酵母菌杂交育种
酵母三杂交
酵母三杂交引言：酵母三杂交是一种通过将三个不同的酵母株杂交在一起的方法，以产生新的酵母品种。
这种杂交技术在酿酒、面包和其他发酵食品的生产中被广泛应用。
酵母三杂交可以通过混合不同的酵母种类，以达到改善产品品质、提高发酵效率和增加产品多样性的目的。
本文将详细介绍酵母三杂交的原理、应用和局限性。
一、酵母三杂交的原理酵母三杂交是利用酵母的生殖特性进行的杂交技术。
酵母有两种繁殖方式：无性繁殖和有性繁殖。
无性繁殖是指酵母通过简单的分裂产生新的个体，而有性繁殖则是通过两个不同的酵母细胞的融合产生新的个体。
酵母三杂交是在有性繁殖的基础上进行的，通过将三个不同的酵母菌株融合在一起，产生新的基因组组合。
酵母三杂交的实验步骤如下：1. 选取三个不同的酵母菌株。
这些酵母菌株在性状上应该有差异，以便确定是否发生了杂交。
2. 将三个酵母菌株分别培养在适当的培养基上，使其达到最佳生长状态。
3. 收集酵母菌株的细胞，并用适当的方法进行细胞融合。
常用的细胞融合方法包括电融合和化学融合。
4. 将融合后的细胞培养在适当的培养基上，促使其进行有性繁殖。
5. 筛选出具有期望性状的杂交子代，并进行进一步的培养和鉴定。
二、酵母三杂交的应用酵母三杂交在酿酒、面包和其他发酵食品的生产中具有重要的应用价值。
它可以通过杂交产生具有改良性状的酵母品种，优化发酵过程，并提高产品的品质和效率。
1. 酿酒酿酒是酵母三杂交最重要的应用领域之一。
传统上，酿酒使用的酵母菌株被认为是自然发酵产生的，但现代酿酒工业更倾向于使用经过改良的酵母品种。
通过酵母三杂交，可以获得具有更好酿酒性能和耐受性的酵母品种。
这些改良酵母品种可以提高发酵效率、降低酒精产率和改善酒的品质。
2. 面包酵母在面包制作中起到发酵剂的作用。
通过酵母三杂交，可以产生具有更强的发酵能力和更好的耐受性的酵母品种。
这样可以提高面包的发酵效果、增加面包的体积和改善面包的质地。
3. 其他发酵食品除了酿酒和面包，酵母三杂交还可以应用于其他发酵食品的生产中。
杂交育种
酵母细胞的接合过程
杂种的获得
利用营养缺陷性作为遗传标记
杂种的获得
2、质粒 独立于细菌染色体外能进行自主复制的小型环状裸露的DNA 分子，位于细胞质中。 质粒可以从细胞中人为地取出或自行脱落，这些对细菌自 身的生活影响不大。但它在细菌的杂交过程中有十分重要的作 用。
质粒基因可编码很多重要的生物学性状： 1、致育质粒（fertility plasmid,F质粒）
2、耐药质粒（resistance plasmid,R质粒）
真核微生物
有性生殖 生殖细胞融合或接合 准性生殖 体细胞接合
细菌常规杂交育种
一、细菌的繁殖和遗传结构
（一）细菌的生长繁殖方式 • 个体生长繁殖方式
1、繁殖方式——二分裂(binary fission)
2、在适宜的人工培养条件下，多数细菌繁殖速度极快，每20-30分钟分裂 一次（一代）。
（二）细菌的遗传结构 1、细菌的染色体 细菌的染色体大都是环状裸露的双链DNA分子，DNA分子不 像真核生物那样与组蛋白结合，也不形成核小体结构，位于细 胞核（拟核）中 。
物染色体的环状特性。
原理：接合试验的DNA转移过程存在着严格的顺序性，在接合进行中采用
定时人为中断的方法，可以获得呈现不同数量Hfr性状的F–接合子，据此，
可以选定几种有特定整合位点的Hfr菌株，使之与F–菌株进行接合，并在不
同时间使其中断，最后，根据F– 中出现Hfr菌株中各种形状的时间顺序 （分钟），可以绘出较为完整的环状染色体图（chromosome map）。
大片段DNA的过程成为接合（有时也称“杂交”）,特点是 遗传物质单向转移，由供体菌到受体菌，不可逆向转移。
转化：受体菌直接吸收了来自于供体菌的DNA片段，通过交 换，把它整合到自己的基因组中，从而获得了供体菌的部 分遗传性状的现象。转化后的受体菌，成为转化子（感受 态细胞）。
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
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酵母单Байду номын сангаас交
酵母菌杂交育种1
子囊孢子分离和单倍体的获得 菌株活化后接入产孢培养基，3天后镜检观 察，无菌水(2ml)倾于斜面上，用接种环刮下菌体， 收集菌悬液于7ml离心管中，6000rpm离心 10min 收集菌体。0.85%生理盐水悬浮洗涤1~2次，分别 加入 0.7mlTris一Hcl(pH8.0，0.01M);200ul 10% 蜗牛酶(终浓度为0.02):l00ul 10%琉基乙醇(终浓 度为0.01)，120rpm(缓慢振荡)培养16h破子囊壁， 使孢子释放。利用孢子比营养细胞耐热特性，采 用58℃高温致死处理营养细胞，离心收集孢子， 并用Tris一HCI(pH8.0，0.01M)洗涤两次。取适当 稀释倍数，涂布于YPD平板上，28℃培养2一3d。
酵母菌杂交育种
1
目录
• 一酵母菌杂交特点
• 1酵母菌的细胞结构和菌落形态 • 2酵母菌的生活史和繁殖方式 • 3酵母菌的杂交
• 二酵母菌杂交育种的方法
• 标记菌株的选择 • 酵母菌杂交
• 拓展：酵母群体杂交育种方法
2
一酵母菌杂交特点
3
1酵母菌细胞结构和菌落形态
