土壤棉花黄萎病菌分离方法
新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术
新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术新疆地处我国西北部，是我国重要的棉花产区之一。
然而近年来，新疆棉花产区出现了棉花枯黄萎病的发生现状。
枯黄萎病是一种由真菌引起的病害，会对棉花的生长和产量造成严重影响。
为了应对棉花枯黄萎病的蔓延，研究人员们开发了快速分离技术，以帮助农民有效控制和管理病害，保障棉花产量和品质。
下面我们就来详细了解一下新疆棉花枯黄萎病的发生现状以及相关的快速分离技术。
让我们了解一下新疆棉花枯黄萎病的发生现状。
枯黄萎病是由黄萎病菌引起的，主要特征为叶片出现圆形或不规则形状的褐色或黄色斑点，严重感染的叶片会枯黄并凋萎。
枯黄萎病不仅会影响叶片的光合作用，还会阻碍水分和养分的输送，从而导致叶片凋萎。
严重的枯黄萎病感染会导致棉铃变小、纤维变短，影响棉花的产量和品质。
棉花是新疆的重要经济作物，枯黄萎病的蔓延不仅会直接影响农民的收益，也会对当地经济造成负面影响。
及时控制和管理枯黄萎病对新疆棉花产区的农业生产至关重要。
针对枯黄萎病的发生现状，研究人员们加大了对该病害的研究力度，并成功地开发了快速分离技术。
该技术基于分子生物学方法，通过检测寄主植物中病原菌的特定基因序列，快速准确地分离出病原菌，有助于及时采取针对性的防控措施。
快速分离技术的成功应用，为新疆棉花产区的抗病工作提供了重要的技术支持。
快速分离技术主要分为以下几个步骤：首先是样品的采集和处理。
样品可以是受感染的棉花叶片或其他组织，也可以是土壤样品。
其次是 DNA/RNA 的提取和纯化。
这一步是为了获取样品中的病原菌 DNA/RNA，为后续的分子生物学分析做准备。
接下来是 PCR 扩增。
PCR 是一种常用的 DNA 复制技术，可以快速扩增目标 DNA 片段。
研究人员们设计了特异性引物，使其只能与枯黄萎病菌的特定基因序列结合，从而实现对病原菌 DNA 片段的扩增。
最后是基因测序和分析。
对 PCR 扩增产物进行基因测序和分析，确认其中的病原菌 DNA 片段，从而实现对病原菌的快速准确分离。
棉花枯、黄萎病发生原因分析及防治措施
多半 是老 弱病残 ， 棉花 中后 期管 理粗放 ， 、 、 蕾 花
铃期脱肥 现象严重 ， 导致棉 花长势弱 ， 抗病性 、 耐
轻发 病 ；三是 土壤 消毒 。结 合灌 溉可 掺人 高锰
酸钾 、 石灰 等药 剂 ， 杀灭 病菌 有一 定 的效果 ； 对
病性 能差 ， 有利 于枯黄 萎病 和其 它病 害发生 。
的综 合治理 ， 为棉花 提供 良好 的生态 环境 ， 确保
— —
４ — ４ —
病虫分析
嘲 比 楫 保
２１ ０ ２年第 ５期 总第 １３期 ３
ｄ 提 高耕 作 和栽 培技术 ， ） 实行精 耕 细作 ， 提 高复种 指数 ， 变农 作 物种植 结构 ， 改 尽量 种植 经 济价值 高蝗 虫 不喜食 的作 物 （ 如豆科 、 类 等） 薯 ，
２２ 选 用 抗 病 品 种 ．
进 病害 的蔓延 ， 温 干旱不 利于发 病 ， 势低 的 高 地
丘 洼地 ， 以及 黏土 地在 汛期 易积水 ， 易感染 病 容
害 。因此气 候 因素是 棉 花枯 黄萎病 发生 蔓延 的
主要 因素 。
１５ 种 植 密 度 －
选 用经 济性 状好 的抗 病 品种是 防病 夺 高产 的根本 途径 。 目前 ， 国生产 上可供选 用 的抗枯 我 萎病 品种较 多 ， 常 只有 抗枯萎 病 、 通 耐黄 萎病 的 品种 可供选择 。
生环境 ， 蝗虫 的天敌一 蜘蛛 、 对 鸟类 、 蛙类 等要保
护它们在 沟坝 、 土坡 、 高地等 栖息场所 ， 使其 能安
全 繁殖 ， 殖 天 敌 。 增
ｂ 推 广农户 养鸡 、 ） 养鸭 灭蝗 。 蝗虫 一般 只有 两个月左 右 的生命期 ， 蝗虫 出生两周左右 是生 在 物灭 蝗 的最 佳 时期 ， 时蝗虫 不会 飞 ， 鸭 吃起 这 鸡
新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术
新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术新疆棉花枯黄萎病是由真菌引起的一种病害，严重影响了新疆棉花产业的发展。
本文将对该病害的发生现状以及快速分离技术进行介绍。
新疆棉花枯黄萎病的发生现状主要包括以下几个方面：一是病害区域广泛，已在新疆各地普遍发生，严重地影响了棉花的产量和品质。
二是病害的发生率逐年上升，尤其是近年来，由于新疆棉花种植规模的不断扩大和种植结构的优化调整，该病害在新疆的发生率呈逐年上升趋势。
三是病害的危害程度较大，严重的损害了棉花植株的生长和发育，导致棉花产量明显下降。
针对新疆棉花枯黄萎病的快速分离技术，研究人员通过不断探索和实践，已经发展出了一种高效、快速的分离方法，对病原真菌进行分离鉴定。
该方法主要包括以下几个关键步骤：一是采集病株样本，选择受病害严重侵染的植株进行样品采集。
二是进行消毒处理，将采集的病株样本进行消毒处理，以防止其他微生物的污染。
三是进行分离培养，将消毒处理后的样品切割成小块，进行分离培养。
四是选取优质菌株，从分离培养的菌落中筛选出优质的菌株，以用于病原真菌的鉴定和研究。
五是进行鉴定分析，通过形态学和分子生物学等方法，对分离得到的菌株进行鉴定和分析，确定其为新疆棉花枯黄萎病的病原真菌。
该快速分离技术的成功应用，为新疆棉花枯黄萎病的防控提供了重要的技术支持。
通过准确分离病原真菌，可以深入了解该病害的发生机理和传播途径，为制定科学合理的防控策略提供依据。
该技术还有助于新疆棉花品种的筛选和培育工作，为研究耐病品种提供重要的材料基础。
需要注意的是，枯黄萎病的防治工作仍面临一定的挑战。
由于该病害的传播途径多样，且病原真菌易于在土壤中长期存活，因此病害的防控工作比较复杂。
新疆地区气候干燥，湿度较低，容易造成病害的快速扩散。
土壤中的病原真菌数量较大，难以彻底清除。
针对新疆棉花枯黄萎病的防治，还需要进一步加强病原真菌的鉴定和研究工作，为制定更加科学有效的防治策略提供支持。
