逆转录RT-PCR操作注意事项
RT-PCR操作流程及其相关注意事项
RT-PCR一知识背景：1、基因表达：DNA RNA Protein2、PCR技术(Polymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。
在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。
反应分三步：A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。
C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘ 3’方向延伸。
以上三步为一个循环，如此反复。
3、逆转录酶和RT-PCR逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；2、RNase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.4、引物的设计及其原则：引物的特异性决定PCR反应特异性。
尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
a、引物长度:一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。
b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。
GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm 值减去5～10度。
c、3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。
末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3’端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。
d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。
逆转录PCR实验流程及注意点
逆转录PCR实验流程及注意点Reverse Transcription PCRRT-PCR or reverse transcription PCR refers to PCR that uses product of an RT reaction as template. In effect, the PCR amplifies cDNA fragments. In one-tube RT-PCR, RNA and PCR primers are added to a reaction mix that is thermocycled for RT first followed by for PCR. One-tube RT-PCR reaction mixes are supplied by many manufacturers. Drawbacks to their use include lack of flexibility. Otherwise, RT-PCR is a two step process.Step I - RTSpecificity of RT-PCR can be improved by using gene specific primers for RT.It is good to include a negative control reaction in the experiment. This is set up like the test reaction, except that RT enzyme is not added to it. Absence of PCR products when using the control reaction as template indicates that the PCR products did not arise from genomic DNA contamination of the RNA sample. If the PCR primers are across introns, then this control is not needed as PCR products arising from any genomic DNA contamination will be of larger size or may even not be obtained (if the introns are large).Step II - PCRA fraction, usually 5-20%, of the RT products is directly used in PCR using gene-specific primers.NotesGenomic DNA contamination may be irrelavant if it gives rise to PCR products of sizes different than those arising from cDNA. Otherwise, e.g., when primers are designed from same genomic exon, one needs to treat the RNA preparation with DNAse (RNAse-free).The process of enrichment of mRNA (poly-A+) from total RNA using oligo-dT-affinity also reduces DNA contamination.One can also add to the RNA sample a combination of restriction enzymes to specifically cleave genomic DNA. Ashkenas et al. (Biotechniques 39:1 2005) suggestmaking a cocktail of AluI, NlaIII, Sau96I and StyD4I - all frequent cutters - andd adding it to the RT reaction at 1 U ea. enzyme / 20 ul RT reaction. Before RT, the reaction mixture is incubated at 37 deg for 30 min. Then, after RT, the reaction is treated at 94 deg for 10 min to kill the restriction enzymes.2014/8/11 by HAN。