酵母菌（yeast）是低等真 核微生物，分属于子囊菌纲、半知 菌纲和担子菌纲。大多数酵母菌为 单细胞，一般呈卵圆形、圆形或圆 柱形。细胞结构类似于高等生物， 细胞壁的主要成分为葡聚糖和甘露 糖，此外还有蛋白质和脂类等。酵 母细胞除细胞壁之外还有细胞核、 核膜、核仁等结构。大多数酵母的 菌落和细菌相似，
28
6. 杂交菌株的筛选 利用耐酒精和耐渗杜氏管试验对杂交菌株进 行筛选。首先将菌株分别接入含有酒精的麦汁 中, 于30 ℃温培养, 根据产气情况判断酵母的耐 酒精性能, 选出耐酒精性能良好的菌株。将选出 的菌株接入含有氯化钠的麦汁中, 于30 ℃培养, 根据菌株的产气情况判断其耐渗性, 选出耐渗性 能较好的菌株。
酵母杂交技术
酵母杂交技术：开启遗传学研究的新篇章酵母杂交技术是一种在遗传学研究中广泛使用的技术，它通过将不同遗传背景的酵母菌株进行交配，以揭示基因之间的相互作用和遗传信息传递的机制。
本文将详细介绍酵母杂交技术的原理、应用和未来发展。
一、酵母杂交技术的原理
酵母杂交技术的基本原理是通过将两种遗传背景不同的酵母菌株进行交配，产生杂种细胞。
这些杂种细胞将继承来自两个亲本的基因，从而可以研究基因之间的相互作用和遗传信息的传递。
在杂种细胞中，基因可以通过同源重组或异源重组的方式进行交换，这使得研究人员能够精确地识别和定位基因之间的相互作用。
二、酵母杂交技术的应用
酵母杂交技术在遗传学研究中具有广泛的应用。
首先，它被用于研究基因的功能和相互作用。
通过将不同基因的酵母菌株进行交配，研究人员可以揭示基因之间的相互作用和依赖关系，从而深入了解基因的功能。
此外，酵母杂交技术还可以用于研究基因表达的调控机制，例如转录因子对基因表达的调控。
三、未来发展
随着基因组学和蛋白质组学研究的深入，酵母杂交技术也在不断发展。
未来，酵母杂交技术将更加注重对基因组和蛋白质组的全面分
析和解析，以揭示更复杂的基因相互作用和调控机制。
此外，随着高通量测序技术的发展，酵母杂交技术将更加高效和精确，能够处理更大规模的样本和更复杂的数据。
总之，酵母杂交技术是一种强大的遗传学研究工具，它为研究基因功能、相互作用和调控机制提供了重要的手段。
随着技术的不断发展和完善，酵母杂交技术将在未来发挥更大的作用，推动遗传学研究的进步。
酵母单杂交步骤
酵母单杂交步骤引言酵母单杂交是一种重要的遗传实验技术，用于研究酵母菌的遗传特性和基因功能。
通过单杂交技术可以将两个不同的酵母菌株进行杂交，并产生新的杂交子代。
本文将详细介绍酵母单杂交的步骤及相关操作。
实验准备在进行酵母单杂交实验之前，需要准备以下实验材料和设备：1.不同的酵母菌株：至少选择两个不同的酵母菌株进行杂交。
2.酵母培养基：用于培养酵母菌的基础培养基，如YPD培养基。
3.酵母选择培养基：含有选择性抗生素的培养基，用于筛选杂交子代。
4.培养皿和试管：用于培养酵母菌和进行杂交操作。
5.离心机：用于离心培养酵母菌和分离细胞。
6.微量移液器和移液管：用于精确的液体传输操作。
实验步骤步骤一：制备酵母菌预培养液1.从酵母菌保存液中取出所需的酵母菌株，接种到含有YPD培养基的试管中。
2.在摇床上以30°C、200 rpm的条件下培养过夜。
步骤二：制备酵母菌重悬液1.将酵母菌预培养液离心10分钟，以1000 rpm离心速度。
2.弃掉上清液，留下酵母菌菌体沉淀。
3.加入适量的无菌蒸馏水，将菌体沉淀重悬均匀。
步骤三：制备酵母菌孢子悬液1.从酵母菌重悬液中取出适量的液体，转移到含有酵母孢子培养基的培养皿中。
2.在30°C下培养48小时，待看到大量孢子形成。
步骤四：混合酵母菌孢子1.分别从两个不同的酵母菌孢子悬液中取一小部分液体，放入一个新的培养皿中。
2.轻轻拿起培养皿，并旋转使混合液均匀混合。
步骤五：涂布混合孢子液1.将涂布液均匀涂布在含有选择性酵母菌培养基的培养皿上。
2.使用无菌的拇指或涂布棒将混合孢子液均匀涂布在培养皿表面。
步骤六：培养筛选杂交子代1.将涂布好的培养皿置于30°C下培养数天。
2.观察培养皿上是否有酵母菌子代出现，根据不同的选择标记进行筛选。
结论通过以上步骤，我们成功进行了酵母单杂交实验，并产生了新的杂交子代。
这些杂交子代可以用于进一步研究酵母菌的遗传特性和基因功能。
酵母菌诱变育种
酵母菌原生质体融合育种第一部分：酵母菌原生质体融合育种一、基本原理进行微生物原生质体融合时，首先必须消除细胞壁，它是微生物细胞之间进行遗传物质交换的主要障碍。
在酵母属进行细胞融合时，通常采用蜗牛酶除去细胞壁，采用聚乙二醇促使细胞膜融合。
细胞膜融合之后还必须经过细胞质融合、细胞核重组、细胞壁再生等一系列过程，才能形成具有生活能力的新菌株。
融合后的细胞有两种可能：一是形成异核体，即染色体DNA 不发生重组，两种细胞的染色体共存于一个细胞内，形成异核体，这是不稳定的融合。
另一是形成重组融合子，通过连续传代、分离、纯化，可以区别这两类融合。
应该指出，即使真正的重组融合子，在传代中也有可能发生分离，产生回复或新的遗传重组体。
因此，必须经过多次分离，纯化才能获得稳定的融合子二、实验材料（一）菌种：酵母菌（二）培养基：1、完全培养基（液体CM）2、完全培养基（固体CM）在液体培养基加入2%琼脂3、基本培养基（MM）葡萄糖柠檬酸钠培养基或YNB培养基4、再生完全培养基固体完全培养基中加入0.5mol/L的蔗糖(三) 缓冲液(1) 0.1 mol/L pH 6.0 磷酸缓冲液。
(2) 高渗缓冲液，于上述缓冲液中加入0.8 mol/L 甘露醇。
(四) 原生质体稳定液(SMM)0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC12、0.02 mol/L 顺丁烯二酸，调pH 6.5。
