1.3.3 蒸气扩散（Vapor Diffusion）1.3.3.1 悬滴法（The Hanging Drop Method）这种方法中，在一个硅化的显微镜盖玻片上通过混合3-10μl蛋白质溶液和等量的沉淀剂溶液来制备液滴。

蛋白纯化课件ppt

5. 收集洗脱液并进行检测，确定蛋白质的纯度和浓度。
6. 对实验结果进行分析和总结。
实验操作流程
实验前准备
确保实验器材和试剂的清洁和完好，准备好实验记录本。
样品处理
将蛋白质样品加入离心机中进行离心分离，收集上清液。
层析分离
使用注射器将上清液注入层析柱中，根据蛋白质的性质选择合适的洗脱液进行洗脱。
3
食品加工技术优化
研究食品加工过程中蛋白质的变化和作用，优化加工工艺。
环境监测领域
污染物的生物标志物
纯化特定环境污染物结合的蛋白，作为污染物存在的生物标志物。
生态毒理学研究
纯化环境中的毒性蛋白，研究其对生态系统的影响和作用机制。
生态修复与治理
利用纯化的微生物降解酶，研究环境修复和治理的新方法。
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应用
凝胶过滤法常用于分离纯化蛋白质、酶、核酸等生物大分子，尤其适用于分离分子量相近的蛋白质或多肽。
CHAPTER 03
蛋白纯化的步骤
样品准备
样品来源
选择合适的生物样品，如细胞、组织或培养液，确保样品中目标蛋白的含量较高。
细胞破碎
采用物理或化学方法破碎细胞，释放细胞内的蛋白质。
去除杂质
通过离心、过滤等方法去除细胞碎片、颗粒物等杂质。
粗分离
离心分离
根据蛋白质的密度和大小差异，采用离心法进行初步分离。
沉淀与溶解
通过调节溶液的pH值、离子强度或添加有机溶剂，使蛋白质沉淀，再通过溶解将蛋白质重新溶解在适宜的缓冲液中。
凝胶电泳分离
利用电泳技术将蛋白质在凝胶上进行分离，根据蛋白质的电荷和大小进行分离。

蛋白质理化性能与纯化

03
不可逆沉淀
蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰
大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收；蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，可以对蛋白质进行定性鉴定和定量测定。
蛋白质经水解后产生茚三酮反应蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应(ninhydrin reaction) 。
离子交换色谱（ion exchange chromatography, IEC)；凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析(molecular sieve filtration)或体积排阻色谱（ steric exclusion chromatography）；疏水相互作用色谱（ Hydrophobic Interaction Chromatography ，HIC ）；亲和色谱（Affinity Chromatography，AFC)。
将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。
免疫沉淀法（immunoprecipitation)
利用荷电性质可将蛋白质采用
蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。
离心机和离心沉降法分离蛋白质
分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成
测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基
把肽链水解成片段，分别进行分析
测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法
一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。

