单个核细胞的分离
分离单个核细胞的方法
分离单个核细胞的方法
分离单个核细胞是一种常用的实验技术，它可以用于细胞学研究、基因编辑等领域。
以下是一种简单的分离单个核细胞的方法：
1. 将含有细胞的培养皿用生理盐水洗涤一遍，去除培养液和杂质。
2. 用无菌吸管吸取一定数量的细胞悬液，将其移至离心管中。
3. 进行离心，速度一般为1000rpm，离心时间约5分钟。
4. 取出上清液，留下细胞沉淀。
5. 加入适量的胰酶，将细胞沉淀消化，使细胞单元分离开来。
6. 加入适量的培养基，用移液器分别将细胞单元吸取，将其分
别移至含有培养基的微型离心管中。
7. 进行离心，速度为1000rpm，离心时间约5分钟。
8. 取出上清液，留下单个核细胞沉淀。
以上就是一种简单的分离单个核细胞的方法，需要注意的是，实验过程中需要保持操作环境无菌，确保实验结果的准确性和可靠性。
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ficoll分离液分离外周血单个核细胞操作原理
ficoll分离液分离外周血单个核细胞操作原理一、前言外周血单个核细胞是指没有细胞核的血细胞，如红细胞、血小板等。
分离外周血单个核细胞是许多实验室和临床诊断中常用的一项操作。
而ficoll分离液则是分离外周血单个核细胞时常用的一种试剂。
本文将详细介绍ficoll分离液的原理及其在分离外周血单个核细胞中的应用。
二、ficoll分离液1. 概述ficoll分离液是由Ficoll（Ficoll-400）和盐水（PBS或Hanks平衡盐溶液）组成的一种密度梯度试剂。
它主要用于体外培养、淋巴细胞和其他白细胞的分离。
2. 原理ficoll分离液利用了不同密度的细胞在密度梯度中沉降速度不同的原理。
在密度梯度中，密度大的物质沉降速度快，而密度小的物质沉降速度慢。
当样品加入到ficoll分离液中时，样品中含有不同密度的各种成分，如红细胞、白细胞、淋巴细胞等。
这些成分会在密度梯度中沉降，最终形成一个由不同密度的层次组成的梯度。
在ficoll分离液中，Ficoll-400的密度大于外周血单个核细胞，但小于红细胞和粒细胞。
当样品经过离心后，外周血单个核细胞会沉降到ficoll分离液中的某一层次中，并被分离出来。
而其他成分则会沉降到不同的层次中。
3. 优点ficoll分离液具有以下优点：（1）样品处理方便：只需要将样品加入到ficoll分离液中进行离心即可。
（2）操作简单：只需要进行一次离心即可将外周血单个核细胞从其他成分中分离出来。
（3）高效：能够快速、高效地将外周血单个核细胞分离出来。
三、操作原理1. 实验材料（1）ficoll分离液；（2）外周血样本；（3）PBS或Hanks平衡盐溶液；（4）15ml或50ml的锥形试管；（5）离心机。
2. 操作步骤（1）将外周血样本加入到15ml或50ml的锥形试管中；（2）加入等体积的PBS或Hanks平衡盐溶液，轻轻混合；（3）将ficoll分离液缓慢加入到试管中，使其与样品充分混合；（4）将试管放入离心机中，以800~1000g的速度离心30分钟；（5）离心后，可以看到样品被分成了不同层次。
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。
PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。
为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。
一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。
2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。
3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。
二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。
2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。
3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。
三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。
2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。
3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。