棉花黄萎病的取样方法有哪些
棉花黄萎病的取样方法有哪些棉花黄萎病（Cotton Verticillium Wilt）是一种由真菌Verticillium dahliae 引起的病害，它在棉花生产中广泛分布，严重影响棉花的产量和品质。
为了确诊和研究这种病害，采样是非常重要的步骤。
下面将介绍一些常用的棉花黄萎病取样方法。
1. 根部取样法：根部取样是最为常见和常用的一种取样方法。
首先，选择有病征的棉花植株，从地面附近或稍深的位置取一个约10-15cm长的根部样品。
然后，用刀或剪刀将根部横断面修整平整，将取样切口处清洗并消毒，最后放入消毒后的水中浸泡一段时间。
通过观察根部横切面的变化，可以初步判断是否感染了黄萎病。
2. 枝干取样法：枝干取样是评价棉花黄萎病程度的一种有效方法。
选择有病征的枝条或干枯的部分，用锋利的剪刀将其剪下。
然后，将取样的枝条或干枯部分切成约2-3cm的段，并清洗、消毒处理。
通过观察枝条断面上的病斑、黄褐色的木化组织和真菌子囊盖等特征，可以判断棉花是否感染黄萎病。
3. 叶片取样法：叶片取样也是一种较为常用的取样方法。
选择植株上带有病叶和健康叶的部分，将其剪下并放入密封袋中，以避免样品受到空气和外界环境的污染。
如果病叶上已经形成了真菌子囊盖，就可以通过显微镜观察和诊断黄萎病的严重程度。
4. 组织病斑取样法：组织病斑取样是研究棉花黄萎病病原菌的一种常用方法。
选择有病斑的叶片、茎部或根部，用消毒的刀具将其切下。
然后，将病斑组织用无菌的刀片切成小块，然后移入无菌培养基或离心管中。
这样可以获得病原菌的纯培养，进一步进行形态学和生物学观察，为研究该病害提供基础数据。
5. 土壤取样法：黄萎病的病原菌Verticillium dahliae 可以长期在土壤中存活，因此土壤取样也是一种重要的方法。
选择有病征的地块或棉花生长的土壤，用无菌铲子或勺子从不同深度（如10cm、20cm、30cm等）处取土样，放入无菌袋中。
然后，将取样的土壤送往实验室进行分析，可以通过土壤分析来评估土壤中病原菌的数量和分布情况。
棉花黄萎病防治方法
棉花黄萎病防治方法汇报人：2023-12-02CATALOGUE目录•棉花黄萎病概述•棉花黄萎病的病因•棉花黄萎病的诊断与识别•棉花黄萎病的防治方法•棉花黄萎病的预防措施•棉花黄萎病防治案例分析01棉花黄萎病概述棉花黄萎病是一种由真菌引起的土传病害，也称为“黄叶病”或“萎黄病”。
棉花黄萎病主要导致棉花叶片变黄、萎缩，植株生长缓慢，结铃少，产量和品质下降。
病株叶片边缘常有深褐色斑块，后期叶片易脱落。
定义和症状症状定义病菌可在土壤中存活多年，通过棉株的根部和土壤中的菌丝体进行传播。
土壤传播病菌也可通过气流传播，在风的作用下，可从发病棉田传播至邻近未发病的棉田。
气流传播传播途径棉花黄萎病可导致棉花减产，严重时甚至绝收。
产量损失品质下降防治困难病株所结棉铃的纤维品质也受到影响，导致品质下降。
由于棉花黄萎病的传播途径多且难以控制，防治较为困难。
030201影响和危害02棉花黄萎病的病因土壤粘重、排水不良等质地类型容易导致棉花黄萎病的发生。
土壤质地土壤中某些微生物的种类和数量与棉花黄萎病的发生有关。
土壤微生物土壤中某些营养元素的缺乏或过量也可能导致棉花黄萎病的发生。
土壤营养过高或过低的温度都可能影响棉花的抗病性，导致棉花黄萎病的发生。
温度湿度过高或过低都可能影响棉花的抗病性，导致棉花黄萎病的发生。
湿度降雨的频率和量也可能影响棉花黄萎病的发生。
降雨种植密度种植密度过高可能导致棉花黄萎病的发生。
品种抗性不同品种的棉花对黄萎病的抗性有差异。
施肥施肥不当可能导致棉花黄萎病的发生。
03棉花黄萎病的诊断与识别症状观察棉花黄萎病通常会导致叶片出现黄色或褐色斑点，并逐渐扩大，最终导致叶片枯萎。
观察棉花生长情况受黄萎病影响的棉花植株会变得矮小，枝叶稀疏，且棉花产量和品质会受到影响。
有机质含量过高可能会导致土壤酸化，从而为黄萎病的病原菌提供适宜的生长环境。
检测土壤中的有机质含量微生物群落失衡可能会为黄萎病的病原菌提供更多的传播途径。
新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术
新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术随着全球气候变化和农业发展的加速，棉花种植已经成为了新疆地区最为重要的经济支柱之一。
然而，近年来，由于气候异常和病虫害等原因，新疆地区的棉花产量正面临严峻的挑战。
其中，棉花枯黄萎病的发生率愈发严重，已经严重影响到了新疆地区的棉花种植业。
棉花枯黄萎病是一种由灰色霉菌（Rhizoctonia solani Kühn）引起的真菌病。
这种病菌在棉花种植的生长过程中，主要侵袭棉花的根系和茎部，导致严重的枯黄和萎缩。
在新疆地区，由于其干燥的气候和高强度的农业开发，导致了土地沙漠化以及农作物的长期单一种植，这些都成为了棉花枯黄萎病高发的重要原因。
为了更好地控制和预防棉花枯黄萎病的发生，许多学者和科研工作者通过对其发生机理和病原学特征的深入研究，提出了一系列有效的防治措施和技术手段。
其中，最具代表性的是快速分离技术。
快速分离技术主要是通过对病原菌样本进行快速分离和鉴定，能够快速确定其分类和鉴别，从而提高了病原学研究的效率和准确性。
在新疆地区，许多研究者采用了基于PCR 扩增技术的快速分离方法，通过对棉花枯黄萎病的特异性基因进行扩增，可以快速鉴别和分离出病原真菌，从而为后续的治疗和防控提供了重要的基础。
值得一提的是，在快速分离技术方面，新疆的研究者已经取得了一定的成果。
例如，有研究团队成功开发了一种基于PCR扩增技术的快速分离方法，确证了棉花枯黄萎病的基因多样性和地理分布规律，为更好地控制和预防此类病害提供了重要的技术支持和科学依据。
综上所述，棉花枯黄萎病是新疆地区农业发展过程中面临的主要难题之一。
通过快速分离技术的研究和应用，可以有效提高这类病害的诊断和鉴别效率，为后续的治疗和防控提供有力的技术支持。
随着科技的不断发展，相信在不久的将来，新疆地区棉花枯黄萎病的防治工作将会取得更加显著的进展。
新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术