蛋白分析结晶实验报告

一、实验目的1. 了解蛋白质结晶的基本原理和方法。

2. 掌握蛋白质结晶的实验操作技巧。

3. 分析蛋白质结晶过程中的影响因素。

二、实验原理蛋白质结晶是指蛋白质分子在溶液中从液态转变为固态的过程。

蛋白质结晶实验的原理是利用蛋白质在特定条件下，如低温、高盐、有机溶剂等，溶解度降低，从而析出晶体。

本实验通过蛋白质结晶实验，观察蛋白质在不同条件下的结晶现象，分析影响蛋白质结晶的因素。

三、实验材料1. 蛋白质样品：鸡蛋清蛋白、牛血清白蛋白等。

2. 试剂：硫酸铵、氯化钠、乙醇、异丙醇等。

3. 仪器：烧杯、玻璃棒、冰浴、显微镜、离心机等。

四、实验步骤1. 准备实验材料：将蛋白质样品溶解于适量蒸馏水中，制成蛋白质溶液。

2. 硫酸铵沉淀法：（1）将蛋白质溶液加入一定浓度的硫酸铵溶液，搅拌均匀。

（2）将混合溶液置于冰浴中，使温度降至0～4℃。

（3）观察蛋白质结晶现象，记录结晶时间。

（4）离心分离蛋白质晶体，洗涤、干燥。

3. 氯化钠沉淀法：（1）将蛋白质溶液加入一定浓度的氯化钠溶液，搅拌均匀。

（2）将混合溶液置于冰浴中，使温度降至0～4℃。

（3）观察蛋白质结晶现象，记录结晶时间。

（4）离心分离蛋白质晶体，洗涤、干燥。

4. 有机溶剂沉淀法：（1）将蛋白质溶液加入一定浓度的有机溶剂（如乙醇、异丙醇等），搅拌均匀。

（2）将混合溶液置于冰浴中，使温度降至0～4℃。

（3）观察蛋白质结晶现象，记录结晶时间。

（4）离心分离蛋白质晶体，洗涤、干燥。

五、实验结果与分析1. 实验结果：（1）硫酸铵沉淀法：蛋白质在硫酸铵溶液中结晶速度较快，结晶形态良好。

（2）氯化钠沉淀法：蛋白质在氯化钠溶液中结晶速度较慢，结晶形态较差。

（3）有机溶剂沉淀法：蛋白质在有机溶剂中结晶速度较慢，结晶形态较差。

2. 分析：（1）硫酸铵浓度对蛋白质结晶的影响：随着硫酸铵浓度的增加，蛋白质结晶速度加快，结晶形态良好。

（2）温度对蛋白质结晶的影响：低温条件下，蛋白质结晶速度加快，结晶形态良好。

蛋白质分离纯化的一般程序

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。

所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。

常用的破碎组织细胞的方法有：1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。

常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。

2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。

3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。

这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。

4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。

5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。

(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。

抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。

如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。

在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。

（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。

比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。

常用的有下列几种方法：1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。

2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。

被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。

3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。