对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。
pbmc分离注意事项
PBMC分离注意事项一、摘要PBMC（ Peripheral Blood Mononuclear Cells，外周血单个核细胞）分离是生物医学研究中常见的实验操作之一。
PBMC包括淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞等，在免疫学、肿瘤学、血液学等领域的研究中具有重要意义。
然而，在进行PBMC分离时，需要注意许多细节和操作要点，以确保实验结果的准确性和可靠性。
本文将就PBMC分离的实验准备、操作过程和后续处理等方面的注意事项进行详细讨论，旨在提高实验操作效率和实验结果质量。
二、实验准备注意事项在开始PBMC分离之前，需要进行充分的实验准备工作。
以下是一些需要注意的事项：1.血液样本的采集和处理在进行PBMC分离之前，需要采集血液样本。
采血时应注意以下几点：首先，要选择适当的采血时间，如清晨空腹采血可以提高检测结果的稳定性；其次，应选择适当的采血方式，如静脉采血或动脉采血；最后，应使用适当的抗凝剂来处理血液样本，以避免血液凝固。
在采集血液样本后，应尽快将样本送往实验室进行处理。
2.实验器材和试剂的准备在实验前，需要准备好所需的实验器材和试剂。
应选择适当的离心管、吸管、细胞筛等实验器材，并确保这些器材的清洁度和无菌状态。
此外，需要准备适当的分离介质、洗涤液、培养基等试剂，并确保这些试剂的质量和浓度符合实验要求。
三、操作过程注意事项在PBMC分离的操作过程中，应注意以下事项：1.离心速度和时间的选择离心是PBMC分离的重要步骤之一。
在选择离心速度和时间时，应根据实验要求和实际情况进行权衡。
离心速度过高或时间过长可能导致细胞损伤或失活；离心速度过低或时间过短则可能导致分离不充分。
因此，需要根据分离介质的特性和所需细胞类型进行选择和调整。
2.操作过程的无菌化处理在PBMC分离过程中，应保持操作的无菌化处理。
所有实验器材和试剂应保持清洁和无菌状态，以避免污染和交叉感染。
此外，实验操作应在无菌操作台或超净工作台中进行，并穿戴适当的个人防护装备。
单细胞测序的细胞核分离和纯化方法
单细胞测序的细胞核分离和纯化方法单细胞测序是一种研究细胞生物学的重要技术，它能够揭示单个细胞在基因表达和功能方面的异质性。
在进行单细胞测序之前，对细胞核进行有效的分离和纯化是至关重要的。
本文将详细介绍单细胞测序中细胞核的分离和纯化方法。
一、细胞核分离方法1.酶解法：酶解法是利用特定的酶分解细胞膜和细胞器，从而释放细胞核。
常用的酶有胰蛋白酶、胶原酶和分散酶等。
这种方法适用于原代细胞和传代细胞的核分离。
2.离心法：离心法是通过高速离心将细胞核与其他细胞组分分离。
根据离心力的不同，可以将细胞核与其他细胞组分分开。
此方法操作简便，适用于各种类型的细胞。
3.过滤法：过滤法是将细胞悬液通过特定孔径的滤器，使细胞核被截留在滤器上，而其他细胞组分通过滤器。
这种方法适用于较大细胞的核分离。
二、细胞核纯化方法1.核酸染料染色法：利用核酸染料（如碘化丙啶）对细胞核进行染色，使细胞核显色，从而与其他细胞组分区分。
此方法操作简单，但纯度较低。
2.免疫磁珠法：利用特异性抗体与细胞核表面抗原结合，然后通过磁珠分离技术将细胞核与其他细胞组分分离。
此方法纯度较高，但操作复杂。
3.柱层析法：柱层析法是将细胞悬液通过特定柱子，利用柱子上吸附的分子与细胞核结合，从而将细胞核与其他细胞组分分离。
此方法纯度较高，操作相对简单。
综上所述，单细胞测序中的细胞核分离和纯化方法有多种，不同的方法适用于不同类型的细胞。
在实际应用中，需要根据实验目的和细胞特性选择合适的分离和纯化方法。
同时，为了获得高质量的单细胞测序结果，还需注意实验操作的严谨性和数据分析的准确性。
密度梯度离心法分离PBMC操作流程
密度梯度离心法分离PBMC操作流程密度梯度离心法（density gradient centrifugation）是一种常用的方法，用于将外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）从全血中分离出来。
该方法通过利用血细胞的不同密度来实现分离，从而获得单个核细胞。
以下是密度梯度离心法分离PBMC的详细操作流程：1.准备所需材料和设备：包括离心管、离心机、无细胞培养基、PBS缓冲液、密度梯度离心液。
2.使用无菌的方法处理全血样本，以防止可能的污染。
3.将含有全血的离心管放置在室温下静置一段时间，使其形成明显的三明治结构，由于样本中的红细胞比其他细胞密度更大，红细胞将沉积在管底部。
