家禽禽流感病毒AGID抗体定性检测及H5、H9亚型HI抗体定量检测能力验证结果分析
论文h5型高致病性禽流感免疫抗体检测及分析(论文)
本科生毕业设计（论文）题目h5型高致病性禽流感免疫抗体检测及分析学院动物医学院专业动物医学班级动医（061）班姓名如则·塔伊尔学号063631127指导教师加尔肯职称讲师2011年4月28日新疆农业大学教务处制目录摘要 (1)关键词 (1)前言 (1)1 材料和法 (2)1.1毒株 (2)1.2 疫苗 (2)1.3 试验动物 (2)1.4疫苗在1日龄无母源抗体商品鸡的免疫效力 (2)1.5疫苗在1日龄含母源抗体商品鸡的免疫效力 (2)1.6 血清学检测 (2)1.7保护率计算 (2)1.8统计分析 (2)2试验结果 (3)2.1 rFPV-HA和灭活疫苗诱导的HI抗体应答 (3)2.2 rFPV-HA与灭活疫苗的免疫效力 (4)3讨论 (5)3. 1 rFPV-HA与灭活疫苗诱导HI抗体应答能力 (5)3.2 rFPV-HA与油乳剂灭活疫苗免疫效力比较 (5)3.3 rFPV-HA与油乳剂灭活疫苗应用前景分析 (5)谢辞 (7)参考文献 (8)H5型高致病性禽流感免疫抗体检测及分析如则·塔依尔摘要：利用表达H5亚型禽流感病毒血凝素基因(HA)的重组鸡痘病毒(rFPV-HA和全病毒灭活疫苗免疫商品鸡,比较两种疫苗的保护效力。
结果发现,利103PFU和106PFU的rFPV-HA免疫无母源抗体商品鸡和含母源抗体商品鸡,HI抗体应答水平均低于灭活疫苗免疫组.利用H5亚型禽流感病毒经肌肉注射攻毒后,rFPV-HA免疫的无母源抗体商品鸡获得了完全保护(100%),高于灭活疫苗保护率(94.7%);但rFPV-HA免疫含母源抗体商品鸡诱导的保护率(11.4%～15.8%)低于灭活疫苗免疫组的保护水平(68.45)。
结果表明,rFPV-HA诱导HI抗体的能力低于灭活疫苗;但rFPV-HA免疫无母源抗体商品鸡的保护率完全达到灭活疫苗保护水平,显示出了良好的应用前景;灭活疫苗和rFPV-HA均受到母源抗体的干扰,不适于在母源抗体处于高峰期时使用。
肉鸡与蛋鸡H5、H7、H9亚型禽流感病毒抗体水平调查
肉鸡与蛋鸡H5、H7、H9亚型禽流感病毒抗体水平调查作者：李家凯郭康康刘丽娜来源：《湖北农业科学》2020年第11期摘要：为了解养殖场家禽中H5、H7、H9亚型禽流感病毒抗体水平，通过血清学调查，应用血凝抑制试验（HI）的方法，对四川内江、山东济南、河南鹤壁、江苏扬州4个定点实验观测站负责的养殖场的鸡血液样本进行禽流感病毒抗体分析，其中包含2个肉鸡场和3个蛋鸡场。
研究发现蛋鸡场通常免疫了H5、H7、H9（或H5与H9）亚型禽流感疫苗，而肉鸡场只免疫了H9亚型禽流感疫苗;蛋鸡场和肉鸡场都存在免疫禽流感疫苗后抗体水平低和无抗体产生的情况，从而导致免疫不合格或免疫失败。
以上结果表明，应加强家禽养殖场对不同亚型禽流感疫苗的免疫以及免疫后的禽流感病毒抗体水平监测，以防免疫失败，从而预防禽流感的发生和流行。
关键词：肉鸡与蛋鸡;H5、H7、H9亚型禽流感疫苗;抗体水平;免疫合格率Abstract： In order to understand the immune antibody level of H5， H7 and H9 subtypes avian influenza virus in poultry， the blood samples of four experimental observation stations in Neijiang city of Sichuan province， Jinan city of Shandong province， Hebi city of Henan province and Yangzhou city of Jiangsu province were analyzed by serological investigation and hemagglutination inhibition test（HI），including two broiler farms and three layer farms. The research found that layers were immunized with H5， H7， H9（or H5 and H9） subtypes avian influenza vaccines，while broilers were only immunized with H9 subtype avian influenza vaccine. The layer farms and broilers farms had low antibody production after the immunization of avian influenza vaccine，leading to unqualified or immune failure. It