(五) 促融剂40％聚乙二醇 (PEG)的SMM 溶液。
(六) 器皿培养皿、移液管、试管、容量瓶、锥形瓶、离心管、玻璃棒、显微镜、离心机等。
四、试验内容(一) 原生质体的制备1．活化菌体将单倍体酿酒酵母菌Y-1 和Y-4 活化分别转接新鲜斜面。
自新鲜斜面分别挑取一环接入装有25 mL 完全培养基的锥形瓶中，30℃培养16 h 至对数期。
2．离心洗涤、收集细胞分别取5 mL 上述培养至对数生长期的酵母细胞培养液，3000 r/min 离心 10 min，弃上清液，向沉淀的菌体中加入5 mL 缓冲液，用无菌接种环，搅散菌体，振荡均匀后离心洗涤一次，再用5 mL 高渗缓冲液离心洗涤一次。
酵母菌杂交的原理和应用
酵母菌杂交的原理和应用
好的,我来详细阐述酵母菌杂交的原理和应用:
1. 酵母菌杂交是指采用遗传工程手段,在不同酵母菌株之间转移目标基因,获得
具有复合优良性状的杂交酵母菌株。
2. 该技术的原理是提取供体酵母的目的基因,通过PCR等方法连接克隆载体构
建重组plasmid。
将重组plasmid转入受体酵母,通过同源重组等途径实现目的基因整合到受体酵母的基因组中。
3. 这种方法可以打破不同酵母菌之间的交配barrier,实验室条件下制备天然难
以得到的杂交株,以便综合不同酵母的有益性状。
4. 利用酵母杂交育种已经商业化生产出许多工业酵母菌株,广泛应用于食品发酵、酿酒、医药等领域。
5. 例如,可改造酿酒酵母增加麦芽酶活性,减少糖化工序;提高酒精耐受性,增加发酵final alcohol;增强芳香物质生成,提升酒质。
6. 在面包酵母方面,可获得既有高CO2产生能力,又耐酸、耐渗、增稠性强的杂交酵母菌株。
7. 利用酵母菌杂交还可创制代谢路径嵌合的酿酒酵母,直接发酵淀粉生产酒精。
8. 酵母杂交技术也可用于纯化咖啡因等目的化合物的微生物制备过程。
9. 此技术具有改造灵活、效率高、成本低的优点,是酵母菌种高效改良的重要途径。
但杂交可能产生不可预知的代谢变化,需严密检测筛选。
10. 未来随着合成生物学技术进步,酵母杂交应用前景广阔,将创制出更多功能优异的“设计”酵母菌株。
酵母杂交技术原理及应用
酵母杂交技术原理及应用
酵母杂交技术原理及应用
酵母双杂交系统的建立
主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体； b 含DNA-activating domain的载体。
这二类载体在构建融合基因时， 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读 框内融合。融合基因在报告株中表达， 其表达产物只有定位于核内才能 驱动报告基因的转录。
⑵ 酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。由于某些蛋白本身具有激 活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用， 使DNA结合结构域杂交蛋白 在无特异激活结构域的情况下可激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质 的低亲和力区域， 能与其他蛋白形成稳定的复合物， 从而引起报告基因的表达， 产生"假阳性"结果。
酵母杂交技术原理及应用
酵母单杂交系统的原理
用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。研 究表明GAL4 的DNA结合结构域靠近羧基端，含有几个锌指结构，可激活酵 母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS)；而转录激活结构域可与RNA 聚合酶或 转录因子TFIID相互作用，提高RNA 聚合酶的活性。在这一过程中，DNA 结 合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。
LEU、TRP，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。）
3）当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式 作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因ADE、 HIS、LACZ、MEL1， 从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中 的AD-LIBRA交技术原理及应用
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序列克隆法
酵母三杂交实验方法
酵母三杂交实验方法酵母三杂交是一种常用的实验方法，用于研究酵母菌的遗传特性和基因功能。
本文将介绍酵母三杂交实验的步骤和操作要点。
一、实验准备1.1 培养基准备：制备合适的培养基，包括固体培养基和液体培养基。
固体培养基用于酵母菌的生长和筛选，液体培养基用于酵母菌的培养和扩增。
1.2 酵母菌株准备：选择具有不同遗传标记的酵母菌株作为实验材料，确保能够区分不同的杂交后代。
1.3 实验器材准备：准备培养皿、试管、离心机、显微镜等实验所需的器材。