新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术新疆是我国重要的棉花生产基地之一，但近年来，新疆棉花枯黄萎病的发生频率明显增加，对棉花产量和质量造成严重影响。
本文主要通过调查研究，分析新疆棉花枯黄萎病的发生现状，并介绍了一种快速分离技术。
一、新疆棉花枯黄萎病的发生现状1. 病原菌新疆棉花枯黄萎病的主要病原菌是棉枯黄萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum），属于担孢菌门（Ascomycota）真菌。
2. 发病特点新疆棉花枯黄萎病主要在播种后的幼苗期发病，表现为棉花叶片出现黄化、枯黄和萎蔫症状，严重时会导致棉花死亡。
病原菌还可以通过棉花的根系侵入植株，造成维管束阻塞和整株萎蔫。
病原菌还可以通过棉花种子传播，导致病害的远距离传播。
二、新疆棉花枯黄萎病的快速分离技术为了准确鉴定新疆棉花枯黄萎病的病原菌，需要进行病原菌的分离和鉴定。
传统的分离方法主要是通过分离病组织、涂抹法等手段，但这些方法繁琐且耗时。
近年来，研究人员发展了一种基于PCR的快速分离技术，方便高效地进行病原菌分离和鉴定。
1. 样品采集和处理需要采集新疆棉花枯黄萎病植株的受害部位，如叶片和根系。
样品应在发病初期采集，并保持样品的完整性和新鲜度。
然后，将样品进行消毒处理，以防止其他细菌或真菌的污染。
2. DNA提取采用DNA提取试剂盒进行病原菌DNA的提取。
将样品切碎并加入提取试剂盒进行混合。
接着，通过离心和冻融的方式，使细胞破裂释放出DNA。
3. PCR扩增设计适合的引物，使其特异性地与目标病原菌的DNA片段结合。
将提取得到的DNA样品与引物、Taq DNA聚合酶、缓冲液和dNTP等成分混合，反应体系进行PCR扩增。
PCR扩增条件一般为94℃预变性3min，然后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸1min。
4. PCR产物分析将PCR扩增得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，观察PCR扩增结果。
微生物实验报告(棉花黄萎病菌)
重庆邮电大学生物信息学院微生物实验报告实验题目棉花黄萎病菌的分离与纯化实验人员罗秋兰范欢卢正兴汤丽刘培填写时间:2010年12 月22日重庆邮电大学生物信息学院制一、选题背景棉花是我国重要的经济作物，特别是在新疆，山东等地区种植面积非常大。
一些农民更是以种植棉花来养家糊口。
用棉花加工而成的产品数不胜数，我们的日常生活离不开棉花。
而在当前，棉花黄萎病是影响我国棉花产量与品质的主要病害之一，是由大丽轮枝菌(Vertillium dahliae Kleb．)引起的一种危害性极大的维管束系统病害,该病原菌分布范围广,可浸染双子叶植物及单子叶植物,寄主多达600多种,一旦爆发造成严重经济损失. 在全球因黄萎病所造成的经济损失平均每年达10亿多美元。
自20世纪70年代以来,中国棉花黄萎病有发展和蔓延的趋势近年来,我国棉花黄萎病菌致病力分化明显,病害在田间表现出多种症状类型. 国内外在棉花黄萎病防治及抗病育种方面虽然取得了一些进展，但进展缓慢。
这是因为棉花黄萎病是一种土传病害，利用物理化学手段进行黄萎病的防治效果甚微。
二、实验目的通过对棉花黄萎病菌的培养、分离、纯化，掌握此病菌的理化性质；通过此次实际操作，掌握微生物的分离纯化的具体方法以及培养基的制作方法。
三、实验步骤（一）土壤取样（二）制备培养基我们采用的是选择培养基，成分为:蔗糖5克，磷酸钾 1克,硝酸钠 2克，氯化钾 0.5克，硫酸镁0.5克，硫酸亚铁0.01克,蒸馏水1000毫升,克菌丹0.5ppm,PCNB 350ppm,井岗霉素2.5ppm,氯霉素、链霉素、青霉素各250ppm，琼脂少量。
在这种培养基上细菌很少生长,V.dahliae 菌落呈黑色,稍凸起,杂菌主要为白色的镰刀菌,但对 V.dahliae 计数影响不大。
（三）高温消毒将所需要的所有实验用具和所制得的培养基，放入灭菌锅内，进行高温蒸汽灭菌（四）稀释样品液将所得到的土壤样品先第一次加入10ML蒸馏水中进行稀释，静置，沉淀，取1ML上清液到另一干净的试管中，加蒸馏水定容至10ML,重复上述步骤4次，得到五种不同浓度的稀释液。
新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术
新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术新疆是我国重要的棉花种植区域之一，然而，近年来，新疆棉花枯黄萎病的发生频率有所增加，给棉花产业带来了巨大的损失。
为了有效应对这一问题，科研人员开展了大量的研究工作，包括病原菌的快速分离技术。
新疆棉花枯黄萎病是由一种名为枯黄萎菌（Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum）引起的真菌病。
该病的发生与土壤中的病原菌密切相关，通常在入冬后土壤温度下降到一定水平后，该菌便开始发生孢子萌发，使棉花根系和茎基部发生感染，导致棉花枯黄、凋萎。
这一病害的发生会引起棉花减产甚至死亡，给农民带来重大损失。
针对新疆棉花枯黄萎病的发生情况，科研人员进行了深入的调查研究。
在这些研究中，他们发现病原菌的分离对于诊断和管理该病害至关重要。
然而，传统的分离方法耗时耗力，需要经过多次梯度离心、分液培养等步骤，且效果不稳定。
因此，科研人员致力于开发一种快速分离技术，以提高分离效率和准确性。
目前，一种基于PCR技术的快速分离方法已经成功研发出来。
这种方法首先对感染棉花的根部和茎部进行采样，然后利用一系列的试剂和步骤将病原菌的DNA从样本中提取出来。
提取的DNA可以通过PCR扩增特定的基因片段，从而确定病原菌的存在。
之后，可以将扩增的DNA进行测序分析，进一步确定病原菌的种类和亚种。
通过这种快速分离技术，科研人员能够在短时间内准确地分离出病原菌，并对其进行深入的研究。
新疆棉花枯黄萎病的发生对棉花产业带来了严重的影响，但通过快速分离技术，病原菌的种类和亚种可以得以准确确定，为针对该病的防治提供了有力的科学依据。