RT-PCR操作常规
RT-PCR操作规程一，提取RNA1.取中号培养瓶(100ml培养瓶注:此时细胞汇合度≥80%),用PBS洗细胞两次，弃尽PBS，再加入约1ml PBS，用细胞刮子将细胞刮下，将细胞悬液加入1.5 mlEP管，常温，5000rpm2分钟，弃尽上清。
加0.5mlTRIzol，剧烈震荡（TRIzol由粘稠状变为清亮，仍为粉红色）。
2.室温静置30分钟.3.在EP管中各加入0.1 ml氯仿。
盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒（必要时剧烈震荡）并将其在室温静置10分钟.4.在4°C下用12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。
离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层为白色的蛋白层，上层无色的水样层。
5.用移液枪分别转上层水相（约250-300μl）于另一 1.5mlEP管中,加等体积异丙醇（约250-300μl），颠倒混匀-20°C， 10分钟来沉淀RNA→在4°C 下以12,000×g 的离心力高速冷冻离心10 分钟。
注:移液枪的枪头不宜伸入液面太深,以防洗上中层液体!;离心前注意放管的方向,此时RNA沉淀形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。
6.舍弃上清,用750μl的无水乙醇+250μlDEPC水，（预冷保存于-20°C)来洗涤RNA沉淀→在4°C以7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。
;离心前注意放管的方向,注:旋涡振荡混合样品;RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年!7. 弃上清，置于滤纸上，在超净工作台中强风吹到6-7成干（太干不易溶解），用20μl DEPC 水溶解。
(建议装于0.6的EP管中.)8紫外光度检测，使用核酸测定仪读取RNA的浓度及OD260/280比值，为了明确确RNA的质量，可以提前准备一块琼脂糖凝胶，120V，15分钟快速电泳，紫外灯下观察，是否可见5s 18，28s条带。
逆转录RT-PCR实验操作方法
逆转录RT-PCR实验操作方法RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
以RNA为模板，首先在依赖于RNA的DNA聚合酶的催化作用下体外合成cDNA的第一条链，以此条cDNA 链为模板，又可继续进行PCR。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
无论使用何种RNA，要得到理想的结果，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。
而确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染，关键是要做好实验前的准备，注意实验操作的一些细节。
1.实验前的准备1.1实验器具的准备：RT-PCR所用的500μl和200μl薄壁EP管、移液器吸嘴最好用进口的，因为进口EP管、移液器吸嘴已经去除了RNasin，也已经灭菌处理过，可以直接用。
实验前用干净的镊子夹取出EP管、移液器吸嘴插好备用，注意镊子不要碰到EP管内壁和吸嘴的尖部。
如果用国产500μl和200μlEP管和移液器吸嘴，则要提前配制0.05%——0.1%的DEPC水，将EP管、移液器吸嘴和吸嘴盒都浸泡在DEPC水中过夜后再用蒸馏水反复冲洗掉粘附的DEPC，再高压灭菌后60℃烤干备用。
注意DEPC有毒，在配制及使用时应在通风橱进行，应全程带手套、口罩。
1.2试剂的准备：做RT-PCR的试剂应提前确定储备量，如试剂量不能满足一次完整的RT-PCR操作，应马上订购试剂，等试剂到了以后再做。
因为RNA易降解，提取之后就应立即反转录，或在-80℃冰箱中保存，但是反复冻溶也容易使RNA降解，所以一旦RNA提取或溶解就应立即进行反转录。
RT-PCR的试剂都应在冰上溶解。
1.3仪器：高速冷冻离心机、PCR仪、核酸检测仪、凝胶成相系统都应提前检查是否处于正常状态。
特别是PCR仪对环境温度有要求时，应提前保证环境温度。
rt-pcr的步骤和注意事项
RT-PCR的步骤和注意事项RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA的数量和表达水平。
下面是RT-PCR的基本步骤和一些需要注意的事项。
步骤1.提取RNA：RT-PCR的第一步是从样品中提取RNA。
常见的方法包括酚/氯仿提取法和商用RNA提取试剂盒。
2.逆转录：逆转录是将RNA转录成cDNA的过程。
逆转录反应需要逆转录酶和引物。
在逆转录反应中，RNA被逆转录酶逆转录为单链cDNA。
3.退火：将逆转录产生的单链cDNA进行退火，以得到双链cDNA。
退火的温度和时间应根据引物的特异性进行优化。
4.PCR扩增：将退火得到的双链cDNA作为模板进行PCR扩增。
PCR扩增需要DNA聚合酶和引物。
PCR扩增的温度和时间也应根据引物的特异性进行优化。
5.分析产物：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析或者实时荧光定量PCR分析，以检测和定量RNA的表达水平。
注意事项在进行RT-PCR实验时，有几个注意事项需要遵守：1.RNase污染：RNase是一种可以降解RNA的酶，极易污染实验室环境。
为了避免RNase污染，所有操作前都应使用RNase去除液对实验表面进行彻底清洁，并在操作过程中使用RNase-free的试剂和器具。