二、实验步骤2.1 第一轮杂交：将两个不同遗传标记的酵母菌株分别接种到液体培养基中培养，使其达到对数生长期。
然后，将两个酵母菌株混合在一起，通过震荡或离心的方式使其混合均匀。
从混合溶液中取出适量的酵母菌细胞，再均匀涂布在固体培养基上，培养一段时间后进行筛选。
2.2 第二轮杂交：将筛选得到的杂交子代酵母菌株分别与第三个具有不同遗传标记的酵母菌株进行杂交。
具体步骤与第一轮杂交相似。
2.3 筛选和鉴定：从第二轮杂交得到的杂交子代中，筛选出具有所需遗传标记的酵母菌株。
可以通过培养基的配方和添加特定的抗生素来选择目标菌株。
同时，也可以通过PCR或基因测序等分子生物学方法进行鉴定。
三、实验注意事项3.1 实验环境要清洁：避免实验材料受到外界污染，减少实验误差。
3.2 实验操作要规范：操作过程中要注意无菌操作，避免细菌和其他酵母菌的污染。
3.3 实验时间要控制：实验过程中的每个步骤都需要控制好时间，避免过长或过短的培养时间影响实验结果。
3.4 实验结果要可靠：实验数据的收集和分析要准确无误，避免误判或漏判。
四、实验结果分析通过酵母三杂交实验，可以得到具有多个不同遗传标记的酵母菌株。
利用这些酵母菌株可以进一步研究不同基因之间的相互作用和遗传规律。
同时，通过对杂交后代的筛选和鉴定，可以找到具有特定遗传特性的酵母菌株，为后续的研究奠定基础。
总结：酵母三杂交实验是一种常用的遗传实验方法，用于研究酵母菌的遗传特性和基因功能。
酵母菌杂交育种
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• 结论 对杂交株的耐性筛选发现, 与亲本相比, 部分杂 交株的耐酒精性能和耐渗性能显著提高。杂交 育种可以通过基因的分离、移动和重排进行重 新分布, 有可能改善酿酒酵母的发酵特性。本试 验中,杂交株的产酒精能力和耐渗性均比亲株有 所提高, 通过此方法可以达到合并工业菌株特性 的目的。
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YEPD高渗培养基(用于酵母原生质体融 合) :酵母粉10g, 蛋白胨20g，葡萄糖20g， 蒸馏水1000mL, pH6.0，115℃湿热灭菌20 min。
有性孢子或无性孢子及其细胞，互相联结、细 胞核融合，随后细胞核进行减数分裂或有丝分 裂，遗传性状出现分离和重新组合的现象，产 生具有各种新性状的重组体，然后经分离和筛 选，获得符合要求的生产菌株。由此可见，微 生物的杂交现象包括有性杂交及菌体细胞重组 两个方面。
4
尽管一些优良菌种的选育主要是采用诱变 育种的方法，但是某一菌株长期使用诱变剂处 理后，其生活能力一般要逐渐下降，如生长周 期延长、孢子量减少、代谢减慢、产量增加缓 慢等。而杂交育种是选用已知性状的供体和受 体菌种作为亲本，因此不论在方向性还是自觉 性方面，都比诱变育种前进了一大步，所以它 是微生物菌种选育的另一重要途径。但由于杂 交育种的方法复杂，工作进度慢，因此还很难 象诱变育种那样得到普遍的推广和应用。
培养基,发酵一段时间后补加10 %的葡萄糖。于 30 ℃静置培养, 每隔24 h 测CO2 失重。发酵结 束后测定发酵液的酒精度和残糖含量。根据产 酒精能力选出发酵性能优良的单倍体菌株。
酵母双杂交技术
酵母双杂交技术引言酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该技术能够检测和分析细胞内发生的蛋白质-蛋白质相互作用，帮助科学家了解细胞信号传导、代谢途径和疾病发生机制。
本文将介绍酵母双杂交技术的原理、应用和优缺点。
原理酵母双杂交技术利用酵母细胞（通常是酿酒酵母）作为表达蛋白质的平台，通过操纵DNA序列，使得感兴趣的两个蛋白质分别与酵母细胞内的两个杂交域相连。
当两个蛋白质相互作用时，通过激活或抑制报告基因的表达来检测相互作用的发生。
具体来说，酵母双杂交技术包括以下几个步骤：1.构建融合基因表达质粒：将感兴趣的两个蛋白质的编码序列插入特定的表达质粒中，其中一个蛋白质与活化域相连，另一个蛋白质与靶向域相连。
2.转化酵母细胞：将构建好的表达质粒导入酵母细胞中，使其能够表达融合蛋白质。
3.遴选正交剪切位点：利用酵母细胞染色质中的正交剪切位点，确保融合蛋白质能够发挥其相互作用。
4.检测相互作用：通过报告基因（如荧光蛋白）的表达情况来检测融合蛋白质之间的相互作用程度。
一般来说，如果两个融合蛋白质相互作用，则报告基因被激活，表达结果可通过荧光显微镜观察或酵母细胞生长的特征来检测。
应用1.蛋白质相互作用网络研究：酵母双杂交技术可以帮助科学家构建蛋白质相互作用网络，了解细胞内不同蛋白质之间的相互关系和调控机制。
2.疾病相关蛋白质研究：酵母双杂交技术可以用于筛选和鉴定一些与疾病相关的蛋白质，帮助研究人员深入了解疾病的发生机制，并开发新的治疗方法。
3.药物靶点筛选：酵母双杂交技术可以用于筛选药物靶点，帮助研究人员发现新的药物靶点，从而加速药物研发过程。
优缺点酵母双杂交技术具有以下优点：•高通量：酵母双杂交技术可以同时检测大量蛋白质之间的相互作用，有助于加速研究的进程。
•对新蛋白质相互作用的发现：酵母双杂交技术可以帮助发现未知的蛋白质相互作用，有助于揭示新的细胞信号传导途径和代谢途径。
•相对简洁易行：酵母双杂交技术不需要复杂的实验设备，相对容易实施。
酵母双杂交的原理和操作过程
酵母双杂交的原理和操作过程嘿，朋友们！今天咱来唠唠酵母双杂交这个神奇的玩意儿。