能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。

此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。

由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。

蛋白质纯化和结晶分析

蛋白质纯化和结晶分析蛋白质是构成生命体的基本物质之一，具有重要的生命功能，如催化反应、传递信息、支持结构等。

因此，在研究生物学、医学以及许多跨学科领域时，对蛋白质进行研究是至关重要的。

而了解蛋白质的结构、功能以及活性等属性则需要进行蛋白质纯化和结晶分析。

蛋白质纯化是指从混合物中分离、提取出目标蛋白质的过程。

纯化过程的目的是获得高纯度的蛋白质，以便进行后续的研究。

对于蛋白质的纯化过程，一般采取多步骤的方法，包括萃取、沉淀、分离、层析、电泳等技术。

在纯化过程中，常会伴随着一些质量损失、低收率等情况的出现。

而纯化效率的提高，则需要结合多种手段，如优化条件、选择合适的试剂、提高检测灵敏度等。

萃取法是将蛋白质从混合物中提取出来的一种方法。

常见的蛋白质萃取方法包括溶液抽提、盐析、有机溶剂萃取等。

其中溶液抽提是一种常用且较为简单的方法，其原理是利用物质的相溶性差异将蛋白质萃取出来。

盐析法则是利用试剂的不同导致蛋白质在不同的环境中溶解度的变化而进行的萃取法，有机溶剂萃取法则是利用有机溶剂将蛋白质脱离非蛋白质成分，使其得以萃取出。

除了萃取法外，沉淀法也是一种较常用的蛋白质纯化方法。

它是利用试剂与蛋白质形成复合物，在离心的过程中将蛋白质沉淀出来的方法。

在选择沉淀试剂时，需要考虑其对目标蛋白质的亲和力，以及是否与试剂中的其他组分发生相互作用导致混淆。

此外，在离心过程中也需要注意力度及时间等因素的掌控，确保沉淀可以有效分离出来。

层析法是一种常用的蛋白质分离方法，其原理是根据物质相互作用在分子间进行分离。

一般采用的分离方法有尺寸排除层析、离子交换层析、亲和层析、逆相层析、亲水层析等。

在层析过程中，选择合适的分离材料，控制流速、载荷量以及pH等条件对保证层析分离质量十分关键。

电泳法是一种利用电场使带电分子在电极间移动的技术，可用于聚合物的分离与检测。

根据电泳作用原理，可以分为凝胶电泳和毛细管电泳两种。

其中凝胶电泳又包括聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酸凝胶电泳、聚碳酸酯凝胶电泳等。

蛋白纯化结晶的原理

蛋白纯化结晶的原理蛋白纯化结晶是一种常用的生物化学技术，可以将复杂的混合蛋白溶液中的目标蛋白分离出来，并获得高纯度的结晶样品。

蛋白结晶技术在蛋白质结构解析、药物发现等领域发挥着重要作用。

下面将详细介绍蛋白纯化结晶的原理和步骤。

蛋白纯化结晶的原理基于蛋白质溶液中蛋白分子间的相互作用。

在溶液中，蛋白分子通过水合作用和静电相互作用等力学方式组装成悬浮的胶束。

当溶液中的溶质浓度超过饱和度时，即可形成稳定的蛋白晶体。

蛋白纯化结晶的步骤可以分为四个阶段：前处理、结晶条件筛选、结晶生长和收集结晶。

首先是前处理阶段。

这个阶段的目的是将蛋白从其它杂质中分离出来，并保持其稳定性。

通常使用各种蛋白质纯化技术，如柱层析、过滤和离心等方法，在溶液中获得目标蛋白。

接下来是结晶条件筛选阶段。

这个阶段的目的是通过试验不同的结晶条件，筛选出适合目标蛋白结晶的条件。

常用的结晶条件包括温度、pH值、溶液浓度和添加剂等。

将目标蛋白溶液与不同的试剂按一定比例混合，然后在不同的温度和pH条件下进行试验。

通过调整试验条件，找到适合目标蛋白结晶的最佳条件。

然后是结晶生长阶段。

在这个阶段，目标蛋白在结晶试剂的影响下，逐渐从胶束中聚集并排列成晶体。

结晶的生长过程通常需要较长时间，需要人工观察和控制。

为了加速结晶的生长过程，可以通过添加种晶试剂或使用模板等方法来引导结晶。

最后是收集结晶阶段。

当蛋白结晶生长到一定大小后，可以通过过滤、离心等方法将其与溶液分离。

收集到的结晶样品可以进行进一步的分析和研究，如X射线晶体学分析等。

蛋白纯化结晶的成功与否受到许多因素的影响。

首先，目标蛋白的纯度和稳定性对结晶的成功至关重要。

纯度越高，结晶过程越容易进行。

其次，结晶条件的筛选需要经验和技术，不同的蛋白质可能有不同的最佳结晶条件。

此外，溶液的温度、pH值和添加剂等因素也会影响结晶的成功率。

总结起来，蛋白纯化结晶的原理是通过溶液中蛋白分子间的相互作用，通过前处理、结晶条件筛选、结晶生长和收集结晶等步骤，将目标蛋白从混合溶液中分离出来并获得高纯度的结晶样品。

