蛋白质分离技术PPT课件

分散相质点在胶 体系统中保持稳 定的条件
1. 质点大小在1-100nm范围内作Brown movement.
2. 质点带有相同电荷，相互排斥
3. 质点与溶剂形成水化层（hydration
mantle),有了水化层，相互间不易靠拢而聚
集。
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（二）蛋白质的沉淀
破坏了上述胶体溶液的稳定条件就会沉淀。
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(四）蛋白质的选择吸附分离 （adsorption chromatography)
介质：活性碳 硅胶 氧化铝 磷酸钙 硅藻土
（五）亲和层析法 抗原—抗体 酶—辅酶 酶—抑制剂
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六、蛋白质含量测定与纯度鉴定
Folin-酚法（Lowry法）
凯氏定氮法（标准方法）
紫外吸收法（280nm)
（一）根据分子大小不同 1. 超过滤（ultrafiltration) 2. 密度梯度离心（density gradient centrifugal)
介质：蔗糖，Ficolls ,
3. 凝胶过滤层析（gel filtration chromatography) shephadex G-50, G-100
沉降系数（Sedimentation coeffecient)
10-13=Svedberg 用 S 表示，生物分子在110-13—20010-13秒范围。
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Hoemglobin 沉降系数4.46S=4.46 10-13秒
M=
RTS D（ 1- ）
（ 1- ）为浮力因子，其中为偏 微比容=0.74cm3/g；=容剂密度 （g/cm3)
Bradford法（考马斯亮蓝结合法）可测g蛋 白质
纯度鉴定：PAGE， SDS-PAGE ， HPLC
A280/A260=1.75 .
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个人观点供参考，欢迎讨论！
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（二）利用溶解度差别分离蛋白质
1。等电点沉淀
2。蛋白质的盐溶和盐析
3。有机溶剂分级法
（三）根据电荷不同的分离方法
1。电泳（electrophoresis)
①滤纸；薄膜 ②粉末平板（硅胶、纤维素粉） ③细丝（尼龙丝、人造丝）
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④凝胶电泳（PAGE、Agarose)
圆盘电泳（disc) 平板电泳
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Chapter 7
蛋白质的分离、纯化和 表征
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一、蛋白质的酸碱性质
两性电解质 可解离基团：-NH3+
-COO侧链上的功能基团见（书P290） 氨基酸有的化学性质蛋白质就有。 PI=正负电荷相等，净电荷为零时的pH. （见书P291表7-2）
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二、蛋白质分子大小与形状
从6000—1000000Dalton(道尔Байду номын сангаас）
T=绝对温度 . =渗透压
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M=Lc—iRmTo——c—
/c 截距
分子量1万——10万范围内，结果可靠
C
（三）蛋白质的扩散
扩散系数（diffusion coeffecient)
(四） 蛋白质的沉降分析——超速离心（Ultracentrifuge)测定蛋 白质分子量
1. 沉降速度法（Sedimentation velocity）
为纪念原子学说（1803年）创始人John Dalton. Dalton=12C原子绝对质量1/12=1.6603310-27
（一）最低分子量测定 （二）滲透压（Osmotic pressure）测分子量 在理想的溶液中Osmotic pressure 与溶质浓度的关系为；
=—CR—T
M
C=溶质浓度 R=气体常数（0.082)
D=扩散系数
R=气体常数（8.314J/(k.mol))
T=绝对温度（K）
S=沉降系数
2.沉降平衡法
M=—2(1R-—Tl—n) (C—22/(—Cx212)—-x2—1) —
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(五）凝胶过滤法（gel filtration)
分子筛效应：大分子先洗脱下来 小分子后洗脱下来
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(五）凝胶过滤法 （gel filtration)
方法：1.盐析法(salt out) (NH2)4SO4, Na2SO4, NaCl 2. 有机溶剂 甲醇，乙醇， 丙酮
3。重金属盐 pH >pI时 P带负电荷与 Hg2+, Pb2+, Cu2+, Ag+形成不溶性盐
4. 生物碱 pH<pI时，P+ —生物碱 沉淀
5. 加热变性沉淀法
少量盐加速蛋白质加热凝固。
② SDS改变蛋白质分子单体构象，全部变成似雪茄 烟形的长椭圆棒型。
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肌球蛋白
半乳糖苷酶 糖原磷酸化酶 牛血清白蛋白
卵清蛋白
碳酸酐酶 大豆胰蛋白酶抑制剂
溶菌酶
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三、蛋白质的胶体性质与蛋白质沉淀
（一）蛋白质的胶体性质
蛋白质溶液是一种分散系统（disperse system), 蛋白质 分子颗粒是分散相，水是分散介质（disperse medium)。 属胶体系统（colloidal system) 蛋白质
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四、蛋白质分离提纯的一般原则 （separation and purification)
1. Pretrestment （匀浆， 研磨，超声波 ）
2. Rough fractionation （盐析，等电点， 有机溶剂）
3. Fine fractionation （层析）
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五、蛋白质混合物的分离方法
双向电泳
等电点聚焦（isoe2l2ectric focusing)
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2.离子交换层析
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2.离子交换层析
介质：CMC
CM-Sephadex G-50 DEAE-纤维素 DEAE-Sephadex A-25
A-50 QAE-Sephadex A-50
原理见动画片
分子筛效应： 大分子先洗脱下来 小分子后洗脱下来
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(六）SDS-PAGE 蛋白质测分子量 （sodium dodecyl sulfate polyacylamide
gel electrophoresis)
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
① SDS-蛋白质形成复合物，1.4克SDS与1克蛋白质 结合，相当于每两个氨基酸残基结合一个分子的SDS。 这样，蛋白质的原有电荷效应被覆盖，带有相同密 度负电荷，分子量大小与迁移率成正比。