实验五 质粒的转化及转化子的鉴定
重组质粒的转化及阳性克隆的筛选
(二)阳性克隆的鉴定与筛选
将目的基因与载体进行连接形成重组子并转化后, 在连接产物中既有载体和目的基因的连接,也有载体 的自连和目的基因的自连,更多的是未发生连接反应 的载体和目的DNA片断.这就需要我们对阳性克隆进 行鉴定和筛选,将含有外源DNA的宿主细胞和不含外 源DNA的宿主细胞分开,将含有正确重组子的宿主细 胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开.
阳性克隆的筛选与鉴定可以从DNA, RNA和蛋白质三个不同的层次水平进行.可以 利用载体本身的一些特性,如抗生素抗性基因, 包装容量等对重组子筛选.可以直接分析重组 子中的质粒DNA,分析其插入片段的有无,大 小和酶切图谱,也可直接通过测序分析重组子 中的插入片断.有时可以通过间接分析和目的 基因相连的基因或蛋白的表达来检测目的基因 的表达,比如将目的基因和报告基因同时整合 到宿主中,如果报告基因表达,则说明目的基 因也可能正确表达.
四,操作步骤
(一)重组质粒的转化 1,从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其 解冻,解冻后立即置冰上. 2, 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超 过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后. 3,42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速 置于冰上冷却3-5分钟. 4,向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后 37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质 粒编码的抗生素抗性基因(Ampr ). 5,将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平 板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后 倒置培养皿,37℃培养16-24小时.
五,注意事项
1,麦康凯选择性琼脂组成的平板,在含有适当抗生素 时,携有载体DNA的转化子为淡红色菌落,而携有带 插入片段的重组质粒转化子为白色菌落.该产品筛选 效果同蓝白斑筛选,且价格低廉.但需及时挑取白色 菌落,当培养时间延长,白色菌落会逐渐变成微红色, 影响挑选. 2,X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖以半乳糖苷酶 水解后生成的吲哚衍生物显蓝色.IPTG是异丙基硫代 半乳糖苷为非生理性的诱导物,它可以诱导lacZ的表 达. 3,在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上,携带载体 DNA的转化子为蓝色菌落,而携带插入片段的重组质 粒转化子为白色菌落,平板如在37℃培养后放于冰箱 3-4小时可使显色反应充分,蓝色菌落明显.
质粒的转化实验报告
一、实验目的1. 理解质粒转化实验的基本原理和操作步骤。
2. 掌握感受态细胞制备和质粒转化方法。
3. 学会筛选和鉴定转化子。
二、实验原理质粒转化实验是将外源DNA片段（如质粒）导入受体细胞（如大肠杆菌）的过程。
通过转化，受体细胞获得外源DNA片段所携带的遗传信息，从而表现出相应的生物学特性。
本实验采用热冲击法将质粒DNA导入大肠杆菌感受态细胞中，通过筛选和鉴定转化子，实现对目的基因的克隆。
三、实验材料1. 质粒：pUC19质粒（含有抗生素抗性基因）2. 受体菌：大肠杆菌DH5α3. 试剂：氯化钙、NaCl、Tris-HCl、EDTA、TE缓冲液、无水乙醇、酚、氯仿、异丙醇、琼脂糖、DNA Marker、DNA测序引物等4. 仪器：恒温摇床、台式离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、紫外灯、超净工作台等四、实验步骤1. 制备感受态细胞（1）将大肠杆菌DH5α在含有抗生素的LB液体培养基中培养过夜。
（2）取适量培养物，按1:100的比例加入新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养1.5小时，使细菌处于对数生长期。
（3）将细菌离心收集，弃去上清液，用冷的CaCl2溶液重悬细胞，使细胞浓度约为1×10^8个/mL。
（4）将重悬的细胞置于冰浴中5分钟，以降低细胞膜通透性。
（5）将细胞与质粒DNA混合，37℃温育30分钟。
（6）将混合物迅速置于冰浴中5分钟，以停止转化过程。
（7）将混合物加入到LB固体培养基中，37℃培养过夜。
2. 筛选和鉴定转化子（1）将培养皿中的单菌落接种到含有抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。
（2）提取转化子DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否存在。
（3）对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带是否与预期相符。
（4）对阳性克隆进行测序，验证目的基因是否正确导入。
五、实验结果1. 感受态细胞制备成功，转化效率较高。
2. 成功筛选出转化子，目的基因导入受体细胞。
3. 阳性克隆PCR产物与预期相符，测序结果验证目的基因正确导入。
质粒转化步骤
质粒转化步骤引言质粒转化是分子生物学实验中常用的一项技术，用于将目标基因导入到宿主细胞中，实现外源基因的表达。
质粒转化步骤通常包括质粒构建、细胞准备、转化和筛选等环节。
本文将详细介绍质粒转化的步骤和操作注意事项。
质粒构建质粒构建是质粒转化的第一步，主要是将目标基因插入到质粒载体上，构建成适合转化的质粒。
下面是质粒构建的基本步骤：1.购买或从他人提供质粒载体：质粒载体通常是一种环状DNA分子，能够自我复制并带有一些重要的功能元件，例如起始子、选择性标记和载体复制起始位点等。
2.选取适当的限制性内切酶：根据质粒载体上的限制性内切酶位点和目标基因序列的限制性内切酶位点，选取适当的限制性内切酶。
限制性内切酶可以切割DNA分子，得到具有互补末端的DNA片段。
3.定位和切割目标基因：使用选取的限制性内切酶切割目标基因的DNA序列，生成具有互补末端的DNA片段。