is suggested that the immunization different subtypes of avian influenza vaccine and the monitoring of avian influenza antibody levels after immunization should be strengthened to prevent the occurence and prevalence of avian influenza.Key words： broilers and laying hens; H5， H7， H9 subtypes of avian influenza vaccine; antibody level; qualified rate of immunity1994年，张泽纪等[1]首次从中国广东某鸡场发病鸡体内分离到H9N2亚型病毒。
五例H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定
·190·试验研究农业开发与装备 2022年第12期五例H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定丁小丽，李 娜，陶宏卫*（江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300）摘要：对苏北地区某鸡场疑似H9亚型禽流感病毒的5份病料样品，通过鸡胚接种、血清学试验和RT－PCR检测等方法对样品进行分离、鉴定和分析，确定分离的 5 个毒株为H9亚型禽流感病毒，虽然受感染后，并未造成鸡群的大规模死亡，但是使鸡场产蛋率的严重下降，并引起生长缓慢，给养鸡场造成了巨大损失。
本实验对该病例进行了诊断分析、分离和鉴定，为禽流感的诊断和预防提供了一定参考。
关键词：禽流感；H9亚型；分离；鉴定0 引言禽流感（Avian Influenza，AI）是禽流行性感冒的简称，是指由A型流感病毒引起的一种家禽、野鸟和部分哺乳动物发病的人兽共患传染病[1]。
禽流感病毒分为高致病性和低致病性两大类，低致病病毒感染家禽后症状不明显，容易被忽视，因此得以长期、广泛的分布，周而复始的循环及变异使其不断适应当下养殖环境，进而演化成为具有耐药性及跨种属感染的新型毒株[2]。
因此，在低致病性禽流感流行季节，对病毒的分离、鉴定能够正确诊断该病，从而有效地防控该病的发生。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 样品与毒株笔者在苏北地区某公司合作农户鸡场采集疑似 H9 亚型禽流感发病鸡群病料5份，分别为HF-1、HF-2、JT-1、JT-2、JT-3，采样时间为2022年春。
1.1.2 主要试剂标准抗原：H9禽流感诊断抗原，由国药集团扬州威客生物工程有限公司提供。
标准抗体：H9亚型禽流感病毒特异性血清、禽流感（ H5、H7 亚型）阳性血清、鸡新城疫阳性血清、减蛋综合征阳性血清，均有由国药集团扬州威客生物工程有限公司提供。
相关试剂：SuperScript ™ Ⅱ Reverse Transcriptase 反转录酶及其Buffer和E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit购自OMEGA BIO-TEK公司；DL2000 Marker购自Takara 公司。
禽流感H5、H7和H9亚型多重PCR方法的建立
禽流感H5、H7和H9亚型多重PCR方法的建立胡凌; 张鹏; 陈有才; 张军; 戴悦涵; 胡卫杰【期刊名称】《《中国兽医杂志》》【年(卷),期】2019(055)004【总页数】4页(P40-43)【关键词】多重PCR; 禽流感; H5; H7; H9【作者】胡凌; 张鹏; 陈有才; 张军; 戴悦涵; 胡卫杰【作者单位】四川省自贡市动物疫病预防控制中心四川自贡643000【正文语种】中文【中图分类】Q939.47禽流感(AI)病是由正粘病毒科A 型流感病毒引起的一种急性人兽共患的传染病,根据其HA 基因的抗原性差异可分为16 个HA 亚型,被世界动物卫生组织(OIE)规定为A 类传染病[1-2]。
此外,高致病性禽流感(HPAI)主要是由H5 或H7 两种亚型引起的,潜伏期极短,且常不见任何临床症状而突然死亡的传染病。
HPAI的发病率和病死率高达100%,并可感染人导致人的死亡[3,4]。
H9 亚型的禽流感病毒为低致病力的毒株,分布范围十分广泛,使鸡群产生免疫抑制,如果与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等其他的病原体同时感染则对家禽的产蛋率、死亡淘汰率和料肉比等生产性能有严重影响。
且近十几年来,我国的H9 亚型禽流感在呈上升趋势,严重的危害了我国的养禽业发展,威胁着人类的健康,同时还影响着畜产品的国际贸易,给我国带来严重的经济损失[5]。