你说这酵母双杂交啊，就像是一场奇妙的分子之舞。
咱先来说说原理。
想象一下，酵母细胞就像是一个大舞台，而两种蛋白质呢，就像是两位舞者。
其中一个叫“诱饵”蛋白，另一个叫“猎物”蛋白。
如果这两位舞者能在这个舞台上牵手成功，也就是相互作用，那就会引发一系列的反应，就像舞台上绽放出绚丽的烟花一样，我们就能知道它们之间有故事啦！这是不是很有意思？接下来讲讲操作过程，那可是相当细致的活儿呢。
首先得准备好我们的酵母细胞，这就好比给舞者搭建好舞台。
然后呢，把带有“诱饵”蛋白的基因和一些报告基因导入到酵母细胞中，这就像是给舞台布置好了灯光和音乐。
接着，再把可能含有“猎物”蛋白的样本也加进去。
这时候啊，就等着看它们会不会在这个舞台上相遇并共舞啦！如果真的有相互作用，报告基因就会被激活，给我们发出信号。
在这个过程中，可不能马虎哟！每一步都得小心翼翼，就像呵护珍贵的宝贝一样。
比如说，基因的导入要准确无误，不然可就看不到精彩的“舞蹈表演”啦。
而且还要注意各种条件的控制，温度啦、湿度啦，都得恰到好处，不然这场分子之舞可就跳不起来咯！你想想看，通过这样一个看似简单却又充满奥秘的实验，我们就能揭开蛋白质之间那些神秘的关系。
这就好比我们在黑暗中找到了一盏明灯，照亮了我们对生命奥秘的探索之路。
做酵母双杂交实验就像是在解谜，每一个步骤都是解开谜题的关键。
当我们最终看到结果，知道了那些蛋白质之间的故事，那种成就感，哎呀，真的是没法形容！就好像我们破解了一个超级大秘密一样。
所以啊，朋友们，不要小看了酵母双杂交这个小小的实验，它里面蕴含着大大的智慧和乐趣。
让我们一起在这个奇妙的分子世界里尽情探索吧，说不定还能发现更多让人惊叹的秘密呢！这难道不让人兴奋吗？反正我是觉得超有意思的啦！。
育种--酵母双杂交
酵母转录因子（ 酵母转录因子（Gal 4） ）
与BD-fusion ---诱饵（bait） 诱饵（ ） 诱饵 与AD-fusion ---猎物或靶蛋白（prey or target protein） 猎物或靶蛋白（ ）
报告基因（ 报告基因（reporter gene） ）
---Lac Z（编码β-半乳糖苷酶） 半乳糖苷酶） （编码β 半乳糖苷酶
Fields和Song将两个融合蛋白分别构建在穿梭 和 将两个融合蛋白分别构建在穿梭 质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋白 质粒上，一个是将 的 与酵母蛋白 SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋白 融合；另一个是将 的 和酵母蛋白 融合 SNF4融合。 融合。 融合 其中， 是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激 其中，SNF1是一种丝氨酸 苏氨酸的蛋白激 是一种丝氨酸 是它的一个结合蛋白， 酶，SNF4是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是 是它的一个结合蛋白 已知可以相互作用的。 已知可以相互作用的。
（二）酵母双杂交系统的原理
X
DNA-BD
GAL4 UAS
Promoter
lacZ(or HIS) reporter gene
AD
Y
GAL4 UAS Promoter lacZ(or HIS) reporter gene
AD
X
DNA-BD
Y
Promoter
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
transcription
lacZ(or HIS) reporter gene
1989年美国纽约州立大学的 年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述 年美国纽约州立大学的 和 首先描述 了酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。 了酵母双杂交系统 。 该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过 程的认识。 程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子的 参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域： 参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域： DNA结合结构域 结合结构域(BD) 结合结构域 (DNA binding domain)
酵母杂交
酵母感受态制备1. 从平板上或保种管中，挑少许酵母，在YPDA平板上划单克隆，30℃培养3天左右。
2. 从平板上分别挑取单克隆（直径2-3mm）到含有3ml YPDA的玻璃试管中（平行做3管）30℃，250rpm，培养8-12h。
3. 取200ul 菌液，测OD600选取OD600值最大的一个试管（即活力最高的一个），吸取5ul转移至50ml新鲜的YPDA培养基中（培养基装在250ml三角瓶中）30℃，230rpm，培养16-20h，直至OD600=0.15-0.34. 将培养好的菌液转入2个50ml离心管，室温离心3000g，3min，弃上清，用100ml新鲜的YPDA悬起管底的菌体，并倒入干净的三角瓶中。