4.切割质粒载体：使用相同的限制性内切酶切割质粒载体的DNA序列，生成具有互补末端的质粒片段。
5.连接目标基因和质粒载体：将切割好的目标基因和质粒片段进行连接，形成新的质粒。
6.进行质粒转化前的验证：将构建好的质粒产物进行测序验证，确保构建的质粒没有错位和错配等问题。
细胞准备质粒转化的第二个步骤是准备宿主细胞，为质粒的转化和筛选做好准备。
常用的宿主细胞有大肠杆菌（E. coli）和酵母菌等。
细胞准备的步骤如下：1.培养条件的准备：准备适当的培养基和培养条件，确保宿主细胞的正常生长。
2.复苗制备：从冻存的宿主细胞中提取适量的细胞进行复苗培养，以恢复其生长活性。
3.培养宿主细胞：将复苗培养物接种到含有适当抗生素的培养基中，经过一定时间的培养，使细胞进入指数生长期。
4.细胞处理：在指数生长期，将培养物离心，去除上清液，获得宿主细胞的沉淀。
5.细胞复苏：将宿主细胞沉淀重新悬浮于含有适当培养基的液体中，并在适当的条件下进行复苏培养。
转化和筛选质粒转化的第三个步骤是将质粒导入到宿主细胞中，并通过适当的筛选方法选出含有目标基因的转化子。
质粒的转化
(4)转化体细胞的扩增；
(5)重组体细胞的鉴定与筛选。
基因工程的操作过程
切 接 转
增 检
转化是一个DNA进入细胞的过程： 妨碍DNA进入细胞的因素 （1）分子大小与细胞孔径 （2）电荷间的斥力 感受态细胞： 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,KCl)等化学
试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能
转化子
重组子
目的重组子
载体遗传标记检测
显色筛选法 显色筛选法的基本原理： 显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分
重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显
色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易 于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基 因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因 （黑色反应）等
悬浮细胞，冰上放置片刻后即制成感受态细胞悬液。
（三）感受态细胞的转化 1、在50μl上述感受态细胞悬液中，加入1μl DNA溶液。 2、将上述各样品轻轻摇匀，冰上放置5分钟后，于42℃水浴中
保温90－100秒，热休克，促进细胞吸收DNA复合物，然后迅速
置于冰浴中冷却5分钟。 3、取上述溶液全部涂布于含抗菌素LB平板培养基室温下放置20
落数即克隆数（在筛选时，未接纳载体或重组子的受体细胞不
长）
例如， pUC18 对大肠杆菌的转化率为 108 ，即每微克 pUC18 中 只 有 108 个 分 子 能 进 入 受 体 细 胞 。 一 微 克 pUC18 共 有 3.4X1011 个分子（ 6.02X1017 / 2686X660 ），也就是说，
•就原核细胞而言，质粒及噬菌体是常用的载体。 噬菌体： 噬菌体（phage）是感染细菌的一类病毒，有的 噬菌体基因组较大，如λ噬菌和T噬菌体等；有的 则较小，如M13、f1、fd噬菌体等。用感染大肠杆 菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。
实验5：大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化报告
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态 细胞总数
五、注意事项
1、冰上操作； 2、无菌操作； 3、重悬细胞时操作要轻； 4、实验应设有阳性对照，以估计转化效率；
应设立阴性对照，以消除可能的污染及查 明可能的失败原因。
实验四 大肠杆菌感受
态细胞的制备和质粒 DNA转化
实验目的和要求
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞；
学习用热激法将外源基因导入感受 态细胞。
实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 注意事项
一、实验原理（CaCl2法、热激法）
1、几个概念
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另 一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研 究的基本实验技术。
(一) 纯化及活化菌种（无抗生素的LB ）
单菌落
l mL培养液
冻存菌在新鲜LB
平板上，划线， 37℃培养16~20 h。
挑一单菌落接种到3 mL LB液体培养基 中，37℃培养过夜
取l mL培养液加到 100 mL LB液体培养 基中，37℃摇床培养 2~3 h ，当其OD600 为0.3～0.5时(细胞数 <108/mL)，立即取出， 冰浴10～15 min。
(二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
l、将菌液转移到两个冰冷离心管中，平衡 后于4℃，5000 r/min离心10 min，弃尽上 清(可用加样器将残余液体尽量去净)。— —收集沉淀
2、各加10 mL 0.1 mol/L冰冷的无菌CaCl2溶 液重悬细胞，于冰上放置15 min．于4℃， 5000 r/min离心10min，弃上清。 —— CaCl2洗涤细胞转化效率的因素
(完整word版)质粒的转化(热激法)
实验四质粒的转化质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。
可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。
实验目的：掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。
实验材料：外源片段与载体的连接产物；大肠杆菌感受态细胞。
实验原理：（1）热激法：大肠杆菌在0℃ CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。
（2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔DNA等大分子进入。