4.使用无菌的方法，将全血缓慢倒入预先准备好的无菌离心管中，注意不要把红细胞底层的部分连同上层血浆一同倒入，只取上清层部分。
5.将上清层的全血样本缓慢地转移至一个新的无菌离心管中。
6.向离心管中加入与全血样本体积相等的PBS缓冲液，充分搅拌混匀。
7.将密度梯度离心液缓慢地倒入离心管中，注意避免形成气泡。
8.将离心管放入离心机中，设定合适的离心参数，如离心速度和离心时间。
一般采用400-500g，离心时间为20-30分钟。
离心完成后，你将看到细胞在离心管中形成了几个不同层次。
9.使用无菌的方法，将上清层液体小心地转移至新的离心管中。
在转移过程中，避免吸入其他层次的细胞。
10.将离心管用无菌PBS缓冲液冲洗一次，以去除残余的密度梯度离心液。
11.将PBMC的悬浮细胞沉淀至离心管底部，去除上清液。
12.向沉淀细胞加入足够量的细胞培养基，轻轻搅拌使细胞均匀分散。
13.对PBMC进行细胞计数，以确定细胞数目和浓度。
14.根据实验需求，进行后续的细胞培养、染色、分析等操作。
需要注意的是，在操作过程中，需要注意无菌操作，以避免细胞的污染和损伤。
此外，离心参数和离心时间也需要根据具体实验要求进行调整。
免疫实验 免疫学及免疫检测技术试验
2、加于淋巴细胞分离液上层，离心：500g 20min
（小于1000rpm)
！沿管壁滴加
!淋巴细胞分离液取法
离心
单个核细胞 （斜面！）
3、吸出细胞，悬于营养缓冲液（1～2倍量含5IU/ml 肝素、2％灭活小牛血清的PBS液 ），离心：200g 10min，除去血小板。
4、洗涤：同样营养液洗涤2次，洗去淋巴细胞分离 液，离心： 500g 10min
免疫学实验
实验一、外周血单个核细胞的分离
单个核细胞： 一、基本原理 ?常用哪些方法分离细胞，免疫学可采用哪些方法 本实验是利用不同的细胞之间密度不同的性质，通过 速度沉降法来分离制备外周血中单个核细胞。 二、操作： 1、稀释血：1ml血+1ml缓冲液（含5～10IU/ml肝素的 PBS，无血清 ）（用滴管）
•荧光各孔：阴性对照：Ab-Ag-FITC-Ab，阳性对照用 200ng/ml，500ng/ml
37℃，1hr，洗涤液洗涤三次
3、加酶标抗体、荧光标记抗体：
•所有ELISA各孔均加100ul（已稀释好,稀释倍数：2000
•各荧光孔不加酶标抗体，加荧光标记抗体100ul,(已稀释 好，稀释倍数：50)
实验四、免疫荧光检测技术
一、基本原理：
荧光双抗夹心法定位与定量抗原
二、操作：
1、抗体包被：（同实验二） 2、加样本：同实验二，但在本实验中不做标准曲 线，样品加两个稀释浓度，如1：20，1：40，另外 加一个阳性对照（用人IgG标准），每孔做一个复 孔，加空白对照共计8孔。 3、加荧光抗体：从这里开始与实验二不同之处是 一定要记得避光操作。按照要求加入一定稀释度的 荧光标记抗人IgG抗体（一般为1：80倍左右），避 光37℃保温箱中保温30-45分钟。
单个核细胞分离及流式细胞术检测方法
单个核细胞分离及流式细胞术检测方法
1.取外周血20mL，转移至250mL无菌生理盐水瓶中，加20mL生理盐水混匀，按照体积比3：1加入羟乙基淀粉，即加入13.5mL羟乙基淀粉，充分摇匀后，室温静置15min。
此时加上操作，一共需要耗时25min。
2.吸取上层清亮溶液至50mL无菌离心管，20℃，1800rpm，离心5min，弃上清，最后用10mL生理盐水重悬细胞。
此时加上操作，共耗时25min。
3.吸取提前预热至室温的Ficou人淋巴细胞分离液10mL于50mL离心管中，将细胞悬液沿管壁缓慢加入到分离液中，室温，2000rpm离心25min。
此时加上操作，共耗时35min。
4.小心吸取中间白膜层置于另一无菌15mL离心管，加生理盐水补足体积至
13mL，吹打混匀，室温，1800rpm离心5min，弃上清液，然后再重复该步骤1次。
此时加上操作，共耗时20min。
5.用500微升生理盐水重悬，稀释100倍进行细胞计数，吸取合适数量的细胞进行流式标记（共分为23个流式标记管，至少需1.15×107细胞），每管50微升孵育体积，每种抗体加入1.5微升，全部加完后用中枪混匀，放于4度冰箱孵育30min，并每10min弹匀一次。
此时加上操作，共耗时80min。
6.取出孵育完毕的抗体，用PBS清洗两次（2000rpm离心5min），最后用200微升PBS重悬。
此时加上操作，共耗时40min。
7.将样品拿至流式检测室过筛网，上机检测。
此时加上操作，共耗时45min。
8.关机及出流式报告，30min。
单个核细胞分离试验
1.单个核细胞分离
1.采集静脉血用EDTA-K2抗凝管无菌采集静脉血2ml，立即轻轻摇匀，使血液抗凝。
2.稀释抗凝血用无菌吸管加入2ml等体积的Hanks液或磷酸缓冲盐溶液PBS 充分，使血液等倍稀释，降低红细胞的凝集，提高分离效果。