希望通过科研人员的不断努力，能够找到更加有效的防治方法，保护新疆棉花产业的健康发展。
新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术
新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术随着新疆棉花种植规模的不断扩大和化肥农药使用量的增加，棉花枯黄萎病的发生率也不断升高。
棉花枯黄萎病是由灰色霉菌引起的一种全株性病害，能够引起棉花植株的迅速枯死，严重影响棉花产量和质量。
目前，新疆棉花枯黄萎病的病原菌鉴定和快速分离技术已经引起了广泛关注。
棉花枯黄萎病的发生与环境因素、病菌、寄主三者的交互作用有关。
新疆地处干旱、温差大的荒漠化区域，气候条件逐渐变得极端，气象条件对棉花生长和病害的发生都有重要影响。
病菌的存在是病害发生的前提条件，病菌传播途径主要包括种子、土壤、空气、水等多种途径。
寄主作物的品种、年龄、栽培措施等也会影响病害的发生和大面积流行。
因此，如何对新疆棉花枯黄萎病进行病原菌鉴定和快速分离技术的研究具有重要意义。
目前，新疆棉花枯黄萎病的快速分离技术主要包括传统分离法、生物学分离法和分子生物学分离法。
其中，分子生物学分离法已经成为新疆棉花枯黄萎病病原菌鉴定的主要方法。
传统分离法主要是通过分离病植物的病原菌进行鉴定，该方法具有操作简单、成本低廉等优点。
但是，传统分离法存在分离容易出现假阳性或假阴性的情况，同时这种方法只能单独鉴定某个特定的病原菌。
生物学分离法则是通过生物学实验手段将病原菌与其他微生物分离出来。
该方法相对综合性较强，能够一次性鉴定多种病原菌。
但是，生物学分离法存在操作复杂、耗时费力等缺点。
分子生物学分离法则是通过基因分子技术手段进行分离，无需对微生物进行培养，具有高度的特异性和敏感性。
该方法能够对样本进行深度测序和分子鉴定，可以实现大规模病原菌的分离和鉴定。
同时，该方法对样本种类无要求，操作简单、灵敏度高、快速性强、结果准确可靠等优点，已被广泛应用于新疆棉花枯黄萎病的病原菌鉴定中。
总的来说，针对新疆棉花枯黄萎病的发生现状，分子生物学分离法已经成为重要的技术手段，能够实现快速而准确地分离出病原菌，为病害防治提供了重要的科学依据。
未来，随着技术的不断升级和改进，新疆棉花枯黄萎病的防治将更加科学、有效。
棉花落叶型黄萎病菌的检测技术
棉花落叶型黄萎病菌的检测技术棉花落叶型黄萎病菌检测技术1、简介棉花落叶型黄萎病菌（verticilliumdahliae）是一种严重危害棉花栽培的菌种，在全球棉花生产中十分普遍。
其有害症状特别以叶底出现黄斑为主，继而影响全株发育，形成植株衰败和死亡，导致棉花收量下降、质量下降等，成为棉花种植技术难以克服的棉花病害之一。
2、棉花落叶型黄萎病菌的检测技术（1）采集棉籽利用采集落叶、抽梗或刈割棉籽都可以获得新鲜的未受病害影响的植株进行鉴定病原。
（2）分离检测根据分离病原的要求，将落叶的植株置于落叶型黄萎病菌富含的培养基（比如牛乳糖培养基）中，然后在25℃条件下移植培养。
（3）形态特征的鉴定通过棉花落叶型黄萎病菌的渲染，便能发现其细胞壁表面拥有明显的条纹和线状，而内部则具有一定间距的奈米线和海马状结构。
随着培养时间的延长，会形成大量的担子孢子，这可以被显微镜观察到。
（4）分子记录技术分子技术是该菌的检测技术的一种重要手段，可以用来鉴别和测定棉花落叶型黄萎病菌的特定特异碱基序列。
PCR技术是使用聚合酶链反应，可以通过检测棉花落叶型黄萎病菌特征性标记基因，进行病原种型检测。
（5）抗性诊断抗药性诊断根据棉花落叶型黄萎病菌病原抗药性耐受特点，可以采用化学防治抗药性诊断技术，依据病原对抗药性剂的敏感性以及抗药性状态，针对病原进行采取科学的施药策略，也就是抗药性诊断技术。
3、结论合理使用棉花落叶型黄萎病菌检测技术，能有效地帮助人们及时果断收集病原，以便建立准确的诊断标准，有效识别棉花落叶型黄萎病菌，从而为其控制提供重要的依据手段。
棉花黄萎病拮抗菌株DS45-2的分离鉴定
Ａｂｓｒ ｃ ：Ｔ ｈｅ ｓ ｒ ｉ ｓ ｗ ｉｈ ａ ａ ｎ ｓ ｉ ｃ ｉ ｉｙ ａ ａ ｎｓ ｒ ｉｉ ｌｕ ｈｌａｅ ｔａ ｔ ｔ ａ ｎ ｔ ｎｔ ｇｏ ｉ ｔｃ ａ ｔｖ ｔ ｇ ｉ ｔＶｅ ｔｃ ｌ ｉ ｍ ｄａ ｉ Ｋｌ ｂ． ｅ ｅ ｓ ｒ ｅ ｄ ｅ ｗ ｒ ｃ ｅ ｎｅ
ａｍ ｙｌ ｌ ｑ ｅ ｏ ｉ ｕ ｃｅ ｓ ｉｎ
棉 花 黄 萎 病 是 由 大 丽 轮 枝 菌 （ ｅｔ ｉ ｉｍ Ｖ ｒｉ ｌ ｕ ｃｌ
ｄ ｈ ｉｅＫｌｂ 引 起 的 一 种 维 管 束 系 统 病 害 ， 时 也 ａｌ ｅ） ａ 同
们关注 的热 点课 题 “ 。而 获 得 高效 拮抗 菌 和 掌握 ］ 其基本特性是 生 物 防治的 基础 ， 鉴此 ， 已筛选 出的 就 对大丽轮枝菌具 有较高拮抗活性 的菌株 ， 进行 了形态 观察 、 生理生 化 试 验 和 １Ｓ ｒ ＮＡ 的序 列分 析 ， ６ Ｄ 并对 其 中活性相对较 高的菌株 Ｄ ４ — 进行 了菌种鉴定 。 Ｓ ５２
Ｂａ ｅ ｎｔ ｅｒ ｓ ｌ ．ｈ ｔａｎ ｗａ ｎ ｔ ｌ ｄ ｎ ｉ ｅ ｓａＢａ ｉｌ ｓ ｍｙ ｏ ｉｕ ａ ｉｎ ． ｅ ｓ ｉ ｓｄ ｏ ｈ ｅ ｕ ｔ ｔ ｅ ｓｒ ｉ ｓｉｉ ａｌ ｉｅ ｔ ｉｄ ａ ｃｌｕ ｓ ｉ ｙ ｆ ａ ｔｌｑ ｅ ｃｅ ｓ Ｔｈ ｉ ～ ｆ ｍ
ｃｌｕ ｍｙ ｏ ｉ ｕ ｆ ｃｅ ｓ ｗａ ｌｓ ｏ ９ ． ０ ． ｉｌ ｓ ａ ｌｌｑ ｅ ａ ｉｎ ｓｃｏ ｅｔ ９ ５
Ｋｅ ｒ ：Ｖｅ ｔｃ ｌ ｉ ｍ ｈｌａｅ ｙ ｗｏ ｄｓ ｒ ｉ ｉｌｕ ｄａ ｉ Ｋｌｂ；Ａｎ ａ ｏ ｓ ｉ ｃ ｅ ｉ ｅ ｔ ｇ ｎｉｔｃ ｂａ ｔ ｒａ；Ｉ ｏ ａ ｉ ｓ ｌ ｔｏｎ；Ｉ ｅ ｉｉａ ｉ ｎ；Ｂａ ｉｌ ｄ ｎｔｆｃ ｔｏ ｃ ｌｕｓ
棉花黄萎病菌的分离及培养技术研究
编号：审定成绩：重庆邮电大学毕业设计（论文）设计（论文）题目：棉花黄萎病菌的分离及培养技术研究学院名称：生物信息学院学生姓名：专业：生物技术班级：学号：指导教师：江怀仲答辩组负责人：填表时间：2015 年5月重庆邮电大学教务处制摘要棉花黄萎病（Verticillium Wilt of Cotton）是一种土传性的维管束系统病害，严重影响棉花产量和质量，有人称它为“癌症”。