同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。
热激法转化实验步骤：1．制备选择性培养基平板：在融化的250ml LB固体培养基中（冷却止55摄氏度以下）加入Amp至终浓度50μg/ml，混匀后倒入灭菌培养皿中；2．取出1管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；3．每100μl感受态细胞加入约20ng质粒DNA，轻轻混匀，在冰上放置30分钟；4．热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管；5．冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟；6．复苏：每管加400 μl LB培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏；7．布皿：取适当体积均匀涂布于含有、抗生素（Amp）的LB平板；8．培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时即可观察到白色的菌落，即为转化子。
实验4_DNA片段的分离和回收,质粒DNA的连接和转化-Li
DNA连接酶
• 常用的DNA连接酶:
来自大肠杆菌的DNA连接酶 来自噬菌体的T4 DNA连接酶
• DNA连接酶作用机理（T4 DNA连接酶为例）：
T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-ATP复合物。 酶-ATP复合物结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切口的 DNA上，使DNA腺苷化。 产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。
实验五?琼脂糖凝胶中dna片段的分离和回收分离回收琼脂糖凝胶中dna片段?质粒dna的连接和转化第一部分琼脂糖凝胶中dna片段的分离和回收第一部分琼脂糖凝胶中dna片段的分离和回收硅基质材料法分离回收琼脂糖凝胶中dna片段实验目的
实验五
• 琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收
– 分离回收琼脂糖凝胶中DNA片段
方法和步骤
11. DNA产量和质量测定： 适当稀释DNA，测定A260及A280。按照 计算公式计算DNA浓度： DNA浓度=吸光度260x50x稀释倍数mg/ml DNA纯度=A260/A280, ＞1.8表明样品核酸 纯度＞90%。
注意事项：
• DNA易受紫外光破坏，故尽量放置于暗室，切带 时应使用长波紫外灯，切胶时间尽量短，以免对 DNA造成损伤。 • 使用前检查平衡液BL是否出现浑浊，如有混浊现 象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。 • 对于<300 bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再 加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完 全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为 吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。 • 吸附柱容积为800 μl，若样品体积大于800 μl可 分批加入。
• 酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。证据是：
分子生物学实验报告全解(有图有真相)
分子生物学实验报告慕蓝有志班梦想学院目录实验一细菌的培养 (2)实验二质粒DNA的提取 (4)实验三琼脂糖凝胶电泳法检测DNA (7)实验四质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 (9)实验五聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA (11)实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 (14)实验七RNA分离与纯化 (17)实验八RT-PCR扩增目的基因cDNA (19)实验九质粒载体和外源DNA的连接反应 (21)实验十感受态细胞的制备及转化 (23)实验十一克隆的筛选和快速鉴定 (25)实验十二地高辛标记的Southern杂交 (27)实验十三阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达 (31)思考题 (32)分子实验心得总结 (33)实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。
二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。
特别是常用的大肠杆菌。
大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。
它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。
当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。
然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。
此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。
培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。
实验室中最常用的是LB培养基。
三、实验材料、试剂与主要仪器（一）实验材料大肠杆菌（二）试剂1. 胰蛋白胨2. 酵母提取物3. 氯化钠4. 1mol/L NaOH5. 琼脂粉6. 抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等）（三）仪器1. 培养皿2. 带帽试管3. 涂布器4. 灭菌锅5. 无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）6. 恒温摇床四、操作步骤（一）LB培养基的配制配制每升培养基，应在950m1去离子水中加入：细菌培养用胰蛋白胨10g细菌培养用酵母提取物5gNaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH位至7.0。