（此步骤可省去）
3.分离PBMC
（1）取淋巴细胞分离液3ml于灭菌离心管中，然后将离心管倾斜45度，将稀释的血液缓慢叠加于淋巴细胞分离液上，注意勿使血液混入淋巴细胞分离液中。
（2）平衡后，于离心机中室温2000r/min离心20分钟。
离心后，最上层为血浆层，第二层即为单个核细胞层。
（3）用毛细吸管吸取最上层的血浆、血小板后弃去。
再用另一毛细血管吸取单个核细胞于新的无菌离心管中。
4.洗涤PBMC预估转移的单个核细胞的体积，加入3~5倍体积的磷酸缓冲盐溶液PBS，用吸管轻柔重悬细胞，离心，1500r/min离心10分钟，可去掉大部分混杂的血小板。
之后去掉上清，继续加入3~5倍的平衡盐溶液，用吸管轻柔重悬细胞，离心，1500r/min 离心10分钟，去上清后备用。
实验6_人外周血单个核细胞的分离及活力测定1
Ficoll/Hypaque (2:1)
1500rpm, 20 min
水平离心
血小板
⒈ 简述补体的概念、分泌细胞及激活途径。 ⒉ 简述补体的经典激活途径的具体过程。 ⒊ 补体结合反应为什么需分两阶段进行？如果将 几种成分反应顺序颠倒，结果会如何？ ⒋ 参加补体结合反应的各已知成分，为什么须预 先滴定？试验中所设计的四种对照管有何意义？
细胞存活率(%)＝无色细胞数/细胞总数×100%
计数200个细胞，一般活性应在95％以上
注意事项
1. 与血液样品接触时应注意安全防护，避免血源性 传染病传染。 2. 操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细 胞活性及细胞丢失。 3.细胞分层液在室温下比重为l.077±0.001g/L；应 避光 4 ℃下保存，取出后逐渐升至室温后混匀， 方可使用。使用中应避免细菌污染。 4. 稀释血液可降低红细胞的凝集，提高淋巴细胞收 获量，但如果要保留血浆成分作其他实验用时， 则不能稀释血液，以免影响血浆成分。
用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻
轻吸出该层的单个核细胞，盛入另一支离
心管中。
将所得到的PBMC悬液用5倍体积的Hanks液
洗涤2次，1500 rpm 5min。
台盼蓝染色测定细胞存活率
台盼蓝（trypan blue）染色法是测定细胞活力的 最简便的方法。 台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，它不能 透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着 色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染 料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝 色。
人血液中各种细胞的密度如下： 红细胞：1.093 白细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090 血小板：1.030-1.035
F/HБайду номын сангаас 1.077±0.001
从单个核细胞中分离t细胞的方法
从单个核细胞中分离t细胞的方法哎呀，今天咱们聊聊从单个核细胞中分离T细胞的那些事儿。
想想咱们的身体，就像是一座城堡，里面住着各种各样的士兵。
T细胞就是其中最英勇的一批，专门负责打击那些入侵的“坏蛋”。
不过，要把这些小家伙从一大堆细胞中抓出来，可不是件简单的事儿。
你得有点儿耐心，还得懂点儿技巧，不然就像在大海捞针，费劲不讨好。
说到分离，首先咱得从哪里开始呢？对了，得有个样本。
一般来说，咱们从外周血里提取单个核细胞。
想象一下，咱们的血液就像是一杯果汁，里面有各种不同的成分。
而单核细胞就像是那一颗颗漂亮的水果，要从这些水果中挑出咱们的T细胞。
听起来简单，其实可是个技术活儿。
你得先把血液放到离心机里，转个几圈。
就像摇摇晃晃的果汁机，搞得它们都分开了。
重的部分会沉底，轻的就漂在上面。
嘿，这个过程可有点儿像万里长征，一步一个脚印，得小心翼翼。
好啦，分离出了单核细胞，接下来咱们要开始寻找T细胞。
这时候，你就需要用到一些“魔法”工具了。
抗体，没错，就是那些能精准找到T细胞的抗体。
想象一下，抗体就像是个精明的侦探，专门追踪T细胞的“足迹”。
你把这些抗体加入到细胞悬液中，它们就会悄悄地找到T细胞，粘上去。
这个过程可不是什么“飞来横财”，得耐心等着，慢慢地让它们结合。
别着急，慢慢来，急不得。
咱们得把这些结合在一起的细胞分离出来。
这个时候，咱们可以用一种叫“流式细胞仪”的高科技设备。
