PCR常见问题分析及解决策略
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提高PCR特异性最重要的方法之一。
策略之四使用PCR增强剂
甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜碱等 都可充当PCR的增强剂。 其可能的机理是降低熔解温度，从而 有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸 通过二级结构区。 增强剂浓度要适当。
荧光定量PCR常见问题
荧光定量PCR扩增效率确认： 相关系数（R2）：大于0.98 标准曲线斜率：-3~-3.5 PCR扩增效率（E）：0.9~1.2 重复性好：STD ＜0.2 特异性好
荧光定量PCR常见问题
反应循环数不够； 检测荧光信号步骤有误； 引物、探针设计不佳或降解； 模板量少或降解。 反应条件或体系不佳：优化；
无Ct值（信号）出现
或出现过晚：
扩增片段过长：100~200bp。
阴性对照出现
明显的扩增：
荧光PCR mix或水污染；
出现引物二聚体：设计特异性引物。
如何选择最合适的DNA聚合酶 -----根据PCR实验需求
特异性-----基因组扩增、RT-PCR
保真性-----基因筛选、测序、克隆 长片段扩增-----构建基因图谱、测序等 扩增效率-----复杂模板扩增（GC含量高、二级结构） PCR试剂盒-----复杂模板扩增、大规模基因检测
PCR常见问题之一-----无扩增产物
PCR常见问题之四-----假阳性
现象：空白对照出现目的扩增产物
原 因
靶序列或扩增产物的交叉污染
对 策
• • 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪 内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材 均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应 一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。
原因
1. 1. 2. 3. 4.
RNA降解或起始量少 RNA含抑制成分 cDNA 5’端不全 目的基因在组织中不 表达或表达量太低
2. 对 策
3.
4.
分离高质量的RNA 使用高温逆转录酶，如 RT007（BioFlux） 使用随机引物或GSP 尝试其它组织
TIANGEN相关产品
Super RNase HReverse Transcriptase
策略之二递减PCR
递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨 的退火条件提高特异性。循环设在比估算的 Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循 环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃。
特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些
产物在随后的循环中继续扩增占据优势。
递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同
六种Taq和MasterMix：
Taq 、 Pfu 、 HotStart Taq 、 Taq plus 、 Long Taq 、 Taq Platinum dNTP 引物 SP6,Tn7,M13
PCR RT-PCR
DNA Marker：22
种不同大小的分子量Biblioteka Baidu准
TA 克隆系统：
pBS-T 载体、连接和克隆试剂盒 pGM-T 载体、连接和克隆试剂盒 pCF-T 、pCF-Blunt 载体、快速连接试剂盒 感受态细胞
荧光定量PCR常见问题
溶解曲线不止一个主峰：
引物设计不佳：设计特异性引物； 引物浓度不适：降低引物浓度； 退火温度低：调整退火温度；
镁离子浓度过高：降低镁离子浓度；
模板中有基因组污染：注意提取过程； 耗材仪器不匹配； 反应体系污染等：设置阳性阴性对照。
荧光定量PCR常见问题
扩增效率低：
反应体系中部分成分尤其是荧光染料降解； 反应条件不佳：延长退火、延伸时间，改为三步法，
降低退火温度，提高引物浓度，重新设计引物；
反应体系中有抑制物：一般为模板引入。
重复性不好：
加样不准确； 仪器温度均一性不好； 模板浓度低。
荧光定量PCR常见问题
扩增曲线不正常：
基线等设置不当：减小基线终点； 模板量过多：将模板稀释。
DNA模板
纯 度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 模板降解会导致PCR扩增无产物 加量过多导致非特异性扩增增加 完整性 浓 度
引
物
特异性 完整性 浓 度 长度适当、避免二级结构和二聚体 避免反复冻融 应适当,过高导致非特异性增加, 过低则扩增产物 太少
反应体系对PCR扩增的影响
反应缓冲液
• pH值,盐离子浓度
•稳定剂,增强剂 •过高非特异性严重
Mg 2＋浓度
•过低无扩增产物
•浓度适当
dNTPs
•避免反复冻融
•pH值适当 •避免污染
dH2O
如何选择最合适的DNA聚合酶
Taq酶 PCR用耐热 DNA聚合酶
pfu酶
Hotstart Taq酶 Taq plus 混合酶 Long Taq Taq platinum
•
提高PCR反应特异性策略
• 巢式PCR（Nest-PCR） • 递减PCR（TouchDown PCR）
• 热启动PCR（HotStart PCR）
• 使用PCR增强剂
策略之一巢式PCR
PF2 PF1 PR1 PR2
巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点 的可能性，因为同多套引物都互补的靶 序列很少。 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀 有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难 PCR（如5' RACE）的特异性。
PCR常见问题之二-----非特异性扩增
现象： PCR扩增后出现的条带与预计
的大小不一致，或大或小，或者同时出
现特异性扩增带与非特异性扩增带。
原 因
•
•
• •
•
•
引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 对策 2+ Mg 浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多
• •
•
• • •
重新设计引物或者使用巢 式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用 二阶段温度法 减少循环次数
源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指 纹分析等。
策略之三热启动PCR
热启动主要是通过抑制一种基本成分延
迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度；
现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，
该酶具有热启动的性能，使用简单方便， 适合于高通量应用；
热启动PCR是除了好的引物设计之外，
现象：正对照有条带，而样品则无
原 因
• • • •
M
1
2
正对照
模板含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短
对 策
• • • • 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间
临床PCR检测常见问题解决办法
外标定量与内标定量：
外标定量
能做标准曲线定量，线性范 围宽；成本低，易实现
内标定量
标准品和样本的反应完全一致， 误差最小定量最准确
优点
缺点
反应情况的同步性较内标定 量差
只能一点定标，线性范围有限； 标准与样本的信号区分要不同的 检测信号，难度大，成本高
RT常见问题
问题1：RT-PCR没有产物
临床PCR检测的常见问题
假阳性问题
方法学问题：靶基因序列特异性、 引物错配、非特异性扩增 污染问题：样本污染、产物污染 假阴性问题
试剂因素 操作因素 仪器因素 标本因素 定量问题 外标定量与内标定量
临床PCR检测常见问题解决办法
假阳性解决办法： 严格区分及实验人员培训； 使用UNG技术。 假阴性解决办法： 设置阳性对照监测试剂问题； 降低操作难度，提高操作人员素质； 阳性对照、标准曲线或使用内对照监控仪器故障； 使用抗干扰能力强的试剂提取样本DNA。
PCR常见问题、 原因分析及其对策
PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案
提高PCR反应特异性的策略 定量PCR常见问题 临床PCR检测的常见问题
PCR标准反应体系
• DNA模板
• 引物
• 反应缓冲液 • Mg 2＋浓度 • dNTPs • dH2O • 耐热聚合酶
反应体系对PCR扩增的影响
PCR常见问题之三-----拖尾
现象：产物在凝胶上呈Smear状态
M 1 2
原 因
• • • • • •
模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多
• •
•
• •
对策
•
纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数
策略之四使用PCR增强剂
甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜碱等 都可充当PCR的增强剂。 其可能的机理是降低熔解温度，从而 有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸 通过二级结构区。 增强剂浓度要适当。
荧光定量PCR常见问题
荧光定量PCR扩增效率确认： 相关系数（R2）：大于0.98 标准曲线斜率：-3~-3.5 PCR扩增效率（E）：0.9~1.2 重复性好：STD ＜0.2 特异性好
荧光定量PCR常见问题
反应循环数不够； 检测荧光信号步骤有误； 引物、探针设计不佳或降解； 模板量少或降解。 反应条件或体系不佳：优化；
无Ct值（信号）出现
或出现过晚：
扩增片段过长：100~200bp。
阴性对照出现
明显的扩增：
荧光PCR mix或水污染；
出现引物二聚体：设计特异性引物。
如何选择最合适的DNA聚合酶 -----根据PCR实验需求
特异性-----基因组扩增、RT-PCR
保真性-----基因筛选、测序、克隆 长片段扩增-----构建基因图谱、测序等 扩增效率-----复杂模板扩增（GC含量高、二级结构） PCR试剂盒-----复杂模板扩增、大规模基因检测
PCR常见问题之一-----无扩增产物
PCR常见问题之四-----假阳性
现象：空白对照出现目的扩增产物
原 因
靶序列或扩增产物的交叉污染
对 策
• • 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪 内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材 均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应 一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。
原因
1. 1. 2. 3. 4.
RNA降解或起始量少 RNA含抑制成分 cDNA 5’端不全 目的基因在组织中不 表达或表达量太低
2. 对 策
3.
4.