细菌转化的实验报告
一、实验目的1. 掌握细菌转化的基本原理和方法。
2. 熟悉电击法和热激法两种转化方法。
3. 学习如何筛选和鉴定转化子。
二、实验原理细菌转化是指将外源DNA分子导入细菌细胞内，使其获得新的遗传性状的过程。
转化过程包括：感受态细胞的制备、DNA分子的转化、转化子的筛选和鉴定。
三、实验材料1. 菌株：大肠杆菌DH5α感受态细胞。
2. 质粒载体：pUC19质粒。
3. 试剂：氯化钙（CaCl2）、无菌水、DNA分子量标准、琼脂糖、限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA marker、LB培养基、抗生素（如氨苄青霉素）等。
4. 仪器：电击仪、电击杯、离心机、PCR仪、凝胶成像系统、培养箱等。
四、实验方法1. 感受态细胞的制备（1）将大肠杆菌DH5α感受态细胞接种于LB培养基，37℃培养过夜。
（2）取过夜培养的细菌，按1:100的比例加入无菌水，轻轻吹打混匀。
（3）将混匀的细菌溶液在冰浴中放置30分钟。
（4）4℃下以4000 r/min离心5分钟，弃上清。
（5）向沉淀中加入500 μL无菌水，轻轻吹打混匀。
（6）4℃下保存备用。
2. 电击转化（1）将pUC19质粒和感受态细胞按照1:1的比例混合，轻轻吹打混匀。
（2）将混合液转移到电击杯中。
（3）在电击仪上设置电压为2.5 kV，电容为25 μF，电阻为200 Ω。
（4）进行电击转化，时间约为5秒。
（5）将电击后的混合液立即加入到2 mL LB培养基中，混匀。
（6）37℃培养1小时。
3. 转化子筛选（1）将培养好的转化子涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平板上。
（2）37℃培养过夜。
（3）观察并记录菌落生长情况。
4. 转化子鉴定（1）取转化子菌落，提取质粒DNA。
（2）进行PCR扩增，检测质粒载体上的目的基因。
（3）将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。
五、实验结果与分析1. 转化子筛选经过培养，观察到平板上出现了白色菌落，表明转化成功。
2. 转化子鉴定通过PCR扩增，观察到目的基因条带，说明转化子中含有目的基因。
质粒转化流程
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在进行质粒转化之前，需要做好充分的准备工作。
实验五 转化及重组子的筛选
Transfer of T-DNA from Agrobacterium into a plant cell
Regeneration of leaf disks infected by Agrobacterium
DNA重组 重组
外源基因插入与否可通过载体上的 外源基因插入与否可通过载体上的 Lac Z基因进行初步的筛选。 Z基因 基因进行初步的筛选。 外源基因插入的细菌呈白斑 白斑， 有外源基因插入的细菌呈白斑， 外源基因插入的细菌呈蓝斑 蓝斑。 无外源基因插入的细菌呈蓝斑。
进入细胞的DNA分子通过复制、表 进入细胞的DNA分子通过复制、表 ，实现遗传信息的转移 遗传信息的转移，使受体 达，实现遗传信息的转移，使受体 细胞表现新的遗传性状。 细胞表现新的遗传性状。 将经转化后的细胞在选择性培养基 将经转化后的细胞在选择性培养基 中培养，即可筛选 中培养，即可筛选出转化体 筛选出 (transformant)，即带有异源 (transformant)，即带有异源DNA分 异源DNA分 子的受体细胞。 子的受体细胞。
Alfa互补 Alfa互补
蓝-白颜色筛选(α互补) 白颜色筛选( 互补)
一种巧妙的鉴定重组质粒的方法：是蓝 一种巧妙的鉴定重组质粒的方法：是蓝白颜色筛选。该法可以在同一转化平板 白颜色筛选。该法可以在同一转化平板 上完成筛选。 • 这种方法涉及基因的插入失活：它利用一 这种方法涉及基因的插入失活：它利用一 种蓝色化合物的形成作为指示剂。 种蓝色化合物的形成作为指示剂。 • 在这种情况下失活基因是lacZ，该基因编 在这种情况下失活基因是lacZ，该基因编 半乳糖苷酶，受lac启动子的调控。 码β-半乳糖苷酶，受lac启动子的调控。
lacZ中间 lacZ中间又插入了一段人工设计的DNA序 中间又插入了一段人工设计的DNA序 列，称为多克隆位点（MCS），含多个常 列，称为多克隆位点（MCS），含多个常 用的限制性核酸内切酶的位点，使外来的 用的限制性核酸内切酶的位点，使外来的 片段能很方便的被插入在此，当外来序列 片段能很方便的被插入在此，当外来序列 lacZ 插入后则破坏了lacZ编码的半乳糖苷酶活 插入后则破坏了lacZ编码的半乳糖苷酶活 性，生长的菌落就呈白色。 ，生长的菌落就呈白色 白色。
实验五__质粒在大肠杆菌中的转化和鉴定
原则上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷 的菌株； ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互 补原则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法：
１．抗生素筛选法
菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带 有该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉 霉素等）这样只有转化子才能在含该抗 生素的培养基上长出。
２互补法
现在使用的许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个
大肠杆菌ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷 酸基因（lacZ）的调控序列和头１４６个氨基酸偏 码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。 受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。 当外源基因插入时，二者溶为一体后，有β－半乳 糖苷酶表达， 在生色底物５－溴－４－氯－３－吲 哚－β－Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培养基中形成兰色 菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入 失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 通过 颜色不同而区分重组子和非重组子。