禽流感H5、H7、H9 是我国当前主要流行的禽流感病毒亚型,其致病性极强,威胁着养禽业的健康发展,所以已在全国范围内引起各界学者的关注。
而早期快速确诊是预防和控制禽流感发生的先决条件,尤其是针对H5、H7 和H9 亚型的检测。
通过往年研究来看,对AI 的诊断和对AIV 的定型常用的方法仍是病毒的分离和血清学试验。
但这些方法操作繁琐复杂,效率低下,很难及时对AI 的防治提供理论支持。
聚合酶链式反应(PCR)是敏感性高、特异性强,且已成为分子生物学领域最重要也是最基本的技术手段之一[6],而多重PCR 是一种特殊的PCR 形式,即可以在一个反应中于短时间内同时鉴别出多种病原体[7],该方法缩短了AIV 的检出时间,提高了检测效率,为AIV 的早期快速诊断提供了敏感、快速、实用的方法。
禽流感病毒H5、H9亚型多重RTPCR检测方法的建立及初步应用
吉林农业大学硕士学位论文禽流感病毒H<,5>、H<,9>亚型多重RT-PCR检测方法的建立及初步应用姓名：***申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：***20030601吉林农业大学硕士学位论文禽流感病毒Ｈ，、Ｈ９亚型多重ＲＴ－ＰＣＲ检测方法的建立及初步应用中文摘要本研究根据ＧＥＮＢＡＮＫ中查出的禽流感病毒Ｈ５亚型，禽流感病毒Ｈ９亚型的ＨＡ片段基因组序列，利用ＤＮＡＳＩＳ软件分别对ＡＩＶ的Ｈ５、Ｈ９亚型ＨＡ基因区域进行同源·胜比较，设计筛选出两对联合ＰＣＲ反应的特异性引物，其中一对是Ｈ９亚型通用引物，扩增出ＨＡ片段６９５ｂＰ，Ｎ一对引物为Ｈ５亚型的通用引物，扩增出的ＨＡ区域部分目的片段约为４４８ｂＰ。
建立各自的单项ＲＴ－ＰＣＲ，并用电泳鉴定ＰＣＲ扩增产物，结果证明为各自的特异性核酸片段。
在单项ＲＴ－ＰＣＲ基础上．优化引物浓度，Ｍｇｃｌ２浓度，Ｔａｇ酶、ｄＮＴＰ浓度，循环次数等反应条件后，建立了Ｈ５、Ｈ９亚型的多重ＲＴ．ＰＣＲ，同时扩增出禽流感病毒Ｈ５、Ｈ９两种亚型不同大小的特异性片段．并进行了反应条件的优化。
建立的多重ＲＴ．ＰＣＲ扩增其它相关病毒未见阳性结果。
两个亚型的单项ＲＴ—ＰＣＲ可以检测鸡胚尿囊液培养物１０。
３稀释物，多重ＰＣＲ可以检测到１０。
稀释物。
初步应用四４ｆｆ－Ｉ－鸡胚尿囊液培养物，六份临床病料的检测，并与电镜负染、琼扩及病毒分离的结果进行比较，此诊断方法与病毒分离的结果一致，比琼扩和电镜负染检出率高，可用５－·１１，床和试验室诊断。
关键词：多重ＲＴ—ｐｃＰ，禽流感病毒ＲＩｇＡ的提取禽流感病毒Ｈ５亚型禽流感病毒Ｈ，亚型ＡＩＶ的ＨＡ基因吉林农业大学硕士学位论文禽流感病毒Ｈ５、Ｈ９亚型多重ＲＴ—ＰＣＲ检测方法的建立及初步应用ＡｂｓｔｒａｃｔＡｍｕｌｔｉｐｌｅｘｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄｔＯＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙｄｅｔｅｃｔＨ５Ｉ－１９ｓｕｂｔｙｐｅｆｏｒＡｖｉａｎＩｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ．Ｔｈｅｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＨＡ）ｏｆＡＩＶｐｌａｙｓｔｈｅｋｅｙｒｏｌｅｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎｇｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，ｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｐｅｒｔｙａｎｄｈｏｓｔｒａｎｇｅｏｆｔｈｅｖｉｒｕｓ．ＴｈｅｈｏｍｏｌｏｇｙｏｆＴｈｅＨＡｓｅｑｕｅｎｃｅｓｒｅｐｏｒｔｅｄａｎｄｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄｉｎＧｅｎｂａｎｋｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｒａｉｎｓｏｆＨ５．１－１９ｓｕｂｔｙｐｅｗａｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙａｎａｌｙｚｅｄａｎｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｅａｃｈｏｔｈｅｒ．ＴｈｅｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｄｏｍｉｎｏｆＨＡｓｅｑｅｎｃｅｏｆＨ５、Ｈ９ｓｕｂｔｙｐｅｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄｆｏｒＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＴｗｏｓｅｔｓｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃＣａｎｂｅａｍｐｌｉｆｉｅｄ４４８ｂｐ，Ｈ９ｓｕｂｔｙｐｅＣａｎｂｅｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄ．Ｈ５ｓｕｂｔｙｐｅａｍｐｌｉｆｉｅｄ６９５ｂｐ．ＴｈｅｄｅｓｉｇｎｅｄｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｕｓｅｔＯＰＣＲｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｗａｓ啦ｈｔ．ＴｈｅｎｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆＰＣＲｆｏｒｄｅｓｉｇｎｏｆｔｈｅｔｗｏｓｅｔｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓｅａｃｈｖｉｒｕｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｏｒｔｈｏｎｇｏｎａｌａｓｓａｙ，ｔｗｏｓｅｔｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄａｎｄｕｓｅｄｆｏｒａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｒｉａｌｓ．ＴｈｅｒｕｄｉｍｅｎｔａｒｙａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｕｌｔｉｐｅｘＲＴ—ＰＣＲｈａｓｔｈｅｓａｍｅｒｅｓｕｌｔｓｗｉｔｈＳｅｐｒａｔｅＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｖｉｒｕｓ，ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｒｅｓｕｌｔｓａｃｑｉｒｅｄｉｓｈｉｇｈｅｒｔｈｅｎＡＧａｎｄＥＭＴｈｅｍｅｔｈｏｄｄｅｓｃｒｉｂｅｄｉｓｖｅｒｙｐｒａｃｔａｂｌｅ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｓｉｍｐｌｅ．ＩｔｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｉｎｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆＨ５、Ｈ９ｓｕｂｔｙｐｅｏｆＡＩＶＫｅｙｗｏｒｄ：ＡＩＶｍｕｌｔｉｐｌｅｘ—ＰＣＲＨ，ｓｕｂｔｙｐｅ地ｓｕｂｔｙｐｅＨＡ独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
禽流感H9 亚型毒株HI 血清交叉及HA基因同源性研究
禽流感病毒（AIV ）属于正粘病毒科流感病毒属A 型流感病毒。
禽流感又称真性鸡痘或欧洲鸡瘟，被国际兽医局（OIE ）列为A 类传染病[1-3]。
H9亚型禽流感病毒为低致病性禽流感病禽流感H9亚型毒株HI 血清交叉及HA 基因同源性研究杨沛沛，晋春霞，肖亚朋，王洋洋，赵坤坤，刘守川（洛阳中科基因检测技术有限公司业务室河南洛阳471800）来，我国养禽业经常出现H9亚型流感病毒疫苗免疫失败现象，笔者为此对近年来临床流行的H9亚型毒株变异情况进行研究。
本试验主要是通过对近两年临床分离到的H9亚型毒株HI 血清交叉试验和HA 基因同源性进行分析研究，为国内生物制品企业和科研单位疫苗的研制提供依据，对科学防控H9亚型禽流感病毒提供参考。
结果显示：同一基因分支的同一毒株血清不同分离株HI 交叉性相差甚大，即血清型与基因型之间没有相关性。
亚型；HI 血清交叉；同源性毒，主要引起禽类产蛋量下降，肉鸡和蛋鸡的复合型呼吸道疾病乃至死亡，给养禽业造成了严重的经济损失。
此外，国内外有多起人感染H9亚型流感病毒的病例报道，许多血清学调查显示我国有一定比例的人群已经感染过H9亚型流感病毒，血清阳性率高达13.7%～37.2%[4-7]。
因此，对H9亚型禽流感病毒的研究不仅为科学防控提供依据，也具有重要的公共卫生意义。
1目的通过对近两年临床分离到的H9亚型禽流感病毒毒株进行HI 血清交叉试验和基因序列分析，为筛选对当前临床主要流行毒株具有广泛保护作用的疫苗候选毒株提供依据。
2材料与方法2.1材料2.1.1H9亚型禽流感临床分离毒株共筛选7株H9亚型禽流感临床分离毒株，具体信息见表1。
2.1.2SPF 鸡和SPF 鸡胚1日龄SPF 鸡和SPF 种蛋均购自山东斯帕法斯公司。
SPF 种蛋由洛阳中科基因检测诊断中心自行孵化至10日龄，用于病毒增殖。