它就像一个超级先进的筛子，能够识别带有抗体的T细胞，把它们一一挑选出来。
嘿，这过程就像是在超市里挑水果，挑出那些又大又红的苹果，别的水果统统不碰。
通过流式细胞仪，咱们能快速、高效地得到想要的T细胞，真是神奇得不得了。
不过，话说回来，单靠这些可还不够。
分离出来的T细胞还得经过一系列的培养和激活，才能让它们变得更强大。
就像是把小鸡仔养成大公鸡，得给它们提供营养，创造一个好的环境。
你得用特定的培养基，加入一些生长因子，给它们创造一个“温室”般的氛围。
实验1 密度梯度离心法分离血液单个核细胞
实验1 密度梯度离心法分离血液单个核细胞姓名：李思露学号：131140040一、实验原理外周血细胞由密度不同的红细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、血小板等组成。
对人血液来讲，其中红细胞密度最大，为 1.09~1.11g/L；粒细胞密度次之，为1.080~1.092g/L；单核细胞、淋巴细胞及NK细胞密度相近，为1.050~1.077g/L；血小板密度最小，只有1.030~1.060g/L；将其中的单核细胞、淋巴细胞、NK细胞等统称为外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell, PBMC）。
当将稀释的抗凝血叠加于适宜密度（与单个核细胞密度相近）的淋巴细胞分离液之上，经适当的离心力离心一段时间后，不同种类细胞因密度而分布于离心管的不同位置，红细胞和粒细胞密度大于分层液，沉积于管底；血小板则因密度小而悬浮在血浆中；其中与分层液密度相当的单个核细胞分布在血浆层和分层液之间的界面。
二、实验材料、试剂及器材1.材料肝素抗凝鸡血：先给注射器中吸入0.1mL 180IU／mL肝素钠溶液，鸡翅下静脉采血5mL。
肝素抗凝绵羊血。
2.试剂（1）肝素钠溶液：用生理盐水配成180IU/mL。
（2）D-Hanks液。
（3）人淋巴细胞分离液：市售。
20℃时密度应为（1.077±0.001）g/L。
3.仪器和用具10mL低速离心机、托盘天平、一次性塑料注射器、10mL离心管、胶头滴管、40mL 小烧杯等。
三、实验操作（1）稀释血液：用D-Hanks液按1：1稀释抗凝血。
（2）加样：先在10 mL离心管中加入2 mL鸡血淋巴细胞分离液，再沿管壁在距分层液界面上1 cm处缓慢加入2 mL稀释血。
应注意保持两者界面清晰，勿使血液混入分层液内。
（3）离心：2000 r/min离心20 min。
（4）肉眼观察分离效果。
（5）收集PBMC：用胶头吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出PBMC，转入另一离心管。
外周单个核细胞分离临床意义
外周单个核细胞分离临床意义嘿，朋友们！今天咱们来聊聊外周单个核细胞分离这个超有趣的事儿，虽然听起来很专业，但其实就像一场微观世界里的超级选秀呢。
想象一下，我们的身体就像一个超级大国，里面住着各种各样的细胞居民。
外周单个核细胞呢，那可就是这个国家里一群特殊的精英。
把它们从外周血里分离出来，就好比从一群乱哄哄的人群里挑出最酷最有本事的家伙。
这细胞分离的临床意义啊，那可大了去了。
比如说在研究疾病方面，就像是在一个神秘的黑森林里找宝藏。
外周单个核细胞就像是那些带着特殊标记的小向导。
它们可以带着科学家找到疾病的根源，就像小向导带着探险家找到宝藏的藏匿之处。
要是没有把它们分离出来好好研究，那就像在黑森林里瞎转，根本不知道方向。
再看看在免疫治疗这块儿。
这些外周单个核细胞就像是超级战士。
把它们分离出来，就像是从训练营里挑选出最厉害的士兵。
然后对这些士兵进行训练（改造），再送回身体这个战场。
这要是没有精准的分离，就好比把一群未经筛选的乌合之众送上战场，那肯定是一败涂地啊。
在传染病研究中，外周单个核细胞像是一群侦探。
它们能帮助我们弄清楚病毒或者细菌是怎么搞破坏的。
要是不把它们单独拎出来询问（研究），那就像在一团乱麻里找线头，根本无从下手。
从血液这个大杂烩里把外周单个核细胞分离出来，也有点像从一锅大杂炖里挑出最精华的食材。
这些细胞能给我们提供关于身体状况的最精准信息，就像那些精华食材能决定一道菜的品质。
而且啊，对于一些疑难杂症，它们就像一把神奇的钥匙。
分离它们就像是在一大串钥匙里找到能打开神秘大门的那一把。
要是不做这个分离，我们可能就永远被挡在那扇能找到治愈方法的大门外，只能干瞪眼。
在药物研发中，外周单个核细胞像是最诚实的试药员。
把它们分离出来做测试，就像先让一群勇敢的小志愿者试试药的效果。
要是不这样，那药物研发就像在黑暗中乱射箭，不知道到底射中没射中目标。
总之呢，外周单个核细胞分离虽然是个微观世界里的事儿，但在临床意义上可是个超级大明星。