病害发生的关键因子，除了品种抗病性较低和适宜的气候条件外，土壤中棉花黄萎病菌的大量积累是棉花黄萎病发生流行的主要原因。
据国外报道，棉花黄萎病菌形成的休眠结构——微菌核，可以在土壤中常年存活，并成为危害侵染循环中最重要的侵染源。
在全球因黄萎病所造成的经济损失平均每年达10亿多美元，筛选利用抗病品种是防治黄萎病最经济有效的途径之一，而品种的筛选与鉴定及相关研究都需要分离和培养黄萎病菌种。
本研究通过查阅现有文献和结合现有实验条件，采集四川简阳棉花地里耕作层土壤、棉花根际土壤作为病菌分离材料，然后用最简单有效的逐步稀释法稀释样本，并将稀释液涂布在PDA培养基上。
根据生长出来的菌落形态和颜色等特征，挑取单菌落再用平板培养法分离出纯化的棉花黄萎病菌。
然后将所得的棉花黄萎病菌用不同液体培养基对照培养，从而选择出一种最利于棉花黄萎病菌生长的培养基，以利于将分离纯化出的棉花黄萎病菌培养成可供应用的黄萎菌液，供相关研应究用。
将采集的四份土壤样本，稀释成10-1、10-2、10-3不同浓度，涂布平板和平板培养后得到了4株纯化的真菌，经过鉴定最终得到了1株纯化的棉花黄萎病菌。
然后用不同液体培养基对棉花黄萎病菌对照培养，得出淘米水培养基培养的棉花黄萎病菌以微菌核形式为主；察氏液体培养基培养出来的棉花黄萎病菌含有较多菌丝和孢子；马丁氏培养基培养出来的棉花黄萎病菌以含孢子为主。
【关键词】棉花黄萎病菌分离和培养液体培养基ABSTRACTVerticillium Wilt of Cotton is one of the main diseases which affecting the yield and quality of the cotton. The key factor of the disease, in addition to less resistant varieties and appropriate climate conditions, the accumulation of a large number of Verticillium dahliae in soil is the main reason which cotton Verticillium wilt is popular. According to foreign reports, sleeping structure ——micro-sclerotia which Verticillium dahliae formed can survive in soil all the year round and become the most important infection source of against infection cycle. In the world, the economic loss caused by Verticillium wilt account for one billion U.S. Dollars average every year, one of the most cost-effective ways which control Verticillium wilt is filtering and using resistant varieties, while screening and identification of the species and related research all need to isolate and culture Verticillium species.In this study, according to search the existing literature with the existing experimental conditions, we collected farming soil and rhizosphere soil from cotton of Sichuan Jianyang as bacteria isolated material, and then gradually dilute the sample, and coating the dilution on the PDA medium. Based on the growth characteristics of colony, such as shape and color, we can pick a single colony and culture it on the medium. In this way, we can isolate and select the purified Verticillium dahliae. And then Verticillium dahliae were cultured with different liquid medium. So that selecting one of the most favorable medium for the growth of Verticillium dahliae, in order to culture the isolated and purified Verticillium dahliae into yellow wilt bacterium，for research applications.Diluting the four soil samples which collected from Jianyang, into different concentrations of 10-1,10-2,10-3.Plating culture after coating plate, we get four sets of purified fungi. After identification, I get a set of purified Verticillium dahliae. Then using different liquid media to culture Verticillium dahliae, finally, from the reproduction of Verticillium dahliae, we can draw a conclusion, after using Taomi Shui medium to culture Verticillium dahliae, obtained a lot of micro-sclerotia; using Czapek liquid medium to culture, obtained many mycelium and spores; using Mading Shi medium to culture, obtained many spores.