2.质控：在RT-PCR实验中应常规进行阴性对照和阳性对照。
阴性对照是用纯水代替RNA模板，而阳性对照是使用已知含有目标RNA的样品。
质控实验的结果应该符合预期，以确保实验的准确性和可靠性。
3.引物设计：引物是RT-PCR实验中非常重要的因素，合适的引物设计可以提高实验的特异性和灵敏度。
引物的选择应避免自身互补性，长度一般为18-24个碱基，GC含量在40-60%之间。
此外，引物的Tm值应相近，以确保PCR扩增的效果。
4.反应体系：RT-PCR反应体系的准备需要精确的计量。
反应的组分通常包括模板RNA，引物，逆转录酶，逆转录缓冲液，核苷酸混合液，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs和MgCl2等。
RT-PCR注意事项
RT-PCR实验注意事项DEPC处理方法如下：1. DEPC处理：（1）DEPC水：100ml超纯水加入0.2ml DEPC，充分混匀，高压灭菌。
（2）Tip头（枪头）、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材（包括1ml、200μl、20μl Tip头；EP管和PCR反应管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超纯水加入1ml DEPC）37℃浸泡过夜，高压灭菌。
2. 提取RNA，用DEPC水溶解。
3. RT：我是用PCR仪来控制温度和时间的，所以RT是在PCR反应管中作的。
4. 操作过程中要戴一次性手套，并经常换手套。
最好把要直接接触样品的东西都用DEPC水处理一下，枪头盒插好枪头后，加入1-2ml的0.1%DEPC水，在灭菌就行了；现在有进口的RNASE FREE的枪头买，直接用不用处理的。
如何消除污染：机器运行完后，取出PCR产物时不能随便丢弃，应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。
（1）试剂：mixer尽量分装，不要原瓶多次取用。
（2）加样：原则是DNA最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。
如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。
另外，普通实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。
目前，国内外各个公司提供的诊断试剂盒大多采用了UNG来防污染。
Uracil-DNA N-glycosylase（UNG）尿嘧啶DNA糖基酶，来源于大肠杆菌重组克隆表达。
RNA定量：RNA也最好至少要用电泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。
至于用分光光度计比较不同标本之间就更不准了。
RNA的贮藏，最主要的是温度，－20不够，最好－80，液氮最保险。
mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和RNA降解速度的影响。
abclonal的pcr逆转录的说明书
abclonal的pcr逆转录的说明书Abclonal 是一家提供各种生命科学试剂和服务的公司，其中包括逆转录PCR（RT-PCR）试剂。
RT-PCR 是一种将RNA转化为DNA的过程，常用于检测和量化特定RNA的表达。
以下是一份Abclonal RT-PCR 试剂的使用说明书的大致内容。
一、实验目的本实验的目的是使用 Abclonal 的 RT-PCR 试剂，逆转录特定 RNA，以便进行后续的定量或定性分析。
二、实验原理逆转录PCR (RT-PCR) 是一种用于检测和量化特定RNA分子的技术。
首先，使用逆转录酶将RNA分子转化为cDNA。
然后，使用PCR技术扩增cDNA，以便进行后续分析。
Abclonal 的RT-PCR 试剂盒包含所有必要的酶和引物，以方便用户进行此实验。
三、所需材料1. Abclonal RT-PCR 试剂盒2. 逆转录酶 (如 M-MLV 或 SuperScript III)3. 随机引物或特异性引物4. RNA样品5. 热稳定DNA聚合酶 (如 Taq DNA 聚合酶)6. dNTPs (脱氧核苷酸)7. 缓冲液和稳定剂8. 离心管和移液器9. 离心机和PCR仪（如果需要）四、操作步骤1. 准备RNA样品：将RNA样品按照标准方法进行分离和纯化。
确保RNA 的质量和浓度适合后续的逆转录和PCR反应。
2. 逆转录：将RNA、缓冲液、dNTPs、随机引物和逆转录酶混合在一个离心管中。
按照试剂盒说明书的指示进行逆转录反应。
3. PCR扩增：将逆转录产物、PCR缓冲液、dNTPs、特异性引物和热稳定DNA聚合酶混合在一个离心管中。
按照试剂盒说明书的指示进行PCR反应。
4. 分析结果：对PCR产物进行电泳、荧光检测或其它适当的分析方法，以确定目标RNA的表达水平。
五、注意事项1. 请遵循所有试剂盒和酶的操作说明，以确保实验的准确性和安全性。
2. 在处理RNA时，要特别注意防止其降解和污染。
逆转录pcr要点
逆转录pcr要点逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）是一种常用于从RNA样本中合成相应DNA的技术，通常用于研究基因表达和检测RNA病毒。
以下是逆转录PCR的要点：1. 材料准备：- RNA样本：提取纯净、高质量的RNA。
-逆转录酶：常用的逆转录酶包括M-MLV逆转录酶或AMV逆转录酶。
-引物：设计合适的引物用于逆转录和PCR步骤。
- dNTPs：提供逆转录和PCR反应所需的四种脱氧核苷酸。
-缓冲液：逆转录和PCR反应所需的缓冲液，通常包含适当的盐和pH条件。
2. 逆转录反应：-将RNA样本与逆转录酶、引物和其他逆转录反应成分混合。
-进行逆转录反应，将RNA转录为相应的DNA。
反应条件和温度根据使用的逆转录酶而有所不同。
3. 酶失活：-在逆转录反应完成后，通常需要对逆转录酶进行失活，以避免其影响PCR反应。
4. PCR反应：-将逆转录产物作为PCR的模板，添加PCR引物、聚合酶、缓冲液和dNTPs。
-进行PCR反应，放大目标DNA片段。
5. PCR产物检测：-使用凝胶电泳或其他相关技术检测PCR产物的大小和纯度。