SPF 鸡饲养于本公司租用的普莱柯生物工程股份有限公司实验动物中心的8台隔离器中进行试验。
禽流感疫苗对禽类免疫效果的检测及分析
·46·疾防防治中国畜牧兽医2005 年第32 卷第1 期禽流感疫苗对禽类免疫效果的检测与分析金兰梅,伍清林,刘萍(金陵科技学院动物科学系, 南京210038)摘要: 禽流感大流行时, 在非疫区对禽类用H 5 亚型和H 5、H 9 二价禽流感油乳苗进行免疫接种试验, 并对其结果进行比较和分析。
得出不同日龄的蛋鸡免疫接种20 d 后其H I 抗体效价不同, 不同的饲养方式、不同种类的家禽及不同种类疫苗的免疫效果均不同。
85 日龄蛋鸡产生的H I 抗体效价达到7 l o g2, 鸡、鸭、鹅混养H I 抗体效价低于平养和笼养, H 5 亚型禽流感疫苗免疫鸡和鸽其H I 抗体效价达到了5 l o g2 以上, 而对鹌鹑和鸭为1 l o g2 和3. 2lo g2; 单价禽流感疫苗和二价苗对鸡群免疫的效果不同, 二价苗的免疫效果不如单价苗。
关键词: 禽流感; 免疫; 抗体; 检测中图分类号: S852. 65+ 9. 5文献标识码: B 文章编号: 1671 7236 (2005) 01 0046 02禽流感(A I) 是由正粘病毒科中A型流感病毒引起禽类的一种急性传染病。
按病毒粒子表面(HA ) 和神经氨酸(N A) 的糖蛋白进行分类, 可分为很多血清型, 在不同的血清型和同一血清型的不同毒株间致病性都不一样。
自1878 年在意大利发现流行以来, 在许多国家都有各种亚型、不同致病力禽流感的爆发和流行, 严重危害养禽业和经济的发展。
禽流感的迅速蔓延, 使疫苗接种成为必然的选择。
为了了解禽流感疫苗免疫的效果, 我们对疫苗免疫后H I 抗体水平进行测定, 并对不同日龄的鸡、不同的饲养方式、不同种类的家禽及不同种类疫苗的免疫效果进行比较和分析, 以了解影响抗体产生的因素, 为以后更有效地做好禽流感的预防免疫工作提供科学依据。
1材料和方法1. 1动物来源南京市郊部分大型养鸡场, 分别为青龙山蛋鸡场, 栖霞东阳蛋鸡场, 东庐集镇、禄口等肉鸡场及边防农场的种禽场。
H5亚型高致病性禽流感免疫抗体检测结果研究
㊀" 年免疫抗体检测结果 鸡抗体合格 ５ ７ ９份， 抗体合格率 ８ ０ ． ４ ％。鸭抗体合格 １ ７ ０
份， 抗体合格率 ７ ０ ． ８ ％。
㊀" 年免疫抗体检测结果 鸡抗体合格 ４ ２ １份， 抗体合格率 ８ ２ ． １ ％。鸭抗体合格 ９ ４
收稿日期： ２ ０ １ ７－ １ １－ ３ １
１ ］ 过油乳剂全病毒灭活疫苗来控制疫情 ［ 。灭活疫苗具备免疫
份， 抗体合格率 ７ ２ ． ３ ％。
㊀分析与讨论
㊀分析 （ １ ） 鸡的免疫抗体水平比鸭的要高， 原因是鸡的饲养时间
长， 规模场都二免， 肉鸭饲养时间短， 农户在整个养殖过程中只 进行一次免疫， 结果表明二免合格率高于一免。 （ ２ ） 活禽市场的家禽免疫抗体也低于养殖户的， 原因是到 销售环节的家禽距离免疫时间过长， 免疫抗体随着时间推移， 抗体水平有所降低。 （ ３ ） 无论是鸡或者鸭的免疫抗体合格率在逐年增加， 最后 全部达到整体合格率 ７ ０ ％以上， 通过每年对免疫抗体不合格或 者抗体率低的原因分析， 最后给出一个合理的免疫程序， 以达 到７ ０ ％以上的免疫抗体水平。
２ ０ １ ７年第 １ ２期（ 总致病性禽流感免疫抗体检测结果研究
陈莹娟
（ 宁明县动物疫病预防控制中心，广西 宁明 ５ ３ ２ ５ ０ ０ ）
摘㊀要： 当高致病性禽流感大面积发生时， 需要通过接种疫苗来建立起相应的隔离带， 进而有效的控制疫情。文章主要 ０ １ ３－ ２ ０ １ ６年数据， 对Ｈ ５亚型高致病性禽流感免疫抗体检测的方法， 结果进行分析， 旨在通过研 针对广西宁明县， 选择 ２ 究为今后更好的开展工作奠定基础。 关键词：高致病性禽流感；Ｈ ５亚型免疫抗体；检测结果 中图分类号： Ｓ ８ ５ ２ ． ４ ㊀㊀㊀㊀㊀文献标识码： Ｂ ㊀㊀㊀㊀㊀Ｄ Ｏ Ｉ ： １ ０ ． １ ９ ５ ６ ７ ／ ｊ ． ｃ ｎ ｋ ｉ ． １ ０ ０ ８－ ０ ４ １ ４ ． ２ ０ １ ７ ． １ ２ ． ０ ０ ７ ㊀㊀疫苗接种是大面积发生禽流感时的有效控制措施之一。 比如在巴基斯坦和墨西哥发生了高致病性禽流感之后均使用
实时荧光PCR技术快速鉴别检测H5、H9、H7亚型禽流感灭活疫苗的研究