【Key words】Verticillium dahliae Isolation and Culture liquid medium目录前言 (1)第一章棉花黄萎病菌概述 (2)第一节棉花黄萎病菌的形态特征 (2)第二节棉黄黄萎病发病症状 (2)第三节棉花黄萎病菌的传播及防治方法 (4)第四节研究目的及意义 (5)第二章棉花黄萎病菌的分离 (6)第一节实验材料 (6)第二节实验方法 (8)第三节实验结果与分析 (12)第三章棉花黄萎病菌的培养 (16)第一节实验材料 (16)第二节实验方法 (17)第三节培养结果 (18)第四节本章小结 (21)结论 (23)致谢 (24)参考文献 (25)附录 (26)一、英文原文 (26)二、英文翻译 (36)前言我国是棉花产量最高的国家之一，棉花种植最早出现在公元前4-5千年的印度河流域文明中。
新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术
新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术新疆是中国棉花的主要产区之一，其棉花产量占据全国的重要地位。
近年来，新疆棉花枯黄萎病的发生频率逐渐增加，给棉农造成了严重的损失。
为了有效应对新疆棉花枯黄萎病的发生，科研人员积极探索快速分离技术，以提高病原菌的检测效率。
本文将就新疆棉花枯黄萎病的发生现状以及其快速分离技术进行详细介绍。
一、新疆棉花枯黄萎病的发生现状1. 发病原因新疆棉花枯黄萎病是由真菌引起的一种病害，主要发生在棉花的生长期，尤其是在高温潮湿的环境下更易发生。
病原菌侵入植物体内后，会破坏植物的细胞结构，导致棉花枯黄、凋萎甚至死亡。
2. 发病特点新疆棉花枯黄萎病的发病特点主要表现在以下几个方面：（1）叶片出现黄化、枯黄、倒卷等症状；（2）受害部位出现褐色或黑色腐烂，并伴有瘪紧现象；（3）影响植株的生长，减少产量，严重时会导致植株死亡。
3. 严重性新疆棉花枯黄萎病的发生不仅严重影响了棉花的产量和品质，还给棉农带来了经济损失。
针对这一情况，科研人员积极探索新的防治方法和快速检测技术，以期减少病害对棉花生产的影响。
二、新疆棉花枯黄萎病快速分离技术针对新疆棉花枯黄萎病的发生现状，科研人员进行了大量的研究工作，提出了一种快速分离病原菌的技术，以提高病原菌的检测效率。
1. 样品处理在进行病原菌的分离技术之前，首先需要对植物组织样品进行处理。
科研人员通常会选择出现症状严重的植株作为分离样品，然后进行样品的表面消毒处理，以避免外源菌的干扰。
接下来，将植物组织样品切割成小块，利用特定的培养基进行培养。
2. 菌株分离科研人员通常会选择利用琼脂平板培养，利用特定的培养基诱导病原菌的生长。
在培养基上，将经过处理的植物组织样品放置并进行孵育，随后观察病原菌的生长情况，在出现纯培养的病原菌菌落后，进行单菌落分离。
3. 病原菌鉴定在分离到病原菌后，科研人员需要进行鉴定工作，确定病原菌的种属和特性。
通过形态学特征观察、生理生化实验和分子生物学方法，可以确定病原菌的种属和鉴定。
新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术
新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术新疆棉花枯黄萎病（Cotton Fusarium Wilt）是一种由枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum）引起的严重病害，广泛分布于新疆棉区，给棉花生产造成了严重的危害。
本文将介绍新疆棉花枯黄萎病的发生现状以及一种快速分离技术。
一、新疆棉花枯黄萎病的发生现状新疆是我国重要的棉花生产大省，然而枯黄萎病的发生给新疆的棉花生产带来了巨大的损失。
该病害主要发生在棉花生育期，特点是叶片枯黄，枝条和根部出现萎蔫症状。
枯黄萎病菌主要通过种子、田间土壤以及气溶胶传播，并且能存活多年。
近年来，新疆棉区的枯黄萎病发生频率逐年上升，给棉农生产带来了严重的经济损失。
二、枯黄萎病菌的快速分离技术为了及时诊断和控制枯黄萎病的传播，开展快速分离技术十分重要。
下面介绍一种简单快捷的分离方法。
1. 准备材料（1）新鲜感染的棉花样本（2）高等级无菌培养基（3）无菌培养皿（4）显微镜和显微镜玻璃片2. 分离过程（1）将新鲜感染的棉花样本（如叶片、枝条或根部）剪碎，并用无菌蒸馏水冲洗，去除表面附着的土壤颗粒。
（2）将洗净的样本均匀涂抹到无菌培养基表面。
（3）将培养皿盖上并密封，放在恒温培养箱中（温度保持在25℃左右），进行孵化。
（4）观察培养皿中的菌落，一般情况下，枯黄萎病菌会在培养基上形成白色至淡黄色的菌丝，并逐渐扩散。
（5）选取一些典型的菌落，通过显微镜观察其形态特征，如孢子形状、颜色等，确定是否为枯黄萎病菌。
总结：随着新疆棉花枯黄萎病的频繁发生，研究该病害的发生现状并开展快速分离技术显得尤为重要。
本文介绍了新疆棉花枯黄萎病的发生现状，并提供了一种简单快捷的分离方法，希望能对相关研究和防控实践提供参考。
棉花枯萎病和黄萎病的防治方法
棉花枯萎病和黄萎病的防治方法
棉花枯萎病和黄萎病是棉花生产中常见的病害，对棉花生长发育和产量产生严重影响。
以下是棉花枯萎病和黄萎病的防治方法：