-如果需要，可以进行测序确认PCR产物的确切序列。
6. 负对照和阳性对照：-包括负对照，使用不含模板的反应混合物，以检测污染或引物二聚体等问题。
-包括阳性对照，使用已知的PCR产物或模板，以验证PCR反应的有效性。
7. 实验控制：-注意实验中的质量控制，避免污染和假阳性的可能性。
-重复实验以确保结果的可重复性。
8. 结果分析：-分析PCR产物的凝胶图谱，确认是否成功扩增目标片段。
-如果需要，使用其他技术验证结果，如实时定量PCR（qPCR）。
以上是逆转录PCR的基本要点，具体的实验条件和步骤可能会根据你的研究目的和样本类型而有所不同。
确保仔细阅读逆转录酶和PCR酶的生产商提供的使用说明书，以获取最佳结果。
RTPCR的实验原理与操作步骤
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
(一) 反转录酶的选择1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。
(二) 合成cDNA引物的选择1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于 rRNA。
2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。
由于Poly(A )RNA仅占总RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。
逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）实验方法原理步骤及注意事项
逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）实验方法原理步骤及注意事项实验方法原理逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
实验材料组织细胞试剂、试剂盒RNA提取试剂dNTP 混合物Taq DNA聚合酶第一链cDNA合成试剂盒仪器、耗材离心管离心机水浴锅PCR管电泳仪凝胶图像分析系统移液管移液枪离心管盒实验步骤一、总RNA的提取见“总RNA的提取”相关内容。
二、cDNA第一链的合成目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。
现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTMPreamplification System for First Strand cDNA Synthesis试剂盒为例。
1．在0.5 ml微量离心管中，加入总RNA 1-5 μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11 μl。
在管中加10 μM Oligo（dT）12-181 μl，轻轻混匀、离心；2．70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min；3．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2μl；上游引物（10 pM） 2 μl；下游引物（10 pM） 2 μl；dNTP(2mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl） 1 μl。
轻轻混匀，离心。
42℃孵育2-5 min；4．加入SuperscriptⅡ1 μl ，在42℃水浴中孵育50 min；5．于70℃加热15 min以终止反应；6．将管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min，降解残留的RNA。
实验篇之RT-PCR
实验篇之RT-PCR逆转录实验作为是常见的分子生物学实验之一，虽然看上去步骤简单，但当你实际操作时就会发现各种问题扑面而来，相信各位小伙伴都有被一个简单的逆转录实验搞得头晕眼花的时候，今天就由小编给大家介绍一下逆转录实验中的注意事项和常见问题，希望大家学以致用哦！图1 逆转录过程逆转录（reverse transcription）是以 RNA 为模板合成 DNA 的过程，即 RNA 指导下的 DNA 合成，逆转录实验包括3大要素，分别是引物、逆转录酶和 RNA 模板：1. 引物：逆转录引物主要有3种，包括Oligo（dT）、Random Primers 和基因特异性引物（GSP）。
其中Oligo（dT）具有12-20个 T 碱基，并且与真核生物 mRNA 的3’Poly A 尾配对，可合成全长的cDNA，但仅扩增有polyA 尾的mRNA ，对模板质量要求高，较适合克隆实验。
而 Random Primers 具有6-9个碱基，可随机识别模板并结合，适合复杂结构和微量模板，但特异性低，小片段多，适合后续qPCR 实验。
基因特异性引物可以识别特定模板序列，具有特异性强，灵敏度高的特点，但需合成特定的序列。
所以根据不同实验需求可进行相应引物的选择。
2. 逆转录酶：一种是来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒（AMV），由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的RNaseH 活性，它最适温度是42℃，最适pH8.3，在高反应温度时可消除mRNA 的二级结构对逆转录的阻碍，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 产生也限制其长度。
另一种来源于鼠白血病病毒（M-MLV），是单肽链的，有RNA 聚合酶活性和相对较弱的RNaseH 活性，最适温度37℃，最适pH7.6，较弱的 RNaseH 活性对获得2-3kb的 mRNA 的全长 cDNA 有很大好处。
3. RNA 模板：通常利用紫外分光光度计检测纯度，要求A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2。
RT-PCR实验步骤及注意事项
RT-PCR实验步骤及注意事项RT-PCR实验时间:2013-01-05 22:32 来源:作者:生物界RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng 或1ug。