利用 K>6L(%. G$17%1J 上公布的 68= ;6 基因序列， 软件进行比对， 找到其保守区， 根据 !.)*$. MNO.$// 分别设计 ;9、 PQ: 软件， ;<、 ;5 亚型特异性引物和 （ 上 游 引 物） 、 （下 游 引 RG7 探 针， ;9 亚 型： !9S !9P 物） 、 （RG7 探针） ； !92 ;< 亚型： !<S、 !<P、 !<2； ;5 亚 型： 引物和探针由上海基康生物技术 !5S、 !5P、 !52， 有限公司合成， 探针 9T 端标记的荧光报告 基 团 是 +6R， 2T 端标记的荧光淬灭基团是 RG7。以下是引 物和探针序列： !9S： 9T’ """66"66?666G6GG6G"?6"66?6 ’2T !9P：9T’ ?G66?"""""6"6G?6""666’2T !92：9T’ ?6""66""66G66G6?"’2T !<S：9T’ "?6""66?"66"666"?""6"6G66 ’2T !<P：9T’ ?GG"6?G?G?"6"6GG66"6 ’2T !<2：9T’ ?G?6G6"6"G"?66"6G6 ’2T !5S：9T’ ???"6?6"??"?GG""6??G"6 ’2T !5P：9T’ "G"6?G???""6??"??"6"6 ’2T
禽流感监测中HA和HI试验的应用
2018年第10期禽流感（Avian Influenza，AI ）是由A 型流感病毒引起的一种禽类病毒性疾病，被国际兽疫局确定为一类传染病。
自1878年首次在意大利发生和流行后，140年来在世界各地多次流行，对养禽业造成重大经济损失。
某种病毒或病毒的血凝素，能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝，也称直接血凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验。
当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。
这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝抑制试验。
1材料与仪器本文所用病毒尿囊液、血清皆由扬州大学兽医学院畜禽传染病学重点开放实验室提供。
1.2.1PBS 液的配制（pH:7.2）1.2.21%红细胞悬液的配置（1）采新鲜的鸡血，其中加抗凝剂1/5~1/10左右；（2）分装入10mL 的离心管中（未满则用PBS 液补足量），配平后用离心机离心10min，14000rpm/min；（3）离心结束后，弃去上清液，加PBS 吹打，配平后再次离心；（4）反复离心3次，吹打3次即可；（5）根据红细胞体积，用PBS 配成溶液浓度为1%的红细胞悬液。
恒温金属水浴锅CHB-100型（杭州大和热磁电子有限公司）、各种量程微量移液器、微量振荡器、96孔V 型微量反应板。
2实验步骤具体步骤：按照表2，向1~12孔加25μL PBS；吸取25μL 病毒，并从第1孔开始稀释一直稀释到第11孔，11孔稀释完后弃去25μL，第12孔不加病毒；12孔全部再加一遍PBS，剂量为25μL，注意悬空滴加；12孔全部再加一遍1%红细胞悬液，剂量为25μL，注意滴加时要悬空滴加；轻微震荡混匀；放37℃恒温箱20min，观察结果实验结果。
具体步骤：按照表3，向1~12孔加25μL PBS；吸取25μL 阳性血清，并从第1孔开始稀释一直稀释到第10孔，10孔稀释完后弃去25μL，第11、12孔都不加血清；4单位病毒的配制：即将一个血凝单位的病毒增加至4倍浓度，例如一个血凝单位为1:64，4个血凝单位则为64/4=16倍稀释（1倍的病毒+15倍的PBS）；从第1孔开始，病毒悬空滴加至第11孔，每孔加病毒25μL，第12孔用25μLPBS 代替；振荡混匀，室温或37℃温箱15~30min；每孔加25μL1%红细胞悬液，振荡混匀，室温10min 后开始观察，直到结果出现。
石家庄地区H9亚型禽流感HI抗体免疫效力测定
禽业导航E-mail:jrxmsy@ 石家庄地区H9亚型禽流感HI抗体免疫效力测定王华丽（正定县畜牧水产局，河北正定050800）H9亚型禽流感近十几年来在我国广泛存在，仍是当前禽流感流行的主型。
新的研究表明，H9亚型部分流行株的致病力明显变异，尤其对肉仔鸡，死亡率可达到30％以上；对产蛋高峰期的蛋鸡，其产蛋下降幅度大，恢复困难，死淘率也呈上升趋势，给广大养殖户造成了重大经济损失。
其预防除采取严格的生物安全措施外，加强对应毒株的疫苗免疫是控制本病的主要措施和关键环节。
石家庄地区是我省主要的蛋鸡养殖基地，对搞清楚禽流感H9疫苗近几年在我地区的HI抗体动态变化规律，制定科学的免疫程序，给予广大养殖户以临床理论上的指导，具有重要意义。
1材料1.1病料来源从2007年1月到2009年12月我们共采集了1500多份血清样本，来自石家庄所辖5市12县的养殖场、户及部分周边地区。
1.2抗原禽流感H9抗原。
2结果见表1和表23分析3.1通过表1可看出，随着防疫意识的增强，H9亚型禽流感的HI平均抗体在逐年增高，但仍有2.3%的样本没有产生免疫应答，有8.3%的样本HI抗体滴度低于6，易受到威胁。
3.2通过表2可看出，120日龄以下鸡HI抗体平均为7.25，离散度较大。
随着日龄的增高，免疫次数的增加，120~250日龄和250日龄以上鸡只得禽流感H9HI抗体在逐渐增高。
虽然鸡只已具有一定抵抗力，也不应放松警惕。