1. 合理选择品种：选用抗病性强的品种进行种植，能有效降低病害发生的可能性。
2. 土壤消毒：使用化学或物理方法对土壤进行消毒，减少土壤中病菌的种子及病菌的数量。
常用的方法有熏蒸、高温烘烤等。
3. 轮作休闲：合理安排棉花的轮作休闲制度，减少病害在土壤中的传播和积累，降低发病风险。
4. 土壤改良：合理施用有机肥料或有机质改良剂，增加土壤有机质含量，提高土壤结构，增强土壤养分供应能力，提高棉花抗病能力。
5. 密植增密：适度密植棉花，增加棉田内棉花的遮阴效果，降低病原菌的传播速度，减少病害发生的风险。
6. 合理施肥：根据土壤检测结果进行施肥，合理掌握氮、磷、钾等养分的供应量，维持棉花生长发育的平衡，并增强棉花的抵抗力。
7. 及时发现病害：定期巡视田间，及时发现病害发生的迹象，采取相应的治疗措施，比如使用药剂进行农药喷施，控制病害
的蔓延。
8. 病部清除：发现病害植株及时将其拔除，避免病原菌通过继续感染其他植株。
请注意，具体的防治方法应根据病害的不同、当地的实际情况以及农业专家的建议来采取。
同时，合理施用农药应遵循农药使用安全规范，避免对环境和生态造成不良影响。
新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术
新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术新疆棉花枯黄萎病是一种由土壤真菌引起的重要病害，对棉花产量和质量造成严重影响。
本文通过调研总结了新疆棉花枯黄萎病的发生现状，并介绍了一种快速分离技术。
新疆棉花枯黄萎病的发生现状主要表现为发病面积广泛、发病程度严重以及增长速度快的特点。
该病害在新疆棉区广泛分布，且近年来发病趋势不断增加。
病害发生主要集中在6月至8月间，温度高、降水少且土壤湿度适宜时发病最为严重。
特别是长时间的干旱和高温天气是枯黄萎病流行的主要原因。
新疆棉花枯黄萎病的主要症状是叶片黄化、枯黄以及整株死亡。
受害棉花植株叶片逐渐变黄，干枯，并逐渐展开。
有的植株枯死表现南面、北面两侧，中部基部存活。
受害幼苗、幼株枝条折断并发生腐烂。
严重发病状况下，整片棉田化为犁状，片孔似旱地犁田后留下之犁沟一般，幼苗几乎全株死亡。
针对这一病害，研究人员开发了一种快速分离技术，可以快速准确地分离出引起棉花枯黄萎病的病原真菌。
该技术的主要步骤包括采集病株样本、清洗处理、消毒处理以及分离培养。
采集病株样本时应选择病情最严重的植株，并将病部切下，避免污染其他健康部分。
然后，使用去离子水等清洗处理病株样本，将样本表面的土壤和杂质清洗干净。
接下来，使用10%的氧化汞溶液进行消毒处理，将病株样本浸泡在溶液中10分钟，然后用去离子水漂洗3次，以确保样本完全消毒。
将样本切成小块并在培养基上进行分离培养，待真菌生长形成菌落后进行鉴定。
该技术可以在短时间内分离出病原真菌，并为后续的病害防治提供有效的依据。
新疆棉花枯黄萎病的发生现状较为严重，对棉花产量和质量造成了很大的影响。
为了加强对这一病害的研究和防治工作，开发一种快速分离技术对于准确鉴定病原真菌和制定科学合理的防治策略具有重要意义。
新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术
新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术
近年来，新疆棉花枯黄萎病（Cotton Wilt）的发病率逐年上升，严重影响了新疆棉花生产的稳定性和效益。
该病症表现为棉花植株中部出现大量枯黄或褐化的病征，并随着病情加重，整株棉花早期衰老和死亡。
目前，研究发现该病症是由一种土壤病菌引起的，这种病菌是一种革兰氏阴性菌，且生活在土壤中的时间非常悠久，常常会形成一定的菌群，更加威胁棉花的生长和发展。
为了尽快解决这一问题，科研人员对棉花枯黄萎病进行了快速分离技术的研究。
该技术主要包括三个步骤。
第一步，在田间采集病发棉花根际土壤，保持土壤湿润，并尽可能地去除棉花根系中的杂菌和泥沙等物质。
第二步，将采集到的病发土壤样本分别转移到富含营养成分的平板培养基和液体培养基上。
在平板上，将土壤细菌直接进行分离和单菌挑选；而在液体培养基上，则使用分离菌体的方法，成功分离出纯净的菌株。
第三步，对所得到的细菌株进行鉴定和分类，以便更好地了解该病菌的特性和基因组结构，从而寻找更为有效的治疗方法。
通过这一快速分离技术，科研人员可以尽快地确定病原体的类型、数量和病菌的发病机制等相关信息，为治疗和控制棉花枯黄萎病提供可靠的理论和实践支持。
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土壤棉花黄萎病分离方法
方案一、土壤稀释分离法
供试药剂：牛胆盐、链霉素、1%六偏磷酸钠、
供试仪器：
一、培养基制备
马铃薯200g，琼脂17g，葡萄糖g，蒸馏水1000ml，高压灭菌冷却至45℃时，按每100ml 培养基分别加入牛胆盐和链霉素各50mg。
二、土样选择
选取棉花耕作层0~20cm层内土样(此区域内微菌核数量与田间病害发病有密切联系)。
三、分离方法
1、洗涤微菌核取自然风干过筛的病田土样100mg，置盛200ml含有1%六偏磷酸钠无菌水的三角瓶内，摇动10min后，静止5min，弃去清液，留残渣液20ml于瓶底，连续洗涤5次。
将最后一次的20ml残渣液置于培养基上，每皿1ml，均匀涂抹于表面，24℃左右培养10~15d。
2、观察微菌核肉眼从培养皿背面看到菌落时，用蜡笔做出标记，再用低倍显微镜观察鉴定，将显微镜下确认的棉花黄萎病菌微菌核移出纯化。
（棉田土壤黄萎病菌微菌核的研究，吕金殿，杨家荣，吉冉中）1990
方案二
真菌、细菌、放线菌、霉菌土壤稀释分离法
供试药剂：
供试仪器：玻璃珠。
1．取土壤
取表层以下5—10cm 处的土样．放入灭菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。
2．制备稀释液，土壤稀释法，(要无菌操作)
(1) 制备土壤悬液：称土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底为最好)，振荡5—10min使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。