2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA 存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。
如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？问题：在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！解答：1.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。
但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。
（promega）。
2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。
反转录PCR操作手册1
RT-PCR实验步骤一．实验器具：1.移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl2.吸头：1ml、200μl、20μl3.匀浆管：5ml4.EP管：1.5ml、500μl、200μl5.试剂瓶：棕色试剂瓶(广口，放75%乙醇)6.量筒：100ml7.容量瓶：1000ml8.试管架：5ml、1.5ml、20μl9.铝制饭盒：1-2个10.大瓷缸：1个11.锡泊纸：一卷12.卷纸：2卷13.三角烧瓶：带盖，稍大二．实验器具处理1.塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中(注意：小枪头要充分浸泡，必要时需要针筒打入DEPC水)，过夜后取出(注意：DEPC水很难自然晾干，所以建议先将刚取出的DEPC物品甩干，枪头装入枪头盒后甩干，EP管和匀浆管装入饭盒后甩干，然后在37度孵箱烘干)。
高压后烤干备用。
如果DEPC处理过的物品时间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。
2.玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，先泡1‰DEPC过夜，再蒙锡纸烤干备用。
3.匀浆器：(包括剪刀、镊子)先洗净后，超声消毒即可(不需要泡DEPC)。
三．试剂配制1．DEPC水：吸出1ml DEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配成1‰DEPC水，并充分振荡混匀备用。
2．75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存(DEPC水需先高压，高压时注意：1.装DEPC水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；2.高压时间在40-45分钟，所以水要适当多加一点；3.高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出)。
3．异丙醇：放入棕色瓶中。
4．氯仿：放入棕色瓶中。
5．琼脂糖四．缓冲液配制1．电泳缓冲液(5×TBE贮存液)：Tris 54g、硼酸 27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、加蒸溜水至1000ml。
使用时，将5×TBE稀释10倍成0.5×TBE就可以在电泳时使用(工作浓度) 2．上样缓冲液(6×缓冲液，4℃保存)：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油五．琼脂糖凝胶配制1．1.0%：1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾(如果首次煮胶，一定要煮透，以不出现泡沫为标志)，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min(可以放入4度冰箱加快琼脂糖凝固)后现进行电泳。
反转录PCR注意事项
反转录PCR注意事项引言反转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，简称RT-PCR)是一种常用的分子生物学技术，用于检测RNA的表达并研究基因的功能。
在进行RT-PCR实验时，我们需要遵循一些注意事项，以确保实验结果的准确性和重复性。
注意事项1. 试剂质量控制在进行RT-PCR实验前，确保所使用的试剂的质量良好。
使用高质量的酶、缓冲液和引物可以提高实验的灵敏度和特异性。
同时，尽量避免试剂的冻融循环，以免影响试剂的活性。
2. 样本RNA提取样本RNA提取是RT-PCR实验的第一步，对后续实验成功与否有很大影响。
在提取RNA时，应严格遵守无菌操作，避免外源性RNA的污染。
使用手套、面罩和无菌工作台，并尽快进行RNA的提取，以减少RNA的降解。
3. RNA浓度和质量检测在进行RT反应之前，需对提取的RNA进行浓度和质量的检测。
使用比色法或分光光度计可以准确测量RNA的浓度。
同时，通过琼脂糖凝胶电泳或生物分析仪检测RNA 的完整性、纯度和降解程度。
4. cDNA合成反应cDNA合成反应是RT-PCR实验的核心步骤，影响着后续PCR的结果。
在进行cDNA 合成反应时，注意以下几点： - 控制反应温度和时间：根据所用酶的建议，合理设置反应温度和时间。
过高或过低的温度会降低反应效率。
- 引物设计：选择合适的引物，确保其能够特异性地与目标mRNA结合。
- RNA和引物的预混：在将RNA与引物混合前，先将引物退火，然后再加入RNA，避免引物的非特异性外切。
5. PCR条件和参数优化PCR的条件和参数的优化是确保PCR结果准确性的重要步骤。
在优化PCR反应时，可以进行以下调整： - 反应温度和时间：根据所用酶的建议，合理调整反应温度和延伸时间。
- 引物浓度和退火温度：通过调整引物浓度和退火温度，优化PCR的特异性和扩增效率。
- Mg2+浓度：Mg2+是PCR的重要组成部分，合适的Mg2+浓度可以提高PCR反应的效果。
TR-PCR
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