4、向管中加入0.4ml LB液体培养 基(不含抗生素),混匀后37℃振荡培养 45分钟,使细菌恢复正常生长状态,并表 达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。 5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂 布于含Amp的筛选平板上,正面向上放 置半小时,待菌液完全被培养基吸收后 倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
思考题： 1.在热激以后进行活化培养，这时的培养基中为 什么不加入抗生素？ 2.什么是质粒？根据在细菌中的复制，质粒有几 种类型？用于基因重组的主要用到哪种质粒？
实验五
质粒在大肠杆菌中 的转化和鉴定
一、质粒转化的功用
1. 为实验室获得大量进行基因克隆的质 粒。 2. 使携带有目的基因的重组质粒在大肠 杆菌中进行表达。
Байду номын сангаас 二、原理
质粒的酶切、连接、与转化
质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定(2011-04-29 10:42:22)转载▼质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的特性2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法5、掌握α互补筛选法的原理6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法实验原理重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。
限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。
限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。
质粒和病毒等DNA 分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较简单。
DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。
在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。
T4 DNA连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；2、连接双链DNA分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。
目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种：（一）、具互补粘性末端片段之间的连接大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割DNA分子，形成1~4核苷酸单链的粘性末端。
当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。
（二）、平末端的连接载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。
EColi感受态细胞的制备、质粒DNA的转化、提取与酶切鉴定
4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速 颠倒离心管,以混匀内容物,冰上放置3－5min;
溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变 性以及SDS使蛋白变性并形成交联的网状结构
色，可确定DNA在胶中的位置。 影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素：
DNA的分子大小； 琼脂糖浓度； DNA构象； 电场强度； 碱基组成与温度；嵌入染料的存在；电泳缓冲液的组成。
三．实验材料与设备：
1、用品与与仪器： 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养 箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速 离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝 胶成像仪、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、tip头 、烧杯、量筒
5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰 上放置2～3min；
溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部 分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性
6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep 管中；
7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀， 室温放置2min. 8、 12000g离心10min，弃上清液，再用70％的乙 醇洗涤一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸 上扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含20 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或 TE 缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约 8min)，存于－20℃或直接用于酶切。
