显微镜的七种观察方法

灯室，上下、左右旋钮，聚光镜旋钮
a
40
按观察方法分 7-4
4.偏光:有些物质在两个呈
一定夹角的偏光滤片之间可现呈 鲜明的对比，或根据双折射性能 和定向呈现颜色
a
41
偏光
a
42
1 原理
依据波动光学原理观察和精密测定标本细节,或透明物体改变光束的物理参数,以 此判别物质结构的一种显微镜
偏振器1
自然光（多 振动面）
490
590
Acridine Yellow
470
550
CY3
552
565
TRITC
541
572 a
Propidium Iodide 530
615
滤色镜的特性
激发
分色
吸收
27
FITC+PI
带宽对图象的影响
SWB: BP420-480
WB: BP450-480
WIB: BP460-490
NB: BP470-490
❖ 检出能力高（放大作用）
❖ 对细胞的刺激小（可以活体染色）
❖ 能进行多重染色
用途：
❖ 物体构造的观察——荧光素
❖ 荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体 荧光等
❖ 发荧光量的测定对物质定性、定量分析
a
17
荧光显微镜的种类
透射式
a
18
荧光显微镜的种类
落射式
a
19
荧光显微镜的主要部件
透射式
❖ 汞灯光源 ❖ 激发滤色镜 ❖ 吸收滤色镜 ❖ 暗场聚光镜
a
28
多重染色标本的多色观察
FITC+Texas Red+DAPI
a
29
三色滤色镜的特性曲线
激发
分色
吸收
a
30
双重染色标本的单色和双色观 察
WU
WIB
DUAL BAND
DAPI+FITC
WIBA
WIG
a
WIB
FITC+PI
31
单色滤色镜的特性曲线
a
32
双色滤色镜的特性曲线
a
33
现行显微镜特点和各种滤色镜
）
a
1
显微镜的七种观察方法
a
2
按观察方法分七种
明场
DIC 暗场
荧光
偏光
霍夫曼 相差
a
3
显微观察方式
a
4
按观察方法分 7-1
1.明场:照明光直接通过聚
光镜入射于试样，并透过试样后 进入物镜并最终被观察到。
a
5
明场
a
6
明场观察方式
常规观察方式 应用领域：
常规镜检、病理、染色标本 优点：
视野亮度高、均匀， 应用范围广， 操作简单，价格低， 物镜适用于荧光观察 缺点： 透明标本对比度低， 标本没有立体感
a
44
❖ 偏光显微镜主要用于检测矿石,地质大学会用 到,特别是可以用来鉴定珠宝,另外可以检测生 物内骨骼,这个我还没有遇见实例,还可以检测 生物化学结晶,化学院用来观察结晶液像,其他 在纺织物品化学成分上检测上,物理芯片上等, 凡是观察双折射晶体会使用偏光显微镜 。
a
45
按观察方法分 7-5
5.相衬（差）:利用光线通
激发 滤色镜
发射光
入射光
• 激发滤色镜:
激发波长选择
分光 滤色镜 T%
a BAND PASS
nm 24
落射荧光显微镜各部件特性和 作用
• 分色镜:
T%
反射激发光,荧光透过
＜A 反射
＞A 透过
A
nm
• 吸收滤色镜:
T%
荧光透过,阻挡杂光
＜B 阻挡
＞B 透过
a
B A
nm 25
落射荧光显微镜各部件特性和 作用
a
7
按观察方法分 7-2
2.暗场:照明光通过物镜外
围射于试样，来自试样的干涉及 衍射光进入物镜并最终被观察到。
a
8
暗场
a
9
1 原理 丁道尔(Tyndall)现象，微粒对斜射光反射或衍射，增 大了人眼可见性。 2 特点 观察到极其微小物体，分辨率可达0.02 ~ 0.004 um (明场0.4um)—”超显微“。 3 缺点 只能观察到物体存在、运动和外部形态 不方便调节 标本要求高（灰尘、盖片、载片）
分色镜: 反射激发光,荧光透过
T% ＜A 反射
＞A 透过
吸收滤色镜: 荧光透过,阻挡杂光
A
nm
T%
＞B ，＜C 透过
a
AB
C
nm 26
滤色镜的选择
荧光素的特性
荧光素
激发波长 发射波长
DAPI
372
456
AMCA
350
450
Hoechst 33258
365
465
FITC
490
520
Acridine Orange
显微镜荧光利用光源激发——光化荧光
a
14
荧光的种类
自发（固有）荧光
二次荧光
a
15
荧光的性质
❖ 吸收光，必需有激发光源 ❖ 荧光波长＞激发波长（损失热能） ❖ 荧光强度极小于激发光的强度 ❖ 有不同程度的衰减 ❖ 荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、
荧光效率
a
16
荧光显微镜的优点和用途
优点：
a
34
分色镜
自由组合 激 发块
吸收滤色镜
a
35
激发滤色镜
油
镜
应
使
用
荧
光
油
a
36
的运用
光栏全开启
物镜光栏
减少杂散光干扰
光栏适当关小
a
37
荧光的衰减
有衰减的标本
防衰减的方法
❖ 使用抗衰减剂 ❖ 选择衰减小的荧光素 ❖ 降低激发光强度 ❖ 降低标本中氧的浓度
a
38
使用抗衰减剂的效果
a
39
汞灯灯箱构造
偏振器2
偏振光（单 一振动面）
各向同性：单折射体，光性质不因照射方向而改变，普 通气体、液体、非结晶固体等
各向异性：双折射体，光速度、折射率、吸收和振动面、
振幅随照射方向不同，晶体、纤维等
a
43
应用：
矿物质、化学物品鉴别 鉴别纤维、染色体、淀粉粒、细胞中晶体 植物病理检验 鉴别骨骼、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿 瘤细胞、横纹肌和毛发等
a
落射式
❖ 汞灯光源 ❖ 激发滤色镜 ❖ 分色镜 ❖ 吸收滤色镜
20
落射荧光显微镜的构造
吸收滤色镜 激发滤色镜
a
21
落射荧光显微镜的构造
a
22
荧光显微镜光源
• 汞灯光源:
提供激发光(U、V、B、G)
Biblioteka Baidu
• 氙灯光源：
高峰值更宽，更稳定
a
23
荧光显微镜激发透镜组
• 激发透镜组
吸收 滤色镜
（激发块）:
过分别处于聚光镜与物镜的一对互
补的光环后产生干涉（强度叠加或
减弱），即相位差转变成了光强差，
从而可清楚观察到使原来不易看清
的透明类样品（即相位物体，如活
细胞）。
a
46
相 差（衬）
a
47
相 差（衬）
a
48
1 原理
利用被检物体的光程（折射率 x 厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差 变为人眼可以分辨的振幅差
a
10
4 应用：
微小粒子、细菌形态观察 、细菌记数，透明标本观 察等
a
11
按观察方法分 7-3
3.荧光:利用某些物质在受
到了紫外光或短波长的光激发照 射以后能够发射出比激发光波长 长的荧光的特性的观察方法
a
12
荧光
a
13
什么是荧光 ?
物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为 高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非 温度辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，发 射出的长波光。