分离高质量的RNA 使用高温逆转录酶，如 RT007（BioFlux） 使用随机引物或GSP 尝试其它组织
TIANGEN相关产品
Super RNase HReverse Transcriptase
策略之二递减PCR
递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨 的退火条件提高特异性。循环设在比估算的 Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循 环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃。
特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些
产物在随后的循环中继续扩增占据优势。
递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同
六种Taq和MasterMix：
Taq 、 Pfu 、 HotStart Taq 、 Taq plus 、 Long Taq 、 Taq Platinum dNTP 引物 SP6,Tn7,M13
PCR RT-PCR
DNA Marker：22
种不同大小的分子量Biblioteka Baidu准
TA 克隆系统：
pBS-T 载体、连接和克隆试剂盒 pGM-T 载体、连接和克隆试剂盒 pCF-T 、pCF-Blunt 载体、快速连接试剂盒 感受态细胞
荧光定量PCR常见问题
溶解曲线不止一个主峰：
引物设计不佳：设计特异性引物； 引物浓度不适：降低引物浓度； 退火温度低：调整退火温度；
镁离子浓度过高：降低镁离子浓度；
模板中有基因组污染：注意提取过程； 耗材仪器不匹配； 反应体系污染等：设置阳性阴性对照。
荧光定量PCR常见问题
扩增效率低：
反应体系中部分成分尤其是荧光染料降解； 反应条件不佳：延长退火、延伸时间，改为三步法，
降低退火温度，提高引物浓度，重新设计引物；
反应体系中有抑制物：一般为模板引入。
重复性不好：
加样不准确； 仪器温度均一性不好； 模板浓度低。
荧光定量PCR常见问题
扩增曲线不正常：
基线等设置不当：减小基线终点； 模板量过多：将模板稀释。
DNA模板
纯 度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 模板降解会导致PCR扩增无产物 加量过多导致非特异性扩增增加 完整性 浓 度
引
物
特异性 完整性 浓 度 长度适当、避免二级结构和二聚体 避免反复冻融 应适当,过高导致非特异性增加, 过低则扩增产物 太少
反应体系对PCR扩增的影响
反应缓冲液
• pH值,盐离子浓度
•稳定剂,增强剂 •过高非特异性严重
Mg 2＋浓度
•过低无扩增产物
•浓度适当
dNTPs
•避免反复冻融
•pH值适当 •避免污染
dH2O
如何选择最合适的DNA聚合酶
Taq酶 PCR用耐热 DNA聚合酶
pfu酶
Hotstart Taq酶 Taq plus 混合酶 Long Taq Taq platinum
•
提高PCR反应特异性策略
• 巢式PCR（Nest-PCR） • 递减PCR（TouchDown PCR）
• 热启动PCR（HotStart PCR）
• 使用PCR增强剂
策略之一巢式PCR
PF2 PF1 PR1 PR2
巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点 的可能性，因为同多套引物都互补的靶 序列很少。 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀 有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难 PCR（如5' RACE）的特异性。
PCR常见问题之二-----非特异性扩增
现象： PCR扩增后出现的条带与预计
的大小不一致，或大或小，或者同时出
现特异性扩增带与非特异性扩增带。
原 因
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引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 对策 2+ Mg 浓度偏高 退火温度偏低 循环次数过多
• •
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重新设计引物或者使用巢 式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用 二阶段温度法 减少循环次数
源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指 纹分析等。
策略之三热启动PCR
热启动主要是通过抑制一种基本成分延
迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度；
现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，
该酶具有热启动的性能，使用简单方便， 适合于高通量应用；
热启动PCR是除了好的引物设计之外，
现象：正对照有条带，而样品则无
原 因
• • • •
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正对照
模板含有抑制物，含量低 Buffer对样品不合适 引物设计不当或者发生降解 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短
对 策
• • • • 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 降低退火温度、延长延伸时间
临床PCR检测常见问题解决办法
外标定量与内标定量：
外标定量
能做标准曲线定量，线性范 围宽；成本低，易实现
内标定量
标准品和样本的反应完全一致， 误差最小定量最准确
优点
缺点
反应情况的同步性较内标定 量差
只能一点定标，线性范围有限； 标准与样本的信号区分要不同的 检测信号，难度大，成本高
RT常见问题
问题1：RT-PCR没有产物
临床PCR检测的常见问题
假阳性问题
方法学问题：靶基因序列特异性、 引物错配、非特异性扩增 污染问题：样本污染、产物污染 假阴性问题
试剂因素 操作因素 仪器因素 标本因素 定量问题 外标定量与内标定量
临床PCR检测常见问题解决办法
假阳性解决办法： 严格区分及实验人员培训； 使用UNG技术。 假阴性解决办法： 设置阳性对照监测试剂问题； 降低操作难度，提高操作人员素质； 阳性对照、标准曲线或使用内对照监控仪器故障； 使用抗干扰能力强的试剂提取样本DNA。
PCR常见问题、 原因分析及其对策
PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案
提高PCR反应特异性的策略 定量PCR常见问题 临床PCR检测的常见问题
PCR标准反应体系
• DNA模板
• 引物
• 反应缓冲液 • Mg 2＋浓度 • dNTPs • dH2O • 耐热聚合酶
反应体系对PCR扩增的影响
PCR常见问题之三-----拖尾
现象：产物在凝胶上呈Smear状态
M 1 2
原 因
• • • • • •
模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多
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对策
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纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数