质粒的构建、转化、筛选和鉴定
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
3.学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
4.掌握利用Cacl感受态细胞的方法。
25.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6.掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
7.学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1.重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。
实验质粒DNA的转化 18页
左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过 测定培养液的A600控制。
2．质粒DNA的质量பைடு நூலகம்浓度
用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与 外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但外源DNA的量过多 时，则会使转化率下降。一般来讲，DNA溶液的体积不应 超过感受态细胞体积的5%，1ng的超螺旋DNA即可使50 µl 的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而 言，分子量大的转化效率低。此外，重组DNA分子的构型 与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量 相同的线性重组质粒高10-100倍。
三、材料仪器
实验仪器
超净工作台、恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水 浴锅、涂布棒，微量取样器，冰盒等。
实验材料
大肠杆菌DH5α 感受态细胞； 质粒DNA:pCR4ToPoGt5GT7(Kan+Amp抗性)； LB固体培养基； 含Kan+Amp的LB固体培养基：将配好的LB 固体培养基高压
实验四、质粒DNA的转化
一
实验目的
二
实验原理
三
材料仪器
四
实验步骤
五
实验结果图
六
结果讨论
七
思考题
一、实验目的
学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体 的方法。
二、实验原理
转化（transformation）:把外源DNA分子导入到某一宿主 细菌细胞的过程称为转化。当细菌处于容易吸收外源DNA 的状态即感受态时，转化最易发生。
3．试剂的质量 化合物及无机离子的影响：所用的CaCl2等试剂均需是
质粒DNA的转化
一．实验名称：质粒DNA的转化二．实验目的：将编码目的蛋白的质粒导入大肠杆菌体内，从而大量扩增并表达目的蛋白三．实验原理：转化是将外源 DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。
转化所用的受体细胞一般是限制 - 修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（ R- ， M- ）。
将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞。
进入受体细胞的 DNA 分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。
将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源 DNA 分子的细胞）四．实验步骤;1.把固态培养基加热融化，由于温度较热用自来水冲洗瓶身降温（十度左右会再凝固，所以不能冲洗太久），在超净台中加入千分子一的AP（本质粒具有抗AP性，故AP能抑制别的细菌生长），然后向平皿中倒入少许（大约5毫升）培养基，表明自己名字2.到-80℃冰箱取出质粒（每瓶100微升，可制作两板）迅速放入冰盘保存，放入4℃保存30min3.将上述混合物放在42℃水浴锅中融化90s（据经验42度90s最适合），在超净台中用针尖沾取少许质粒放入大肠杆菌EP管内（质粒为提纯多的所以加很少，一般未提纯的加1微升），再加200微升无抗培养基，加完后放回冰盘（热：壁通透性大，冷:通透性小，起封闭作用）放入摇床15min。
4.摇完后用微量加样枪析出滴到制作好的培养皿的中央，然后慢慢铺满平皿底部（千万不能滑到边缘，由于量比较少，滑到边缘就不容易再铺），表明细菌名称，实验时间，放入4℃温箱隔夜保存5.观察有稀疏斑点状菌落，从4度冰箱取出培养基，在超净台中，取四支带帽试管（表有黄线者为抗AP）分别倒入培养基至黄线处；用过火的镊子夹取黄枪尖（枪尖过火要快以防烧焦）按象限沾取菌落一枚，放入试管中，注意整个过程要过火。
6.将试管放入摇床中，未完待续五．实验结果:六．注意事项：1.培养基溶解后冲洗降温不要太久以免再凝固 2.取质粒尽可能的一直放入冰盒3.42度90s 4.铺板要匀【原理】转化是将外源DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。
实验五农杆菌感受态细胞的制备和质粒转化
感受态细胞制备的原理
• 感受态细胞制备的原理是细菌在低温和低 渗氯化钠溶液中，菌细胞壁通透性增加。
实验原理
• 转化方法：电击法、 CaCl2、 NaCl等化 学试剂法 • 感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性 发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通 过时细胞的状态。 • 转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子 的受体细胞( TransfoKan培养基
影响转化率的因素
• • • • 细胞生长状态和密度。 转化的质粒 DNA 的质量和浓度。 试剂的质量。 防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。
实验试剂
农杆菌LBA4404 YM培养基， 0.1mol/LNaCl溶液（预冷） 20mM CaCl2溶液（预冷） 卡那霉素（50mg/ml） 质粒DNA （上周日提取）