蛋白质结晶的基本原理与技术路线

蛋白质结晶的基本原理与技术路线蛋白质是生命体中必不可少的物质。

它们参与了生命的各个方面，例如代谢、信号传导、结构支持、运动、抵御病原体等等。

因此，研究蛋白质的结构和功能，对于理解生命以及开发药物等方面都有着非常重要的意义。

而蛋白质结晶则是研究蛋白质结构的关键步骤之一。

本文将从蛋白质结晶的基本原理和技术路线两个方面来探讨这一重要的课题。

一、蛋白质结晶的基本原理蛋白质结晶是将蛋白质分子在水溶液中进行纯化、分析和结构解析的关键步骤。

它是微观世界和宏观世界之间的桥梁，通过静态的晶体来反应蛋白质分子在三维空间中的结构。

蛋白质结晶的基本原理涉及到三个方面：分子的空间对称性，分子的表面亲和性和溶液内物质间的相互作用。

1. 分子的空间对称性在蛋白质分子的构成中，氨基酸是构成蛋白质最基本的元素。

因此，蛋白质的结晶也涉及到氨基酸的结构。

氨基酸分子含有一定的空间对称性，通常是所谓的手性对称性，也称为左旋或右旋。

这种手性对称性会影响氨基酸和蛋白质分子在水溶液中的结构。

2. 分子的表面亲和性在水溶液中，蛋白质分子的表面通常带有一些电荷，这些电荷会影响分子与其它分子的相互作用。

因此，分子的表面亲和性是影响蛋白质结晶的另一个重要原因。

3. 溶液内物质间的相互作用蛋白质结晶是在水溶液中进行的，所以水中的其它物质也会对蛋白质结晶产生影响。

例如，溶液中的钾离子可以与蛋白质分子的氨基酸残基进行离子键结合，从而影响结晶。

二、蛋白质结晶的技术路线蛋白质结晶是一项艰苦的工作。

要想获得高质量的晶体，通常需要经过多个步骤的优化。

下面是一般蛋白质结晶技术的大致流程。

1. 蛋白质纯化首先，需要从生物体的组织或细胞中分离出含有目标蛋白质的组分。

这个步骤通常需要采用多种手段，例如离心、过滤、层析等等。

目的是将目标蛋白质从组织或细胞的其它成分中分离出来，并将其纯化到一定程度。

2. 结晶试剂筛选将目标蛋白质加入到结晶试剂中，通常采用盐类、缓冲液、聚乙二醇（PEG）和脂肪酸等物质来促进结晶。

蛋白质纯化与结晶的原理

蛋白质纯化与‎结晶的原理获得蛋白质的‎晶体结构的第‎一个瓶颈，就是制备大量‎纯化的蛋白质‎(>10 mg)，其浓度通常在‎10 mg/ml 以上，并以此为基础‎进行结晶条件‎的筛选。

运用重组基因‎的技术，将特定基因以‎选殖(clone)的方式嵌入表‎现载体(expres‎s ion vector‎)内，此一载体通常‎具有易于调控‎的特性。

之后再将带有‎特定基因的载‎体送入可快速‎生长的菌体中‎，如大肠杆菌(Escher‎i chia coli)，在菌体快速生‎长的同时，也大量生产表‎现载体上的基‎因所解译出之‎蛋白质。

一般而言纯度‎越高的蛋白质‎比较有机会形‎成晶体，因此纯化蛋白‎质的步骤就成‎为一个重要的‎决定因素。

在取得高纯度‎的蛋白质溶液‎后，接下来就是晶‎体的培养。

蛋白质晶体与‎其他化合物晶‎体的形成类似‎，是在饱和溶液‎中慢慢产生的‎，每一种蛋白质‎养晶的条件皆‎有所差异，影响晶体形成‎的变量很多，包含化学上的‎变量，如酸碱度、沈淀剂种类、离子浓度、蛋白质浓度等‎；物理上的变数‎，如溶液达成过‎饱和状态的速‎率、温度等；及生化上的变‎数，如蛋白质所需‎的金属离子或‎抑制剂、蛋白质的聚合‎状态、等电点等，皆是养晶时的‎测试条件。

截至目前为止‎，并无一套理论‎可以预测结晶‎的条件，所以必须不断‎测试各种养晶‎溶液的组合后‎，才可能得到一‎颗完美的单一‎晶体(图一) 。

蛋白质晶体的‎培养，通常是利用气‎相扩散法(Vapor Diffus‎i on Method‎)的原理来达成‎；也就是将含有‎高浓度的蛋白‎质(10-50 mg/ml)溶液加入适当‎的溶剂，慢慢降低蛋白‎质的溶解度，使其接近自发‎性的沈淀状态‎时，蛋白质分子将‎在整齐的堆栈‎下形成晶体。

举例来说，我们将蛋白质‎溶于低浓度(~1.0 M) 的硫酸铵溶液‎中，将它放置于一‎密闭含有高浓‎度(~2.0 M)硫酸铵溶液的‎容器中，由气相平衡，可以缓慢提高‎蛋白质溶液中‎硫酸铵的浓度‎，进而达成结晶‎的目的(图二)。