外周血单个核细胞的分离
实验二十四外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。
外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。
此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。
市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。
将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。
2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。
4.Hank,s液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。
再加入等量Hank,s液混匀。
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。
稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。
3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
实验三外周血单个核细胞分离
实验目的
掌握外周血单个核细胞分离的原理与操作 掌握外周血单个核细胞的概念
实验原理
人外周血单个核细胞 （peripheral blood mononuclear cell， PBMC）包括淋巴细胞 和单核细胞。
单个核细胞的体积、形态和比重与外周 血其他细胞不同。因此利用一种介于 1.075-1.090之间的聚蔗糖-泛影葡胺 （ficoll-hypaque）分离液作密度梯度 离心，离心后不同比重的血细胞在分离 液中中各种细胞的密度如下：
红细胞：1.093 白细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090 血小板：1.030-1.035
F/H= 1.077±0.001
实验步骤
1.用抗凝管抽取外周血2ml； 2.将装有2ml分离液的试管微微倾斜，用吸管
将抽取的抗凝外周血缓缓加入到分离液上 层，保持液面分层清晰； 3.水平离心机中离心，2000rpm，20min； 4.将离心好的试管轻轻拿出，用毛细吸管吸取 PBMC层细胞涂片； 5.将涂片进行瑞氏染色。
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单个核细胞的分离：（密度离心法）（一）外周血中的单个核细胞的分离：1. 眼眶静脉丛采血：（无菌条件下操作）采血者的左手拇食两指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部(大鼠采血需带上纱手套)，应防止动物窒息。
当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧，使眶后静脉丛充血。
右手持续接7号针头的1ml注射器或长颈(3～4cm)硬质玻璃滴管(毛细管内径0.5-1.0mm)，使采血器与鼠面成45℃的夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再转180度使斜面对着眼眶后界。
刺入浓度，小鼠约2～3mm。
当感到有阻力时即停止推进，同时，将针退出约0.1-0.5mm，边退边抽。
若穿刺适当血液能自然流入毛细管中，当得到所需的血量后，即除去加于颈部的压力，同时，将采血器拔出，以防止术后穿刺孔出血。
若技术熟练，用本法短期内可重复采血均无多大困难。
左右两眼轮换更好。
体重20-25g的小鼠每次可采血 0.2-0.3ml。
摘除眼球取血：左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。
用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。
采血完毕立即用纱布压迫止血。
每次采血量0.6-1mL。
2. 分离PBMC操作步骤：1）用抗凝管（内含抗凝液0.2ml）收集血液，摇匀，加入的Hank’s液或PBS等体积（1:1）稀释血液。
或用肝素溶液：生理盐水将肝素配成125-250U/mL的无菌液，4度保存。
每1mL全血加0.1mL 肝素溶液。
2）取淋巴细胞分层液2ml，放入15ml的离心管。
3）将离心管倾斜45°角，用吸管吸取稀释血液，在离分层液面上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液量叠于分层液上，保持两者界面清晰。