2.挑取单菌落接种到40ml YM液体培养基（硫酸链 霉素，25mg/ml）中，28℃条件下，250rpm悬 浮培养12-20小时。
3．在超净工作台上将菌液转入灭过菌的50ml离心管 中，4℃ ，5000×rpm离心8min。 4．在超净工作台上弃上清，用100mM NaCl （4℃ 预冷）重悬农杆菌，4℃， 5000×rpm离心8min。 5．在超净工作台上弃上清，加入原始农杆菌菌液 1/50体积（800ml）的20mM CaCl2溶液重悬菌体， 并分装成500ml/管。 6．将分装后的离心管置于液氮中10秒，-80℃保存。
农杆菌感受态细胞的制备
1.将农杆菌LBA4404（抗硫酸链霉素，25mg/ml）接 种在YM平板上，26-28℃ 培养48小时。
YM培养基的配方：酵母提取物0.4g/L；甘露醇 10g/L；NaCl 0.1g/L；MgSO4 0.1g/L； K2HPO4 0.5g/L；琼脂粉 15g/L pH：7.2-7.4
分子克隆技术实验操作手册
热激法转化实验步骤：........................................................................................................ 11 质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤 ........................................................................12
实验六 PCR 技术 .........................................................................................................12 系列二 Southern 杂交技术........................................................................................14
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系列一 分子克隆技术.....................................................................................................4 实验一 质粒的制备 ......................................................................................................4 实验二 DNA 的琼脂糖凝胶电泳........................................................................5 实验三 外源 DNA 片段在质粒载体中的克隆..........................................6 实验四 感受态细胞的制备 .....................................................................................9
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实验五质粒的转化及转化子的鉴定（8学时）
实验目的
掌握热激法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。
实验原理
（1）热激法：大肠杆菌在0 ℃ CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA 形成抗DNase 的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。
（2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于DNA 等大分子进入。
同时DNA 在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。
试剂与器材
1、试剂质粒，LB液体培养基(Luria-Bertani) ，LB固体培养基，50mg/ml氨苄青霉素(Ampicillin)储存液，
2、器材恒温摇床，台式低温离心机，恒温水浴锅，超净工作台，微量移液枪，eppendorf管。
热激法转化实验步骤
1．制备选择性培养基平板：在融化的250ml LA 培养基中加入250μl Amp （100mg/ml ），250μl X-gal (20mg/ml) ，25μl IPTG (200mg/ml) ，混匀后倒入灭菌培养皿中；
2．取出3 管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；
3．每100μl 感受态细胞加入约20ng 质粒DNA ，3 管分别加连接产物、标准超螺旋质粒DNA （阳性对照）及不加入任何DNA （阴性对照），用移液器轻轻吸打均匀，在冰上放置30 分钟；
4．热击：将离心管放置42 ℃水浴，热击90 秒，注意：勿摇动离心管；
5．冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1 －2 分钟；
6．复苏：每管加800μl lB 培养基，在37 ℃摇床温和摇动温育45 分钟，使细菌复苏；
7．涂皿：取适当体积均匀涂布于含有抗生素（Amp ）的LB 平板；
8．培养：倒置培养皿，于37 ℃培养12 －16 小时即可观察到菌落。
注意事项
1．利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转化细胞铺平板的密度要低（90mm 平板上不得超过105个菌落），同时37 ℃培养不应超过20 小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可将β－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。
2．鉴定转化子中是否含有外源DNA 片段常用的方法有：
①α互补；
②杂交筛选；
③插入失活（一些老质粒如pBR322 等）;
④小量提取质粒，并酶切或PCR 检测
思考题
42 ℃热击的作用是什么？。