蛋白质分离纯化和蛋白质结晶的研究方法_姚知渊

2009年10月企业技术开发蛋白质分离纯化和蛋白质结晶的研究方法姚知渊１，周浩鹏２，周静舫３(1.临沂出入境检验检疫局,山东临沂250100;2.菏泽学院,山东菏泽274000;3.华中农业大学食品科技学院,湖北武汉430070)Studies on separation and purification crystallization of proteinYAO Zhi-yuan 1,ZHOU Hao-peng 2,ZHOU Jing-fang 3（１．ＴｅｃｈｎｉｃａｌＣｅｎｔｒｅｏｆＡｎｉｍａｌａｎｄＰｌａｎｔＱｕａｒａｎｔｉｎｅＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎ，Ｌｉｎｙｉ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ２５０１００，Ｃｈｉｎａ；ＨｅｚｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｚｅ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ２７４０００，Ｃｈｉｎａ；ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ，Ｈｕｂｅｉ４３００７０，Ｃｈｉｎａ）Abstract:In this paper,it summarized the various principles and methods of protein separation and purification,andintroduced the methods and factors of protein crystallization at the same time.Keywords ：protein;separation;purification;crystallization摘要：文章主要对蛋白质的分离纯化的各种原理和方法作了简要的概述，同时简单的介绍了蛋白质结晶的方法及影响因素。

关键词：蛋白质;分离纯化;结晶中图分类号：Q51文献标识码：A文章编号：1006-8937（2009）19-0046-03收稿日期：2009-07-11作者简介：姚知渊(1983-)，男，山东威海人，大学本科，科员，研究方向：动植物检疫。

蛋白质絮凝原理的应用

蛋白质絮凝原理的应用
蛋白质的絮凝是指蛋白质分子之间的相互作用使其聚集形成团块、凝集物或沉淀物的过程。

蛋白质絮凝原理的应用主要包括以下几个方面：
1. 蛋白质纯化：利用不同蛋白质间的分子间吸引力或斥力来分离目标蛋白质。

例如，离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。

2. 活性蛋白的检测：利用凝胶电泳、西方印迹等方法，观察蛋白质间的凝集作用，来检测活性蛋白的存在和数量。

3. 蛋白质药物的研发：利用蛋白质的结晶技术，了解蛋白质间的相互作用，从而研发出对应的蛋白质药物。

4. 食品加工：在食品制造中，蛋白质通常作为乳化剂、稳定剂、结构剂等添加剂，利用蛋白质的絮凝作用来改善产品的质量和口感。

5. 生物技术应用：在生物技术领域，蛋白质的絮凝可用于分离纯化细胞培养物中的细胞和蛋白质，从而制备细胞外基质和细胞膜蛋白。

有机溶剂沉淀法分离与纯化蛋白质

有机溶剂沉淀法分离与纯化蛋白质有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法，称“有机溶剂分段沉淀法”，它常用于蛋白质或酶的提纯。

使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。

高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。

由此法析出的沉淀一般比盐析容易过滤或离心沉降，分离后的蛋白质沉淀，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度。

操作时的pH值大多数控制在待沉淀蛋白质的等电点附近，有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性，提高分离的效果，在有机溶剂中添加中性盐的浓度为0.05mol/L左右，中性盐过多不仅耗费有机溶剂，可能导致沉淀不好。