一、反转录酶的选择1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
二、合成cDNA引物的选择1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2． Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。
由于Poly(A )RNA 仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
逆转录（RT）实验步骤
逆转录（RT）实验步骤一、准备工作1、实验器具与材料：（1）移液枪：200ul、10ul（2）吸头：200ul、20ul（3）EP管1。
5ml、100ul（4）水浴箱2、实验器具的处理与准备塑料制品：（包括吸头、EP管等）将塑料制品逐个浸泡于1‰DEPC水中（必要时小枪头需要用吸管打入DEPC水）37℃过夜，然后送至高压3次，后在80℃烘烤箱中烘干（或置于37℃中8小时左右烘干），试验前将枪头放入吸头台。
3、试剂配制和准备：（1）DEPC水：泡实验器具的DEPC水的配制：1000ml双蒸水中加1mlDEPC，放在1000ml容量瓶中静置4小时后备用。
逆转录中所用的DEPC水的配制：100ml盐水瓶内装40ml双蒸水，加40ulDEPC，37℃过夜，送至高压，后分装到几个1。
5mlEP管中，-20℃中保存备用。
（2）RT中所需要的各种试剂（3）引物浓度计算方法：（新合成的引物的稀释）假如终浓度为XuM（pmol/ul）加DEPC水体积（ul）=（OD×33×1000000）/（分子量×X）二、RT时注意事项：为避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。
三、RT步骤（一）用SSⅢ逆转录酶进行RT（20ul体积）1、准备0、65ml的EP管2、冰上操作：在EP管中加入10ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP，短暂离心。
3、65℃水浴5分钟后，立刻0℃冰水浴至少1分钟。
4、短暂离心后，冰上操作：加入4ul5×First-StrandBuffer，1ul0.1MDTT，1ulRNAse Inhibitor，1ulSSⅢ逆转录酶。
5、短暂离心6、50℃水浴60分钟进行逆转录。
7、70℃水浴15分钟灭活逆转录酶8、－20℃保存，或立即进行PCR。
（二）用AMV逆转录酶进行RT（10ul体积）1、准备0.65mlEP管2、加入4.5ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA3、稍离心，100℃沸水裕1min4、加入0.5uldNTP，2ul5×Buffer，1ulAMV逆转录酶5、稍离心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT6、100℃沸水裕3min灭活AMV7、立即PCR或－20℃保存。
rt pcr标准曲线
rt pcr标准曲线RT-PCR标准曲线。
RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）是一种用于检测RNA的方法，它可以将RNA转录成cDNA，然后进行扩增和定量。
在进行RT-PCR实验时，建立标准曲线是非常重要的，它可以用来确定样本中目标基因的相对表达量，为实验结果的准确性提供支持。
本文将介绍RT-PCR标准曲线的建立方法及相关注意事项。
1. 实验材料准备。
在建立RT-PCR标准曲线之前，首先需要准备实验所需的材料，包括RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒、引物和探针等。
此外，还需要准备用于制备标准曲线的模板DNA，该DNA应包含目标基因的序列，并且浓度应该已知。
2. cDNA合成。
接下来，使用逆转录试剂盒将RNA转录成cDNA。
在逆转录过程中，需要控制好反应条件和时间，确保cDNA的合成效率和准确性。
合成的cDNA可以用于后续的PCR扩增反应。
3. PCR扩增。
在PCR扩增反应中，需要选择合适的引物和探针，设计合理的扩增方案。
在进行PCR反应时，应该严格控制反应体系和条件，确保反应的特异性和灵敏度。
扩增产物可以通过琼脂糖凝胶电泳进行验证。
4. 构建标准曲线。
选取不同浓度的模板DNA，进行PCR扩增反应，得到一系列浓度递减的扩增产物。
然后，使用实时荧光定量PCR仪测定各个浓度点的荧光信号，并绘制标准曲线。
标准曲线应该覆盖目标基因的线性范围，并且具有较高的相关系数。
5. 标准曲线的应用。
建立好标准曲线之后，可以将待测样本的PCR产物与标准曲线进行比对，从而计算出目标基因的相对表达量。
标准曲线的建立对于实验结果的准确性和可靠性具有重要意义，因此在进行RT-PCR实验时，务必要认真对待标准曲线的建立和应用。
总结。
RT-PCR标准曲线的建立是RT-PCR实验中的重要环节，它直接关系到实验结果的准确性和可靠性。
在进行标准曲线的建立时，需要严格控制实验操作，选择合适的材料和试剂，合理设计实验方案，确保标准曲线的稳定性和可靠性。
逆转录-聚合酶链反应RT-PCRReverseTranscription-Polymerase
第1个 PCR 循环完成后 – 得到两个拷贝的靶序列
30次循环后靶序列扩增的数量
1 cycle = 2 Amplicon
No. of Cycles 1 2
No. Amplicon Copies of Target 2 4
2 cycle = 4 Amplicon
3 cycle = 8 Amplicon
PCR发明过程的简单回顾
PCR的基本原理
变性、复性、半保留复制
PCR三步曲
变性 退火 延伸 90～97℃ 45～55℃ 72℃左右
PCR过程
一生二，二生四，四生万物
PCR 循环 – 第一步 – 加热变性
靶序列
靶序列
PCR 循环- 第二步 – 引物与靶序列退火
PCR 循环 - 第三步 - 引物延伸
历
1983.4 Kary Mullis 在 开 车前去北加利福尼亚红树 县 Redwood country 的 一 条被月光笼罩的山路上构 思了PCR 随后卖给了Roche公司 价格：10,000$ 1993 Nobel prize
史
PCR?