3.3在经对发生禽流感H9亚型的病鸡群统计，未做过H9禽流感的鸡群发病非常严重，恢复很差，死亡率很高，做过一次灭活苗免疫的发病时间推迟，但是后果一样，经过产前两次灭活疫苗免疫的鸡群在产后发病时会出现减蛋30%以上的现象，而做过三次及以上疫苗的鸡群可安然度过产蛋高峰。
因此广大养殖户需提高免疫意识，加强饲养管理。
在养殖管理各个环节上讲究科学性，增强机体的主动免疫。
4讨论4.1近几年，在部分养殖区域的免疫鸡群中H9亚型禽流感流行呈增多趋势。
禽流感病毒 H5、H7、H9 亚型多重荧光 RT-PCR 检测方法的建立
禽流感（avian influenza ，AI ）是由正粘病毒科、流感病毒属A 型流感病毒引起的禽类（家禽或野禽，以及部分哺乳动物）传染病[1]。
禽流感病毒血清亚型众多，抗原变异性强，宿主范围广泛，亚型间无交叉保护性，使得禽流感频繁暴发，成为养禽业的一大毁灭性疫病。
尤其是高致病性禽流感，是OIE 规定的法定报告A 类动物疫病[2]。
禽流感病毒在流行的过程中不断变异，跨越宿主屏障，H5N1亚型禽流感病毒和H7N9亚型禽流感病毒屡次暴发疫情，给养禽业和人类的生命安全带来巨大的威胁。
H9亚型禽流感病毒并未被规定为高致病性禽流感，往往被人们所忽视，从而造成了以H9亚型为主的低致病性禽流感的大范围流行和对养禽业产生持续危害。
此外，有研究显示H9N2亚型禽流感病毒在全世界范围内广泛传播的同时也以重配的方式产生新型禽流感病毒[3,4]。
目前国内外检测禽流感病毒最常用和经典的方法是鸡胚病毒分离，并且是国际贸易中指定的检测方法，但该方法技术要求高、耗费时间长，在疫情暴发时不利于病原的快速诊断和疫情控制。
以分子生物学技术为基础的荧光PCR 方法已成为病原核酸检测的主要方法，目前市场的禽流感病毒检测手段多以单重RT-PCR 为主，不能区分具体亚型，但在平时疫情检测和实施扑灭措施时对这些病毒亚型进行快速检测和定型非常重要。
本研究基于Taq-Man-MGB 荧光RT-PCR 技术建立一种禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR 检测方法，能够在一次反应中对样本中的病毒进行快速定型，满足准确、快速的检测需求。
1材料与方法1.1质粒样品携带禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型HA2靶基因序列片段重组质粒pUC57-AIV-H579，浓度为104copies/μL 。
1.2禽流感病毒核酸样品禽流感病毒H5亚型核酸样品15份、禽流感病毒H7亚型核酸样品15份、禽流感病毒H9亚型核酸样品15份，禽流感病毒阴性核酸样本30份，由扬州大学禽流感病毒专业实验室分离、鉴定、保存和提供。
禽流感病毒 H5、H7和 H9亚型一步法多重RT-PCR检测方法的建立
禽流感病毒 H5、H7和 H9亚型一步法多重RT-PCR检测方法的建立屈素洁;莫胜兰;邹联斌;胡杰;张步娴;梁媛;粟艳琼;施开创;李军【摘要】To develop a rapid multiplex RT-PCR assay for detection ofH5,H7,H9 subtype AIV,specific primers were designed with Primer 5.0 software according to the conserved region of the H5,H7,H9 sub-type AIV hemagglutinin gene.The results of this one step-multiplex RT-PCR demonstrated that the specif-ic bands of 380 bp,501 bp and 732 bp were observed simultaneously for RNA isolated from H5,H7 and H9 subtype AIV.And the reaction conditions were optimized to develop one step-multiplex RT-PCR assay for detection of H5,H7,H9 subtype AIV.The method has high specificity and sensitivity.The minimal amount of detection was10-4 copies/μL RNA of H5,10-4 copies/μL RNA of H7 and 10-2 copies/μL RNA of H9 subtype AIV,respectively.There was no cross-reaction with other avian pathogens after amplifica-tion.The molecular diagnose method was preliminarily established to detect H5,H7 and H9 subtypes of a-vian influenza viruses rapidly,sensitively and specifically.%为了建立能同时检测 H5、H7和 H9亚型禽流感病毒（AIV）的方法，参考 GenBank中 H5、H7和 H9亚型AIV的 HA基因序列的保守区域，利用Primer 5．0软件设计3对分别针对AIV H5、H7和 H9亚型的特异性引物，预期特异扩增 H5 AIV片段大小为380 bp、H7 AIV为501 bp、H9 AIV为732 bp。
