土壤棉花黄萎病菌分离方法

土壤棉花黄萎病分离方法

方案一、土壤稀释分离法

供试药剂：牛胆盐、链霉素、1%六偏磷酸钠、

供试仪器：

一、培养基制备

马铃薯200g，琼脂17g，葡萄糖g，蒸馏水1000ml，高压灭菌冷却至45℃时，按每100ml 培养基分别加入牛胆盐和链霉素各50mg。

二、土样选择

选取棉花耕作层0~20cm层内土样(此区域内微菌核数量与田间病害发病有密切联系)。

三、分离方法

1、洗涤微菌核取自然风干过筛的病田土样100mg，置盛200ml含有1%六偏磷酸钠无菌水的三角瓶内，摇动10min后，静止5min，弃去清液，留残渣液20ml于瓶底，连续洗涤5次。将最后一次的20ml残渣液置于培养基上，每皿1ml，均匀涂抹于表面，24℃左右培养10~15d。

2、观察微菌核肉眼从培养皿背面看到菌落时，用蜡笔做出标记，再用低倍显微镜观察鉴定，将显微镜下确认的棉花黄萎病菌微菌核移出纯化。

（棉田土壤黄萎病菌微菌核的研究，吕金殿，杨家荣，吉冉中）1990

方案二

真菌、细菌、放线菌、霉菌土壤稀释分离法

供试药剂：

供试仪器：玻璃珠。

1．取土壤

取表层以下5—10cm 处的土样．放入灭菌的袋中备用，或放在4℃冰箱中暂存。

2．制备稀释液，土壤稀释法，(要无菌操作)

(1) 制备土壤悬液：称土样0.5g，迅速倒入带玻璃珠的无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底为最好)，振荡5—10min使土样充分打散，即成为10-2的土壤悬液。

(2) 稀释：用无菌移液管吸10-2的土壤悬液0．5mL．放入4．5mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3一10-8的稀释液(真菌10-3~10-1)。

注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用1 支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸 3 次，每次吸上的液面要高于一次，以减少稀释中的误差。

（微生物实验指导）

方案三、水筛法分离及微菌核计数方法

供试药剂：NaNO

，MgSO4•7H2O，K2HPO4，Fe2(SO4)3•7H2O，KCl，氯霉素，井冈霉

3

素，

五氯硝基苯，克菌丹，1%多聚磷酸钠，0.01%Tergitol—NPX。

供试仪器：组织搅拌器（8000r/min），0.125mm筛网，0.0385mm筛网。

一、制备培养基

棉选一号

NaNO32g，MgSO4•7H2O 0.5g，K2HPO4 1g，Fe2(SO4)3•7H2O 0.01g，KCl 0.5g，蔗糖5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，氯霉素300mg，井冈霉素2.5ppm（mg/kg），五氯硝基苯350ppm（mg/kg），克菌丹0.5ppm（mg/kg）。灭菌后添加。

注意：

1、五氯硝基苯：有毒，不可直接接触。熔点：144℃，沸点：328℃，相对密度（水＝1）1.72，可燃，不溶于水，微溶于醇、苯、氯仿、二硫化碳。在高温干燥的条件下会爆炸分解，对环境有严重危害，应特别注意对水体的污染。

2、克菌丹：有毒，不可直接接触。熔点：178℃，沸点：314.2℃，在中性或酸性条件下稳定，在高温和碱性条件下易水解。

二、水筛法分离

1、采用5点取样法，从棉花耕作层0~20cm深处采取病土，每点100g，5点共采集500g病土，置室内自然风干5d左右。

2、将风干土样倒入消毒搪瓷杯内并加入10枚1~1.2cm大小的洁净鹅卵石，振荡15min，使土样粉碎。

3、称取上述土样2.5g，共6份，每份土样分别放入200ml内含1%多聚磷酸钠及

0.01%Tergitol—NPX（表面活性剂—）的水溶液内，依次倒入组织搅拌器内，以8000r/min 搅拌15s。

4、将此土壤悬浮液倒入上层孔径为0.125mm，下层孔径为0.0385mm的双层细筛里，在水流下降泥土冲洗干净，用吸管吸取10ml无菌水，将下层洗好后的残渣冲洗到消毒的培养皿内备用。