5. 30℃，230rpm培养直到OD600=0.4-0.5（3-5小时）6. 将菌液倒入2个50ml离心管，室温离心，3000g，3min，弃上清，每个离心管用30ml milipore水重悬。
7. 再次离心，3000g，3min，弃上清，每管用1.4ml 1.1×TE/LiAc重悬。
8. 将重悬的菌液转移到2个ep管中，12000rpm，15s9. 弃上清，每管用600ul 1.1×TE/LiAc重悬，将两管重悬菌液并入一管，准备进行转化。
4.酵母质粒转化（小规模转化）加入质粒DNA 100-500ng鲑鱼精DNA(变性的，10mg/ml) 5ul加入感受态细胞, 轻弹混匀 50ul加入PEG/LiAc, 轻弹混匀500ul30°水浴，每10-15min轻弹混匀30min加入DMSO, 轻弹混匀20ul42°水浴，每5-10min轻弹混匀15min离心，弃上清最大转速15s用液体YPDA培养基重悬1ml30°，230rpm，培养 90min离心，弃上清最大转速15s用0.9%NaCl重悬1ml涂板在SD-Trp筛选培养基上，30℃培养3-5天。
酵母双杂交操作步骤
（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）概念：1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。
优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。
2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。
优点：比次序转化更容易操作。
pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林)各种SD培养基：1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;葡萄糖20g (即2%)2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g. (即2%)3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （“二缺”）酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）;葡萄糖 20g (即2%)4)SD/-leu (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)5)SD/-trp (1000 ml)酵母氮源（YNB）： ;-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的）葡萄糖 20g (即2%)注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。
酵母双杂交流程
酵母双杂交流程嘿，朋友们！今天咱就来讲讲酵母双杂交流程，这可真是个有趣又神奇的事儿啊！咱先来说说酵母这小家伙，它就像是个勤劳的小精灵，在我们的实验里扮演着重要的角色呢。
那酵母双杂交是啥呢？简单来说，就是让两个蛋白质在酵母里“相遇”，看看它们能不能擦出点“火花”。
首先呢，我们得准备好各种材料，这就像是给酵母小精灵们准备好吃的和好玩的。
要有合适的酵母菌株，就像给它们准备了一个舒适的家。
然后呢，把我们感兴趣的两个蛋白质对应的基因分别连到不同的载体上，这就像是给它们穿上了特定的“衣服”，让它们能被酵母认出来。
接下来，把这两个带着基因的载体一起转到酵母里去。
哇，这时候就好像把两个小伙伴放到了一个大派对里，它们开始在酵母的世界里活动啦。
如果这两个蛋白质能相互作用，那就会产生一些特别的信号，就像是它们在悄悄说“嘿，我找到你啦”。
你说这神奇不神奇？就好像我们在一个微观的世界里导演了一场小小的戏剧。
然后我们就通过各种检测手段，去发现这些信号，看看这两个蛋白质是不是真的“看对眼”了。
要是它们真的相互作用了，那可就太棒啦！这就像是我们找到了一把解开谜题的钥匙。
想想看，通过这么一个小小的实验，我们就能知道蛋白质之间那些神秘的关系，是不是很有成就感呢？而且啊，这个过程中也会有很多小惊喜和小挑战呢。
有时候可能会出现一些假阳性或者假阴性的结果，就像生活中有时候会出现一些小误会一样。
但这也是实验的乐趣所在呀，我们要像侦探一样去仔细分析，找出真正的答案。
你看，科学就是这么神奇又有趣，小小的酵母也能给我们带来这么大的发现。
所以啊，别小看了这些看似普通的实验步骤，每一步都可能隐藏着巨大的奥秘呢！咱就得认真对待，仔细钻研，说不定就能在这个酵母的世界里发现大宝藏呢！这酵母双杂交流程，真的是让人着迷啊，你说是不是？。
酵母杂交技术原理及应用
酵母双杂交系统局限性和存在的问题
酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法， 有多方 面的应用， 但仍存在一些局限性。
⑴ 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内， 而许多蛋白间的相 互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等， 这些反应在核内无法进行。 另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助， 这限制了某些细 胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。