25601206_种鸡禽流感抗体的检测与分析
２０２１年第５期浙江畜牧兽医櫇櫇櫇櫇櫇櫇櫇櫇殱殱殱殱试验研究收稿日期：２０２１ ０１ ０６种鸡禽流感抗体的检测与分析高 琛，周颖璐（嵊州市畜牧业发展中心，浙江嵊州３１２４００）摘要：为了解潍坊市某些种鸡禽流感免疫抗体的水平，本试验利用血凝和血凝抑制试验对９个鸡场１８８羽种鸡的血清进行禽流感抗体检测。
结果表明Ｈ５亚型禽流感抗体效价在８ｌｏｇ２至１２ｌｏｇ２的血清有１７８头份，免疫合格率９４．６８％，Ｈ９亚型禽流感抗体效价在８ｌｏｇ２至１２ｌｏｇ２的血清有１５９头份，免疫合格率８４．５７％。
关键词：禽流感；抗体；血凝抑制试验；种鸡中图分类号：Ｓ８５２．４＋３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００５－７３０７（２０２１）０５－０００１－００３ 禽流感（ＡｖｉａｎＩｎｆｌｕｅｎｚａ，ＡＩ）是禽类流行性感冒的简称，是由正黏病毒科，流感病毒属，Ａ型流感病毒（ＡｖｉａｎＩｎｆｌｕｅｎｚａＶｉｒｕｓ，ＡＩＶ）引起的一种禽类（家禽和野禽）、哺乳动物的高发病率、高死亡率和高变异性的重大动物传染病。
根据禽流感病毒致病性和毒力的不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感（ＨｉｇｈＰａｔｈｏｇｅｎｉｃＡｖａｉｎＩｎｆｌｕｅｎｚａ，ＨＰＡＩ）、低致病性禽流感（ＬｏｗＰａｔｈｏｇｅｎｉｃＡｖａｉｎＩｎｆｌｕｅｎｚａ，ＬＰＡＩ）或温和型禽流感（ＭｉｌｄｌｙＰａｔｈｏｇｅｎｉｃＡｖａｉｎＩｎｆｌｕｅｎｚａ，ＭＰＡＩ）。
禽流感病毒可分为１６个Ｈ亚型和９个Ｎ亚型。
一般情况下，由Ｈ５和Ｈ７亚型毒株（以Ｈ５Ｎ１和Ｈ７Ｎ７为代表）所引起的禽流感称为高致病性禽流感，发病率和死亡率高、风险危害大。
世界动物卫生组织（ＯＩＥ）将高致病性禽流感列为Ａ类动物疫病［２］，我国将其列入一类动物疫病。
几乎每次ＡＩ的暴发，尤其是ＨＰＡＩ的暴发都给当地养禽业带来沉重的打击，有时也引起人的感染、发病甚至死亡，对人类健康构成极大威胁，因此已经引起世界各国的高度关注［３］。
ＡＩＶ低毒力株能明显降低家禽的生产性能，引起产蛋异常和肉鸡死亡等，并在禽类间隐性传播，经抗原漂移或抗原转变形成新毒株或毒力增强，也开始受到关注［４］。
鸡禽流感h5、h7和h9抗体水平合格率检测
畜 牧 兽 医2020年第11期新农民鸡禽流感H5、H7和H9抗体水平合格率检测熊 鑫（安徽省宁国市农业农村局，安徽 宁国 242300）摘要：本试验为了检测宁国市某养殖场屠宰环节中经疫苗免疫后的鸡祖代及父母代禽流感H5、H7和H9抗体水平合格率。
通过血凝试验分别对H5、H7和H9抗原进行倍比稀释，测得四倍抗原，根据稀释倍数制备抗原稀释液。
通过血凝抑制试通过验将血清从第1孔倍比稀释到第5孔，第6孔倍比稀释到第10孔，其中每排第11孔为阳性对照，第12孔为阴性对照。
先加入抗原稀释液振荡混匀后置于在37℃充分反应，再加入1%红细胞悬液振荡混匀后置于在37℃充分反应，进行读数。
关键词：禽流感；抗体水平；血凝试验；血凝抑制试验1 试验方法1.1 样本制备①于屠宰环节随机选取某养殖场鸡祖代（80周龄）及父母代（48周龄）各50只；②通过翅静脉采集血液，于37℃放置2h；③取上清液在1800r/min条件下离心2～3min，用移液器吸取上层清液（即为血清）于新的离心管中；④进行编号标记后于-20℃保存。
1.2 制备1%鸡红细胞悬液①注射器吸取适量阿氏液，通过翅静脉采集健康公鸡血液；②于1500r/min条件下离心8～10分钟，用移液器尽可能吸净上层清液弃去；③加入生理盐水通过称量配平后，用移液器重复吹打使悬液充分混匀；④重复②③步骤3～5次；⑤离心后将上层清液弃掉，用生理盐水配成1%红细胞悬液，置于4℃保存备用。
1.3 HA试验①取1块96孔V型微量反应板水平放置于实验台，进行标记；②分别选取6排，其中每2排为重复操作，第1～12孔分别加入25μL生理盐水；③分别于相应标记的第1孔加入H5、H7和H9抗原25μL，倍比稀释至第11孔，弃去枪头内液体；④6排的每孔加入25μL生理盐水；⑤6排的每孔加入配制好的25μL 1%红细胞悬液，振荡混匀后于37℃恒温箱内反应15～20分钟；⑥观察结果，获得抗原血凝效价，制备抗原稀释液。