5、将洗好的6分土壤残渣液，每份均匀涂抹于5个盛有供试培养基（棉选一号）平皿的表面，并将平皿置24~25℃恒温箱内培养14d后取出，用自来水洗去平皿表面泥土，再用肉眼或低倍显微镜经行检查。

6、计数方法：平板上每个黄萎病菌落假设来源于一个单个微菌核，计算5个平板上的菌落总数，即等于2.5g土样中的微菌核数。

三、回接试验:

1、将棉选一号培养基上分离到的黄萎病菌菌落，用PDA培养基纯化培养10天。

2、待回接试验所用的纸钵内棉苗长到1一2 片真叶时，将纯化后的菌种，用无菌水配翘成每耐含3*107 个泡子悬浮液。

3、每纸钵量取10 m l上述悬浮液，用纸钵蘸根法进行回接，共接菌10个纸钵，每纸钵5 一6 个棉苗，以清水蘸根作对照。

4、病菌后的棉苗放入25℃的光照培养箱内，25天后调查发病情况，并将病株用PDA培养基进行再分离。

（棉黄萎病菌选择性培养基一一棉选一号，籍秀琴，未颖初）1988

方案四、水筛法分离及微菌核计数方法

供试药剂：棉籽饼、金霉素、五氯硝基苯(PCNG)、1 % 六偏磷酸钠(Calgon)、0.5%NaOCl。供试仪器：129目（0.113mm）筛网、400目（0.038mm）筛网。

1、棉籽培养基（培养基是由8种选择性培养基的比较后改良而来的）

棉籽饼粉10g，蒸馏水500ml，煮沸15~20min，过滤，取滤液并补蒸馏水至1000ml，加入琼脂10g，高压灭菌（121℃，30min），冷却至50℃后加PCNB(五氯硝基苯) 1g，金霉素5mg。

2、水筛法：称取10g风干一周以上的供试土样，悬浮在2 0 m l含有1 % Calgon(六偏磷酸钠)和0.01 % Tergitol一N P X 溶液中，用组织搅拌机( 800一1,000 r/min ) 搅拌30秒，让土粒充分分散。

3、过重叠的129目和400目筛子，将截留物放到0.5% NaOCl溶液中漂洗两次进行表面灭菌，每次10秒，再用冷开水冲洗残留的NaOCl，最后用水把截留物洗入大试管或小烧杯中。

4、用10 m l大口吸管或汤匙把筛滤物均匀分布在10个盛有培养基的培养皿内，培养皿正放于,25一28℃下培养10天左右。培养后置培养皿于解剖镜下或低倍显微镜下检查有无黑色的微菌核。

5、10个平板为一组所形成的微菌核总数就等于10g土壤中的微菌核的数量。

计算公式是

N2为每克土中微菌核数；N1为10个平板中每皿各数30个视野的微菌核平均数；R1为视野的半径；R2为培养皿的半径。

(《中国农业科学》1987年第01期，土壤中棉花黄萎病菌微菌核的分离和计数方法，林先贵）1987

方案五、水筛法分离

供试药剂：l% 多聚磷酸钠、0.015%Tergitol、0.13 %氯霉素、0.08 %红霉素。

供试仪器：DS200型组织捣碎机、100目筛网，400目筛网。

1、称取0 .75g供测土样，置于l% 多聚磷酸钠和0.015%Tergitol的水溶液中，充分搅拌10秒钟(DS200型组织捣碎机) ；

2、水筛法：再经上层100目，下层400目筛网上流水冲洗。将400目筛网上含有微菌核的残留物，以0.1 %次氯酸钠水溶液表面消毒90秒，

3、转移至含有0.13 %氯霉素和0.08 %红霉素的无菌水溶液中，置于25 ℃恒温箱内2一3 天，微菌核萌芽后，直接镜检计数微菌核的萌芽数。

（土壤中棉花黄萎病菌分离法之一，夏正俊顾本康李经仪陈春泉）1991