（稀释血液与分层液体积比例约为2:1）。
（或：将吸管嘴插入离心管底部，将分层液缓慢加入稀释血液的底部。
）4）18-20度，水平离心机以2000r/min离心20min，离心后其中的内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分层液，底层为红细胞和粒细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层（薄）。
单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。
（离心温度在18-20度）5）用毛细血管（或1ml注射器）轻轻插入白膜层，沿试管壁周缘吸取界面层单个核细胞，移入另一离心管中。
（或：先吸去最上层的血浆，然后用另一只毛细吸管收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC，避免吸到过多的分层液和血浆。
）6）加入５ml的（不含Ca2+，Mg2+）的Hank's液或RPMI1640洗涤2次，混匀，依次以1500r/min、1000r/min离心10min，吸弃上清。
（*低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板）7）末次离心后，弃上清，用含有10％小牛血清的RPMI1640 2ml，重悬细胞。
8) 细胞计数：取20ul细胞悬液加20ul 0.4%台盼兰染液，3-5分钟后取样进行计数。
活细胞不着色，折光强；死细胞被然成蓝色，体积略膨大。
计数200个细胞，计算活细胞百分率。
单个核细胞浓度(细胞数／1ml细胞悬液)＝(4个大方格内细胞总数/4)³10４³2(稀释倍数) 活细胞百分率＝(活细胞数/总细胞数)³100％用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上。
3-5毫升外周血可得1³106～2³106PBMC（人）。
鼠可得0.5-1³106PBMC左右kentj发贴: 61积分: 2得票: 1状态: 离线丁当: 107个人资料发短消息 2008-08-30 18:24-------------------------------------------------------------------------------- 这是我做得步骤比较成熟可以参--------------------------------------------------------------------------------------------------------------网上搜到的，请问是常规方法吗？Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。
取得有活性的细胞应根据不同目的，采用不同方法，考虑(1)细胞纯度；(2)细胞获得量；(3)细胞活力；(4)使用方法的简易程度和本室条件等。
目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞。
(一) 原理:常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077±0.001 的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液。
Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，犌W水性高，平均分子量为400,000，当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。
红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。
吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
(二) 方法:1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。
2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。
水平离心2000rpm³20分钟。
3. 离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。
中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。
此外，还含有血小板。