另外，也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相 关的主要方法。
酵母双杂交系统的应用
2、利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 利用酶联免疫（ELISA）、免疫共沉淀（CO-IP）技术都是利用抗原
和抗体间的免疫反应，可以研究抗原和抗体之间的相互作用，但是，它们 都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。
常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16 的编码序列等。
酵母双杂交系统的建立
酵母双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、 含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。
最常用的是酵母细胞， 酵母细胞作为报道株 具有许多优点: 〈1〉 易于转化、便于回收扩增质粒。 〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。 〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。
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2. 杂交方式：孢子与孢子；孢子与单倍体细胞； 单倍体细胞间。
3. 酵母菌通过有性杂交进行杂交育种主要包括子
囊孢子的形成
子囊孢子的分离
酵
母杂交种的获得三个步骤。
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酵母菌有性杂交程序
亲本的单倍化 ↓
有性杂交 ↓
杂交后代的检出 ↓
筛选优良性状个体
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高耐性酿酒酵母的杂交育种
1.单倍体的制备 将酿酒酵母AY- 15, M1 分别于YEPD 液体培
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在啤酒酿造中，用上面酵母和下面酵母杂 交，得出的杂种可生产出浓度和香味更好的啤 酒等。以上这些酵母均具有不同的交配型，因 而都是通过有性杂交获得。对于无典型有性生 殖的酵母菌如假丝酵母，可通过准性生殖过程 进行杂交。但是酵母菌的杂交育种中大多数为 有性杂交。
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二、酵母菌有性杂交技术 1. 有性杂交 一般指性细胞间的接合和随之发生
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3.单倍体菌株的筛选 取装有麦汁的试管( 内装杜氏管) , 加入无水
乙醇,使麦汁中酒精含量为16 %, 混匀。将AY- 1 5 的单倍体菌株分别接入麦汁中, 于30 ℃培养, 根据产气情况判断酵母的耐酒精性能, 选出耐性 好的菌株。然后利用TTC平板进行复筛。菌株 点接到TTC 平板下层培养基上, 于30 ℃培养2～ 3 d, 待菌落长大后, 倒入TTC 上层培养基, 覆盖 原有的菌落, 在30 ℃下避光培养2～3 h, 由菌
有性孢子或无性孢子及其细胞，互相联结、细 胞核融合，随后细胞核进行减数分裂或有丝分 裂，遗传性状出现分离和重新组合的现象，产 生具有各种新性状的重组体，然后经分离和筛 选，获得符合要求的生产菌株。由此可见，微 生物的杂交现象包括有性杂交及菌体细胞重组 两个方面。
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尽管一些优良菌种的选育主要是采用诱变 育种的方法，但是某一菌株长期使用诱变剂处 理后，其生活能力一般要逐渐下降，如生长周 期延长、孢子量减少、代谢减慢、产量增加缓 慢等。而杂交育种是选用已知性状的供体和受 体菌种作为亲本，因此不论在方向性还是自觉 性方面，都比诱变育种前进了一大步，所以它 是微生物菌种选育的另一重要途径。但由于杂 交育种的方法复杂，工作进度慢，因此还很难 象诱变育种那样得到普遍的推广和应用。
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菌落大而厚，菌落表面湿润、粘稠并多呈乳白 色，少数为红色。
酵母菌是真核生物中最简单的单细胞微 生物 ，具有真核生物所有的共性，染色体结 构、功能和高等生物细胞相类似。存在单倍体 和二倍体的生活史，二倍体生活力强，生产能 力高，可通过杂交得二倍体来育种。
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酵母菌的杂交育种
一、概述 杂交育种 是指将两个基因型不同的菌株的
的染色体重组，并产生新遗传型后代的过程。 借助有性重组，使不同菌株的遗传物质得以交 换（获优良性状集中的重组体）。凡是能产生 有性孢子的酵母菌或霉菌，原则上都能采用与 高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进 行育种。
