疏水色谱分离蛋白质

二 原理
疏水相互作用色谱法是利用样 品中各组份与色谱填料上配基相互 作用力的差异, 在洗脱时由于各组 份移动速度的不同而达到分离的目 的. 配基通常是一些疏水性基团, 如丁基、苯基等.
二 原理
蛋白质表面多由亲水性基团组成, 也有一些由疏水性较强的氨基酸组成 的疏水性区域.不同种类蛋白质的表 面疏水性区域多少不同,疏水性强弱 也不同;对于同一种蛋白质在不同介 质中,其疏水性区域(裂隙)伸缩程度 也不同,从而使疏水性基团暴露的程 度呈现出一定的差异.疏水相互作用 色谱法正是利用盐-水体系中样品组 份的疏水性基团和色谱填料的疏水性 配基相互作用力的不同而使样品组份 得以分离的.
三 影响因素
2) 盐浓度对疏水色谱的影响
平衡液及样品中的高盐浓度能促进蛋白质与 配基的相互作用, 在一定盐浓度范围之内, 蛋白 质的吸附量与盐浓度成线性关系. 被吸附的蛋白 质可以通过降低盐浓度而被洗脱下来.
3) pH 对疏水色谱的影响
pH 的改变必然改变蛋白质的电荷性质及电 荷量, 从而影响蛋白质与色谱填料间的静电相互 作用, 也影响蛋白质在色谱柱上的保留行为. 由 于每一种蛋白质在某一特定pH 条件下, 其空间 构象、所带电荷情况不一致,因此, pH 对蛋白质 在色谱柱上保留行为的影响具有一定的复杂性.
四 疏水色谱分离蛋白质的应用
姚丛等使用一种装有大颗粒 疏水填料的简易型疏水色谱柱在 实验室规模对细胞色素C进行了纯 化。此方法纯化工艺简单、操作 时间短,细胞色素C的质量回收率 高,纯度好。
五 展望
疏水相互作用色谱法, 由于其具有色谱条 件温和、不易使蛋白质变性失活等优点, 被成 功地用于多种蛋白质的分离纯化.天然状态的 核酸,其疏水基团(碱基)包埋在分子中心,与色 谱填料的疏水相互作用较弱;变性核酸,由于其 碱基暴露在外部,可与色谱填料形成疏水相互 作用.利用这一特性,疏水相互作用色谱法可成 功地用于基因工程核酸产物(如质粒、基因疫 苗等)的分离纯化.因此,疏水相互作用色谱作 为一种有效的分离纯化手段,必将在生物大分 子的分离纯化领域得到广泛地应用.另外,变性 蛋白质经过疏水色谱柱以后,可以得到一系列 连续的复性中间体,因此疏水色谱也可以用于 蛋白质的折叠机理和结构研究.
三 影响因素
1) 不同盐类对疏水色谱的影响
有些盐(如Na2SO4, (NH4)2SO4等)可以提 高蛋白质的稳定性, 使其溶解度下降, 对蛋白 质有盐析效应, 使蛋白质与固定相的疏水作用 增强;有些盐(如MgCl2) 虽然能增加溶剂表面 张力, 但同时也增加蛋白质的溶解度, 并不能 增强蛋白质与色谱填料的相互作用. 盐的种类 不同, 不仅影响着蛋白质在色谱柱上的保留行 为, 同时也影响着蛋白质分离纯Baidu Nhomakorabea的效果.
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疏水色谱分离蛋白质
contents
1. 概述 2. 原理 3. 影响因素 4.疏水色谱分离蛋白质的应用 5. 展望
一 概述
疏水作用色谱法名称最早引用 来描述“盐析”时以盐的水溶液为 流动相、弱疏水性多糖凝胶为色谱 填料分离纯化蛋白质等生物大分子 的洗脱色谱技术的。目前,疏水作 用色谱法已成为与离子交换色谱法、 亲和色谱法不相上下的分离纯化生 物活性蛋白质和多肤等大分子的重 要手段。
四 疏水色谱分离蛋白质的应用
耿信笃等研究并比较了高效疏水相 互作用色谱的流动相组成、固定相、pH 值和梯度方式对分离基因重组大肠杆菌 高效表达的牛朊病毒正常成熟蛋白的影 响. 并确定了牛朊病毒正常成熟蛋白分 离纯化的最优化条件。
景娟等探讨高效疏水色谱分离、纯 化人全唾液蛋白、腮腺液蛋白及颌/舌 下腺液蛋白的最佳分离条件和临床意义。
三 影响因素
4) 柱温对疏水色谱的影响
疏水相互作用是一吸热过程,增加温度可 以提高蛋白质与配基间疏水相互作用力;因此, 增加柱温有利于蛋白质的吸附,但同时温度上 升易使蛋白质变性失活.
5) 添加剂对疏水色谱的影响
在疏水色谱的洗脱液中有时要加入一些 添加剂、去污剂等. 它们可以通过竞争结合到 疏水配基上, 而使结合在柱上的蛋白质更易被 洗脱下来.