中国医学高校创新性机能实验设计大赛一等奖作品_神经干动作电位不应期的定量分析_沈建新江玲20170719

●实验题目神经干动作电位不应期的定量分析●实验目的1、熟练掌握常规坐骨神经干标本的制备2、理解并掌握确定神经干动作电位最适刺激强度的方法3、理解并掌握神经干动作电位不应期定量分析的实验设计原理4、理解并掌握神经干动作电位不应期定量分析的数据采集方案及数据的处理分析流程5、较准确获得神经干动作电位不应期的真正定量分析结果●实验仪器1、蛙类常用手术器械和相关物品一套：包括大方盘，蛙板，粗剪刀，眼科剪，止血钳，小镊子，有齿镊子，毁髓针，玻璃分针，锌铜弓；肾形盘，培养皿，滴管，槽钉，尺子，丝线；小饭盆，小烧杯；任氏液，手套等。

（图1 和图2）图1. 神经干动作电位不应期的定量分析实验场景全景图图2. 神经干动作电位不应期的定量分析之手术器械和相关物品实物图2、神经干标本屏蔽盒：至少包括5根电极，具体为刺激电极两根S1（+）和S2（-），接地电极一根E, 记录电极两根R1（记录电极）和R2 （参比电极）。

（图3）图3. 神经干标本屏蔽盒电极连接示意图（左）和实物图（右）：S1为刺激电极正极，S2为刺激电极负极，E为接地电极，R1为记录电极，R2为参比电极，Ch1表示信号输入的第一通道。

3、多媒体电脑一套：普通配置即可4、生物机能实验系统一套（本实验设计使用的是BL-420F）:包括软件系统和输入输出盒，前者安装于电脑中，后者含电源线、与电脑连接的USB线、与神经标本盒的信号连接线（一端可与生物机能实验系统的输入通道孔相接；另一端与神经标本盒的电极相接, 共有三个接头：外包屏蔽网和地线接头（黑色接头），中间是信号输入的正负极两根导线和两个接头（白色和红色接头），分别与两根记录电极R1和R2相接）和刺激线（一端可与生物机能实验系统的刺激输出孔相接；另一端共有两个接头，分正负极，可与神经标本盒的刺激电极S1和S2相接，靠近记录电极一侧为负极）各一根。

（图4）图4. 神经标本盒与生物机能实验系统的连接实物图5、Office软件一套: 2003版或更高版本，其中的EXCEL可启用宏编程功能。

实验动物（描述手术过程）青蛙（或蟾蜍）一只，按常规方法制备坐骨神经干标本，简要过程如下：1、动物抓拿与清洗（在水龙头下进行清洗，可用纱布包裹上肢以下躯干部位，有利于抓拿时防滑）；2、找准枕骨大孔（图5）并将毁髓探针刺入椎管（可用食指控制毁髓探针刺入深度，防止穿过椎骨）；图5. 蛙枕骨大孔位置示意图3、横断脑和脊髓连接处（探针尖端轻贴椎管腔腹侧，左右划几下即可）；4、捣毁脑（探针在椎管内向头端伸入颅腔反复搅动几下即可）；5、捣毁脊髓（探针在椎管内向尾端伸入椎管腔反复搅动几下即可；一般可见蛙的两个后肢突然完全绷直，之后完全松软，此为毁髓成功的典型标志）；6、髂关节以上约1cm处剪断脊柱（抓握两个后肢，用粗剪刀适当用力剪断）；7、去除上部躯干和内脏（抓握两个后肢，利用重力使上部躯干和内脏自然下垂，用粗剪刀剪去，注意不要伤到腹腔段的坐骨神经）；8、剥去下肢皮肤（一手用止血钳避开皮肤横向夹住脊柱断端边缘；另一手则用有齿镊或纱布辅助抓住皮肤断端；双手上下反向适当用力，可褪去下肢皮肤）；9、剪去尾杆骨（用粗剪刀贴着骨头剪，方便下一步一分为二的操作）；10、将余下的标本分成左右两半（用粗剪刀中间剪开，可分成左右两半，后续可制备成两个坐骨神经干标本）；11、腹腔段神经束的游离（用玻璃分针顺着神经的走向划开筋膜和结缔组织，并使神经与血管及结缔组织分开）和结扎（用丝线和镊子在离神经干发出的根部约0.3cm处将坐骨神经干的主干结扎在一起，只保留两个小线头便于后续可用镊子夹取神经干标本即可）;12、大腿段神经束的游离并与腹腔段贯通（用玻璃分针顺着神经干的走向分离，用眼科剪小心剪去神经干的无用分支及横在神经干上方的筋膜和小肌肉如梨状肌等）；13、膝关节处神经束的结扎（本实验的神经干标本有5-6cm长即够用，可不用分离至踝关节处）；14、在两个结外侧剪断神经干,完成标本制备；15、完成的神经干标本放任氏液中浸泡约20分钟后可进行实验记录。

实验操作步骤包括1实验仪器装置的连接，2实验数据的采集和储存，3实验数据的处理分析，4典型实验结果的呈现，共四部分，分述如下：1、实验仪器装置的连接:参见上述图1、3和4及其说明。

其中，S1接刺激输出正极；S2接刺激输出负极；E接生物机能实验系统第一通道输入线地线；R1和R2接生物机能实验系统第一通道输入线的记录电极（白色）和参比电极（红色）。

2、实验数据采集和储存：（1）实验1：刺激强度与坐骨神经干动作电位的关系记录系统基本设置建议为：程控单刺激，波宽0.05ms，刺激强度从0V开始，逐次增加刺激幅度0.05V；实验中观察到神经干动作电位波形保持稳定，不再随刺激强度的增大而变化时即可停止实验记录。