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准性生殖 是一种类似于有性生殖但比它更原 始的一种生殖方式。它可使同一种生物的两个 不同来源的体细胞经融合后，不经过减数分裂 和接合的交替，不产生有性孢子和特殊的囊器， 仅导致低频率的基因重组，重组体细胞和一般 的营养体细胞没有什么不同。准性生殖多见于 一般不具典型有性生殖的酵母和霉菌。
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涂布YEPD 培养基平板, 挑取小菌落点接在生 孢培养基上, 于25 ℃培养6d 后镜检, 不生孢子 者为单倍体, 将单倍体分别挑至斜面, 统一编号, 于4 ℃下保存。
2. 单倍体接合能力及接合型的鉴定
将获得的单倍体菌株分别与标准a 型、α型 菌株混合培养, 与a 型菌株形成哑铃形接合子的 待测菌株为α型, 与标准α型菌株接合的待测菌 株为a 型, 与a 型、α型菌株均不接合的为不育 型菌株。
酵母菌杂交育种
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酵母菌简介
酵母菌（yeast）是低等真核 微生物，分属于子囊菌纲、半知菌 纲和担子菌纲。大多数酵母菌为单 细胞，一般呈卵圆形、圆形或圆柱 形。细胞结构类似于高等生物，细 胞壁的主要成分为葡聚糖和甘露糖， 此外还有蛋白质和脂类等。酵母细 胞除细胞壁之外还有细胞核、核膜、 核仁等结构。大多数酵母的菌落和 细菌相似，只是比细菌的
培养基,发酵一段时间后补加10 %的葡萄糖。于 30 ℃静置培养, 每隔24 h 测CO2 失重。发酵结 束后测定发酵液的酒精度和残糖含量。根据产 酒精能力选出发酵性能优良的单倍体菌株。
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5. 单倍体杂交及杂交株的检出 将a 型与α型单倍体菌株混合接种于YEPD
液体培养基中, 于30 ℃摇床培养, 观察接合子的 形成情况,培养20 h 后收集菌体, 涂布YEPD 平 板, 挑取较大的单菌落, 在微量元素培养基上鉴 定菌株的产孢能力, 能够产孢的菌株为二倍体杂 交株, 编号保存。
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6. 杂交菌株的筛选 利用耐酒精和耐渗杜氏管试验对杂交菌株进
行筛选。首先将菌株分别接入含有酒精的麦汁 中, 于30 ℃温培养, 根据产气情况判断酵母的耐 酒精性能, 选出耐酒精性能良好的菌株。将选出 的菌株接入含有氯化钠的麦汁中, 于30 ℃培养, 根据菌株的产气情况判断其耐渗性, 选出耐渗性 能较好的菌株。
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• 结论 对杂交株的耐性筛选发现, 与亲本相比, 部分杂 交株的耐酒精性能和耐渗性能显著提高。杂交 育种可以通过基因的分离、移动和重排进行重 新分布, 有可能改善酿酒酵母的发酵特性。本试 验中,杂交株的产酒精能力和耐渗性均比亲株有 所提高, 通过此方法可以达到合并工业菌株特性 的目的。
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YEPD高渗培养基(用于酵母原生质体融 合) :酵母粉10g, 蛋白胨20g，葡萄糖20g， 蒸馏水1000mL, pH6.0，115℃湿热灭菌20 min。
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酵母菌的育种在食品工业中占有极其重要 的地位。它的杂交育种工作也开展得较早，也 取得有益的成果。例如在面包酵母种间进行杂 交，获得了许多生产性能良好的菌株，它们的 繁殖能力和发酵能力比亲本菌株强；采用面包 酵母和酒精酵母杂交，其杂交种的酒精发酵能 力没有下降而发酵麦芽能检测 将筛选得到的菌株活化后, 进行种子培养, 转
入耐盐发酵培养基, 于30 ℃静置培养, 每隔24 h 测CO2 失重, 用CO2 失重来衡量酵母的发酵速度。 发酵结束后测定发酵液的酒精度和残糖含量, 比 较不同菌株的产酒精能力, 选出在高渗条件下发 酵性能优良的酵母菌株。
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落呈色的深浅判断酵母的产酒精能力, 颜色较深 的菌落 为产酒精性能好的菌株。将M1 的单倍 体菌株分别接种到装有麦汁的试管中( 内装杜氏 管, NaCl 含量为13 %) ,于30 ℃培养, 以亲本菌 株作对照, 产气速度快、产气量多的酵母为耐渗 性好的菌株。
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4. 单倍体菌株发酵性能的筛选 菌株活化后, 进行种子培养, 然后接入发酵
养基中于28 ℃培养48 h, 离心洗涤, 弃上清液, 将 酵母泥接种于微量元素培养基平板上, 于25 ℃ 培养5 d, 在显微镜下可以观察到有子囊孢子的 形成, 收集平板培养基上的菌体。制备菌悬液 ( 106) , 用2 %的蜗牛酶于30 ℃水浴处理60 min, 然后于50 ℃水浴振荡处理10 min, 杀死二倍体营 养细胞, 将粘连的孢子打散后