沉淀的条件一经确定，就必须严格控制，才能得到可重复的结果。

有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度表示。

有机溶剂沉淀蛋白质分辨力比盐析法好，溶剂易除去；缺点是易使酶和具有活性的蛋白质变性。

故操作时要求条件比盐析严格。

对于某些敏感的酶和蛋白质，使用有机溶剂沉淀尤其要小心。

有机溶剂沉淀法溶剂的选择原则就是：与水可以混溶，不与蛋白反应，沉淀效应良好，无毒等。

一般就是乙醇丙酮。

方法就是调节适当的pH，pH调节适当会使沉淀效果好很多，等电点附近比较好。

加入前将有机溶剂低温处理，缓慢加入，边加边缓慢搅拌（可以冰浴），静置15min后离心。

蛋白溶液浓度不要太低，否则蛋白容易变性，5mg/ml以上吧。

一般加丙酮的话，体积百分含量20~50%即可。

至于加盐的话，可以在加有机溶剂前加入，浓度不要太大，否则如你所说，沉淀太猛，失去分级的效果。

如果加NaCl，浓度0.05mol/L左右即可。

固相析出分离法改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术称为固相析出分离法。

析出物为晶体时称为结晶；析出物为无定形固体称为沉淀法。

蛋白结晶的原理悬滴

蛋白结晶的原理悬滴
蛋白质结晶是将溶解于水或其他溶剂中的蛋白质逐渐浓缩并达到饱和状态后，在给定条件下实现蛋白质分子在三维空间中高度有序排列形成结晶体的过程。

蛋白结晶的原理悬滴主要包括以下几个步骤：
1. 准备蛋白质溶液：将纯化得到的蛋白质溶解在适当的缓冲液中，通常需要调整pH值和离子强度以优化结晶条件。

2. 控制结晶试剂：在溶液中加入一定浓度的结晶试剂，如盐类、缓冲液、有机溶剂等，以调节蛋白质的溶解度和结晶速率。

3. 形成结晶滴：将蛋白质溶液与结晶试剂按照一定比例混合，通常采用悬滴法，即将蛋白质溶液和结晶试剂分别用微量注射器吸取，再将两者滴于一块平台上，使得两者混合。

4. 控制结晶条件：控制结晶滴的温度、湿度和通风情况，以及结晶滴的容器和封闭方式，使得溶液逐渐蒸发，形成高浓缩的蛋白质溶液，促使蛋白质分子之间发生相互作用，逐渐形成结晶。

5. 结晶生长：随着溶液的蒸发和结晶滴的冷却，蛋白质分子通过空间排列和相互作用逐渐形成结晶核，并在核的基础上生长壮大，最终形成可见的蛋白质结晶。

需要注意的是，蛋白质结晶是一个复杂的过程，往往需要通过试验和经验优化结晶条件，以获得高质量的结晶体。

蛋白质结晶方法大总结

蛋白质结晶方法大总结1.1结晶方法(Crystallization Techniques)1.1.1 分批结晶(Batch Crystallization) 这是最老的最简单的结晶方法，其原理是同步地在蛋白质溶液中加入沉淀剂，立即使溶液达到一个高过饱和状态。

幸运的话，不需进一步处理即可在过饱和溶液中逐渐长出晶体。

一个用于微分批结晶的自动化系统已被Chayen等人设计出（1991，1992），其微分批方法中，他们在1-2μl包含蛋白质和沉淀剂的液滴中生长晶体。

液滴被悬浮在油（如石蜡）中，油的作用是作为封层以防止蒸发，它并不干扰普通沉淀剂，但是干扰能溶解油的有机溶剂(Chayen, 1997; see also Chayen, 1998)。

1.1.2 液-液扩散(Liquid–Liquid Diffusion) 这种方法中，蛋白质溶液和含有沉淀剂的溶液是彼此分层在一个有小孔的毛细管中，一个测熔点用的毛细管一般即可（如图1.2）。

下层是密度大的溶液，例如浓硫酸铵或PEG溶液。

如果有机溶剂如MPD被用作沉淀剂，它会在上层。

以1：1混合，沉淀剂的浓度应该是所期最终浓度的二倍。

两种溶液（各自约5μl）通过注射器针头导入毛细管，先导入下层的。

通过一个简易的摇摆式离心机去除气泡。

再加入上层，进而两层之间形成一个明显的界面，它们会逐渐彼此扩散。

Garc´?a-Ruiz and Moreno（1994）已经发展液-液扩散技术至针刺法。

蛋白质溶液通过毛细力被吸入狭窄的管中，管的一端是封闭的。

接着，开放端被插入置于小容器的凝胶中，凝胶使得管竖直，蛋白质溶液与凝胶接触。

含有沉淀剂的溶液被倒在凝胶上，整个装置被保存于封闭的盒子以防蒸发。

沉淀剂通过凝胶和毛细管的扩散时间可以由毛细管插入凝胶的深度控制，从而蛋白质溶液中即可形成过饱和区域，毛细管底部高而顶部低。

这也可作为一个筛选最佳结晶条件的额外信息。

1.1.3 蒸气扩散（Vapor Diffusion）1.1.3.1 悬滴法（The Hanging Drop Method）这种方法中，在一个硅化的显微镜盖玻片上通过混合3-10μl蛋白质溶液和等量的沉淀剂溶液来制备液滴。