4. 用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。
置入另一短中管中，加入５倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm³10分钟，洗涤细胞两次。
5. 末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。
取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝4个大方格内细胞总数──────────³10４³2(稀释倍数)46. 细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。
计数200个淋巴细胞。
计算出活细胞百分率。
活细胞数活细胞百分率＝──────³100％总细胞数用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上。
(三) 试剂和材料:比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞分离液)。
Hank's液(无Ca２＋、Mg２＋)10％小牛血清RPMI16400.2％台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。
肝素用Hank's液或生理盐水稀释成500单位／ml，牽9凝人外周血肝素用量约为50单位／1毫升血。
短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。
无菌干燥注射器针头。
碘酒，75％酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。
血球计数板、显微镜、水平式离心机。
(四) 注意事项:1. 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。
2. 操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。
3. 用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。
4. 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，犛&配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。
(五) 附录1. Hank's液(无Ca２＋、Mg２＋)配制法NaCl 8.0克KCl 0.4克Na２HPO４²12H２O 0.12克KH２HPO４0.06克葡萄糖 1.0克双蒸水 1000毫克1％酚红液 2毫克将上列成分混合后溶化，分装于500毫升盐水瓶内，8磅15分钟灭菌，4℃冰箱保存，临用时调PH至7.3～7.6。
2. 细胞分层液配制法9％聚蔗糖24份34％泛影葡胺 10％混合，测比重为1.077～1.078，G５玻璃滤器过滤除菌。
４℃冰箱保存备用。
3. 磷酸缓冲液(P原液:A液: 0.2M NaH２PO４溶液NaH２PO４27.6克或NaH２PO４²2H２O 31.2克蒸馏水溶解至1000毫升B液：0.2M Ha２HPO４溶液Ha２HPO４²12H２O 71.6克蒸馏水溶解至1000毫升各种不同PH值PB的配法───────────────────────────────────────PH 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0───────────────────────────────────────A液(ml) 39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.5B液(ml) 61.0 72.0 81.0 87.0 91.0 94.5───────────────────────────────────────举例: 0.1M PH7.2PBA液28毫升B液72毫升加蒸馏水 100ml4. 血球保存液葡萄糖 2.05克枸椽酸钠0.8克氯化钠0.42克蒸馏水 100毫升将上述成分混匀，略加温使其溶解，分装小瓶(100毫升)。
经10磅、10分钟高压灭菌。
4℃保存备用。
5. RPMI-1640培养液:RPMT-1640(FLOW公司出品) 1袋三蒸水 1000毫升电磁搅拌30分钟：1N HCl调PH7.2～7.4(约加2.5毫升)，过滤除菌，作无菌试验，4℃保存。
不完全RPMI-1640培养液:RPMI-1640 95毫升0.1M丙酮酸钠1毫升0.2M谷氨酰胺 1毫升。