(2) 稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0．5mL．放入4．5mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3一10-8的稀释液(真菌10-3~10-1)。
注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用1 支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸 3 次，每次吸上的液面要高于一次，以减少稀释中的误差。
（微生物实验指导）
方案三、水筛法分离及微菌核计数方法
供试药剂：NaNO
，MgSO4•7H2O，K2HPO4，Fe2(SO4)3•7H2O，KCl，氯霉素，井冈霉
3
素，
五氯硝基苯，克菌丹，1%多聚磷酸钠，0.01%Tergitol—NPX。
供试仪器：组织搅拌器（8000r/min），0.125mm筛网，0.0385mm筛网。
一、制备培养基
棉选一号
NaNO32g，MgSO4•7H2O 0.5g，K2HPO4 1g，Fe2(SO4)3•7H2O 0.01g，KCl 0.5g，蔗糖5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，氯霉素300mg，井冈霉素2.5ppm（mg/kg），五氯硝基苯350ppm（mg/kg），克菌丹0.5ppm（mg/kg）。
灭菌后添加。
注意：
1、五氯硝基苯：有毒，不可直接接触。
熔点：144℃，沸点：328℃，相对密度（水＝1）1.72，可燃，不溶于水，微溶于醇、苯、氯仿、二硫化碳。
在高温干燥的条件下会爆炸分解，对环境有严重危害，应特别注意对水体的污染。
2、克菌丹：有毒，不可直接接触。
熔点：178℃，沸点：314.2℃，在中性或酸性条件下稳定，在高温和碱性条件下易水解。
二、水筛法分离
1、采用5点取样法，从棉花耕作层0~20cm深处采取病土，每点100g，5点共采集500g病土，置室内自然风干5d左右。
2、将风干土样倒入消毒搪瓷杯内并加入10枚1~1.2cm大小的洁净鹅卵石，振荡15min，使土样粉碎。
3、称取上述土样2.5g，共6份，每份土样分别放入200ml内含1%多聚磷酸钠及
0.01%Tergitol—NPX（表面活性剂—）的水溶液内，依次倒入组织搅拌器内，以8000r/min 搅拌15s。
4、将此土壤悬浮液倒入上层孔径为0.125mm，下层孔径为0.0385mm的双层细筛里，在水流下降泥土冲洗干净，用吸管吸取10ml无菌水，将下层洗好后的残渣冲洗到消毒的培养皿内备用。
5、将洗好的6分土壤残渣液，每份均匀涂抹于5个盛有供试培养基（棉选一号）平皿的表面，并将平皿置24~25℃恒温箱内培养14d后取出，用自来水洗去平皿表面泥土，再用肉眼或低倍显微镜经行检查。
6、计数方法：平板上每个黄萎病菌落假设来源于一个单个微菌核，计算5个平板上的菌落总数，即等于2.5g土样中的微菌核数。
三、回接试验:
1、将棉选一号培养基上分离到的黄萎病菌菌落，用PDA培养基纯化培养10天。
2、待回接试验所用的纸钵内棉苗长到1一2 片真叶时，将纯化后的菌种，用无菌水配翘成每耐含3*107 个泡子悬浮液。
3、每纸钵量取10 m l上述悬浮液，用纸钵蘸根法进行回接，共接菌10个纸钵，每纸钵5 一6 个棉苗，以清水蘸根作对照。
4、病菌后的棉苗放入25℃的光照培养箱内，25天后调查发病情况，并将病株用PDA培养基进行再分离。
（棉黄萎病菌选择性培养基一一棉选一号，籍秀琴，未颖初）1988
方案四、水筛法分离及微菌核计数方法
供试药剂：棉籽饼、金霉素、五氯硝基苯(PCNG)、1 % 六偏磷酸钠(Calgon)、0.5%NaOCl。
供试仪器：129目（0.113mm）筛网、400目（0.038mm）筛网。
1、棉籽培养基（培养基是由8种选择性培养基的比较后改良而来的）
棉籽饼粉10g，蒸馏水500ml，煮沸15~20min，过滤，取滤液并补蒸馏水至1000ml，加入琼脂10g，高压灭菌（121℃，30min），冷却至50℃后加PCNB(五氯硝基苯) 1g，金霉素5mg。
2、水筛法：称取10g风干一周以上的供试土样，悬浮在2 0 m l含有1 % Calgon(六偏磷酸钠)和0.01 % Tergitol一N P X 溶液中，用组织搅拌机( 800一1,000 r/min ) 搅拌30秒，让土粒充分分散。
3、过重叠的129目和400目筛子，将截留物放到0.5% NaOCl溶液中漂洗两次进行表面灭菌，每次10秒，再用冷开水冲洗残留的NaOCl，最后用水把截留物洗入大试管或小烧杯中。
4、用10 m l大口吸管或汤匙把筛滤物均匀分布在10个盛有培养基的培养皿内，培养皿正放于,25一28℃下培养10天左右。
培养后置培养皿于解剖镜下或低倍显微镜下检查有无黑色的微菌核。
5、10个平板为一组所形成的微菌核总数就等于10g土壤中的微菌核的数量。
计算公式是
N2为每克土中微菌核数；N1为10个平板中每皿各数30个视野的微菌核平均数；R1为视野的半径；R2为培养皿的半径。
(《中国农业科学》1987年第01期，土壤中棉花黄萎病菌微菌核的分离和计数方法，林先贵）1987
方案五、水筛法分离
供试药剂：l% 多聚磷酸钠、0.015%Tergitol、0.13 %氯霉素、0.08 %红霉素。
供试仪器：DS200型组织捣碎机、100目筛网，400目筛网。
1、称取0 .75g供测土样，置于l% 多聚磷酸钠和0.015%Tergitol的水溶液中，充分搅拌10秒钟(DS200型组织捣碎机) ；
2、水筛法：再经上层100目，下层400目筛网上流水冲洗。
将400目筛网上含有微菌核的残留物，以0.1 %次氯酸钠水溶液表面消毒90秒，
3、转移至含有0.13 %氯霉素和0.08 %红霉素的无菌水溶液中，置于25 ℃恒温箱内2一3 天，微菌核萌芽后，直接镜检计数微菌核的萌芽数。
（土壤中棉花黄萎病菌分离法之一，夏正俊顾本康李经仪陈春泉）1991。