蛋白质的表达纯化及结晶

2.3.2.2 蛋白质表达、纯化（1）初始种子培养：挑取阳性克隆到10 mL的含有Amp抗生素的液体LB培养基中，在37℃过夜振荡培养。

（2）扩大培养：将初始种子接入1 L含抗生素的液体培养基中，37℃振荡培养至菌浓OD600为0.6-0.8时，降温至15℃或20℃；一个小时后加入终浓度为0.6 mM的IPTG，并诱导表达过夜。

（3）收集菌体：于4200 rpm，4℃下离心15 min，弃去上清，收获菌体；加入重悬溶液（25 mM Tris-HCl pH8.0，100 mM NaCl），悬浮菌体细胞；细胞破碎前加入终浓度为2 mM的蛋白酶抑制剂PMSF（Phenylmethyl sulfonyl fluoride，苯甲酸磺酰氟）。

（4）超声破碎细胞：400W下，超声3s，间隔6s，工作60次。

（5）超速离心：细胞裂解液于14000 rpm，4℃下离心50 min，收集上清液，进行下一步的分离纯化。

（6）Ni-NTA亲和层析：将上清液体倒入Ni-NTA柱中。

流净后，用wash buffer （25 mM Tris-HCl pH8.0，100 mM NaCl，15 mM imidazole）冲洗10个柱体积，除去杂蛋白；最后使用elution buffer（25 mM Tris-HCl pH8.0，100 mM NaCl，250 mM imidazole）将目的蛋白洗脱下来。

使用SDS-PAGE检测蛋白的可溶性、挂柱效率及蛋白的浓度。

由于本实验中YdiV等蛋白都是连接到pGl01载体中，带有可以用PPase切除的6×His标签。

为了获得更纯净的、不带标签的蛋白，我们在有那个wash buffer冲洗去除杂蛋白以后，每根镍柱中加入5 ml的重悬缓冲液然后加入100-200 μL的PPase，3-5 h后，用5 ml重选冲洗柱子，电泳检测酶切效率。

（7）阴离子交换层析纯化：先平衡离子交换柱。

然后将上一步洗脱下的蛋白用溶液A（25 mM Tris-HCl, pH8.0）稀释4-6倍，上样到离子交换柱Source Q上，使用溶液A与溶液B（25mM Tris-HCl pH8.0，1M NaCl）进行线性梯度洗脱。

蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法

蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法文章出处：朱敏蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度降低。

有机溶剂与水作用能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。

常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，由于有机溶剂的加入易引起变性失活，尤其乙醇和水混合释放热量，操作一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过大。

用此法所析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降。

分离后的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。

操作时的pH 值大多数控制在待沉淀蛋白质等电点附近。

有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性和提高分离的效果。

一般在有机溶剂沉淀时添加中性盐的浓度在0.05mol 左右, 过多不仅耗费有机溶剂, 而且可能导致沉淀不好. 沉淀的条件一经确定, 就必须严格控制, 才能得到重复性结果. 有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度素示. 故操作条件比盐析法严格。

许多有机溶剂，如碳链较长的醇，它溶于水，但有限度。

其量大到一定程度后则分成两相，一相以水为主，一相以有机溶剂为主。

某些第3组分的存在可以改变两相的比例和组成。

有许多蛋白质在两相中均能溶解，形成分配。

在同一个两相的溶剂系统中，不同的蛋白质有不同的分配系数。

根据这一原理，操作全部机械化的有逆流分溶。

因要求实验室温度恒定且操作也繁杂，虽一直有人在用但很不普遍。

分配层析也是应用这一原理，但在分离纯化蛋白质工作中用得不多，主要是因为多数蛋白质在有机溶剂中，特别是在易与水分相的溶剂中溶解度小且易变性。

疏水层析是近年发展的新方法。

它利用蛋白质表面有一部分疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。

洗脱时将盐浓度逐渐降低，蛋白质因疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化。