反演所记录的实验数据（实验1的结果可称为“结果1”，其原始记录文件可命名为“1_20170615_01.tme”；表示“2017年6月15日所记录到的第1套实验结果中的第01个文件”），通过刺激强度和双相动作电位负波（向上的波）幅度的关系，可大概确定该标本的最适刺激强度（如1.6V）(参见下文和图9)。

（2）实验2：单刺激所触发的神经干动作电位波形(AP1) 记录以“实验1”的结果为依据，可确定后续实验的刺激强度（如为2V，保证神经干中所有能兴奋的神经纤维都被激活）。

系统基本设置建议为：程控单刺激，波宽0.05ms，单刺激的强度固定于最适强度以上刺激（如2V），重复10次或10次以上。

实验2的结果可称为“结果2”，其原始数据文件命名与实验1统一（如“结果2”的原始记录文件可命名为“1_20170615_02.tme”；表示“2017年6月15日所记录到的第1套实验结果中的第02个文件”）。

结果的处理和分析参见下文，由此可得到单刺激所触发的神经干动作电位平均波形(AP1)。

（3）实验3：不同时间间隔的双刺激所触发的系列神经干动作电位波形（APall）记录每一次双刺激触发的两个动作电位波形称为一个APall波形。

系统基本设置建议为：程控双刺激，双刺激的两个刺激强度及持续时间均与实验2的单刺激的强度及持续时间相同（如强度均为2V，波宽均为0.05ms）；双刺激的两个刺激之间的时间间隔从较大逐次减小到0ms，由程序自动控制；建议起始间隔20ms 或更长, 逐次减小0.5ms （或更小，如0.2 ms；减量越小，最终得到的结果越越精确，但数据的处理和分析的工作量也成倍增加），最终减小到0ms。

实验3的结果可称为“结果3”，其原始数据文件命名与实验1和2统一（如“结果3”的原始记录文件可命名为“1_20170615_03.tme”；表示“2017年6月15日所记录到的第1套实验结果中的第03个文件”）。

APall波形的处理分析详见下文。

注：上述原始数据文件均存于指定目录中，如“\01OriData\control\”中。

3、实验数据的处理分析：这是本实验设计的重要特色、难点和关键所在。

此部分已专门采用EXCEL VBA编程辅助形成实用的操作流程，大致可按如下步骤进行：（1）有效数据的截取：在生物机能实验系统中反演所获得的结果数据，截取其中的有效数据，并重新命名。

如“1_20170615_02.tme”经截取后的有效数据可命名为“1_20170615_02cut.tme”；1_20170615_03.tme”经截取后的有效数据可命名为“1_20170615_03cut.tme”。

上述截取后的有效数据文件均存于指定目录（如“\01OriData\control\”）中。

（2）数据的简单测量和记录：在生物机能实验系统中反演所截取的有效数据，粗略测出第一个动作电位起点所对应的时间点并记录于预先设计好的EXCEL表格中（图6~8）。

图6. 结果2（“1_20170615_02cut.tme”）数据的简单测量图7. 结果3（“1_20170615_03cut.tme”）数据的简单测量图8. 简单测量的数据分别记录于预先设计好的EXCEL表格的相应单元格中（如图中虚线框所示单元格）。

为处理本实验项目的数据，需设计一系列的复杂表格。

上图只是其中的一个小局部。

（3）数据的导出：将截取后的有效数据从生物机能实验系统中分别导出为文本文件（*.txt），如“1_20170615_02cut.tme”可导出为“1_20170615_02cut.txt”，“1_20170615_03cut.tme”可导出为“1_20170615_03cut.txt”。

导出的文件存于指定目录（如“\02Txt\control\”）中。

（4）数据的导入和截分：将*.txt文件分别导入预先设计好的EXCEL表格中，以上述简单测量的数据和神经干动作电位的波形特点为基础，设计相应算法，编制相应程序，对连续记录的神经干动作电位数据按刺激开始的时间对齐并进行截分，使各次刺激所获得的动作电位波形数据相对独立且在时间上一一对应，从而便于后续对动作电位数据进行各种运算。

（从这一步开始的数据处理和分析都可由预先编好的EXCEL VBA程序自动完成）（5）AP1波形和数据的重构：单刺激所触发的神经干动作电位平均波形（AP1）可由多次记录的由单刺激所触发的神经干动作电位波形（结果2数据）叠加平均而得到（参见下文图10C）。

（6）APall波形和数据的重构：APall为不同时间间隔的双刺激所触发的系列神经干动作电位波形（结果3）（原始记录图如图11所示），导入截分后重构的系列波形如图12左列所示。

（7）APall波形和数据的拆分并获得AP2波形：APall波形和数据的拆分是指从APall中去除双刺激中第一个刺激所触发的第一个动作电位波形AP1（图12中列）得到双刺激中第二个刺激所触发的第二个动作电位波形AP2的过程。

在上述（1）到（6）操作的基础上，逐一将每一个APall的数据减去AP1数据，即可得到双刺激中第二个刺激所触发的第二个动作电位的系列波形AP2数据，并在EXCEL表格中重构出所有AP2波形（图12右列）。

（8）AP2数据的处理及神经干动作位不应期的定量分析结果：测出AP1和所有AP2波形的幅度，计算AP2/AP1的系列比值，并作第二个动作电位幅度（AP2）与第一个动作电位幅度（AP1）的比值(AP2/AP1)和对应的双刺激间隔时间（t interval）的关系曲线（可简称为“AP2/AP1- t interval”曲线），通过曲线（该曲线呈长尾S型）可求得较准确的临界双刺激时间间隔（所谓“相对不应期”和“绝对不应期”）。

（图13）上述实验数据的处理和分析过程中，除（1）到（3）三步需手工完成外，其余各步可利用EXCEL中的VBA编程功能自动完成。