• • • PCR只是一个简单的不起眼玩艺 ——凯利· 穆利斯（Kary Mullis) PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概 念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的 技术，后者又上升成为新的概念。 …
引物 酶 dNTP 模板 Mg2+
引物决定了PCR产物的特异性 引物的设计应遵循一定的原则
DNA Replication PCR
解链方式
引 物
Topoisomerase
RNA primer
Heating
DNA primer
延 伸
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逆转录RT-PCR操作注意事项RT-PCR操作有三步：第一，RNA提纯；第二，RT逆转录；第三，PCR聚合酶反应1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2.RT按要求做，一般不会出太大问题。
3.PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计有3种方法:a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；c：特异的下游引物。
如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？1.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。
但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。
（promega）。
2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5'，3'RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。
3.RACE我做过RACE（3'RACE是宝生物的Kit；5'RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3'RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3'UTR却怎么也扩不出来，我推测是不是该基因的3'UTR太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。
有关内参的几点建议：一定要做内参的，每一次，我想。
不作内参的结果是不可信的。
（1）半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量；（2）以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的；（3）半定量RT-PCR和定量RT-PCR应该在同一个管中进行，内参基因和目的基因表达率相同，长度差不多，GC含量相似。
我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项总结出几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。
因此，我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。
防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
常用的RNA酶抑制剂1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。
它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA 酶失活。
它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。
RNasin 是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
Real-Time PCR实时定量操作注意事项实验中养成的一些好习惯(1) 加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均(2) 移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性(3) 一定要记着关水浴箱，切记切记(4) 多和大家讨论，同时多关注别人讨论的经验，这几乎是最快提高的捷径了(5) 所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因。
一、防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180度的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37度处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
二、常用的RNA酶抑制剂1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。
它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA 酶失活。
它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。
RNasin 是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。
5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
因为DEPC不加选择的修饰蛋白质和RNA，因此在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容。
在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。
而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。
RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。
研究人员造成的污染RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。
因此进行RNA实验时应勤换手套。
DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理（一）动植物总RNA提取-Trizol法Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。
用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。
RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A) 分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。
3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。
4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4度下7500g离心5分钟。
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。
然后将RNA溶于水中，必要时可55度-60度水溶10分钟。
RNA可进行mRNA 分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70度。
总mRNA的提取(自己的经验)一、关于Trizol Reagent需要的试剂1．Chloroform：氯仿(分析纯)2．Isoproplyl alcohol：异丙醇(分析纯)3．75% Ethanol（in DEPC-treated water）:75%乙醇。
要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。
4．RNase-free water：无Rnase的水。
方法是：将DEPC按0.01%（V/V）加在d H2O中500ml（50ul），在37度过夜，并高压灭菌即得（150度3小时）5．一次性塑料手套6．注意：DEPC有致癌之嫌二、关于Trizol Reagent的使用过程：Homogenization（匀浆）a. Tissues：组织每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂，样品体积不能超过Trizol试剂的10%。
b. Cells Grown in monolayer（单层细胞接毒后出现病变的）针对JEV细胞总RNA的抽提法：BHK21细胞长成单层后，接毒0.5-1ml（采用大瓶），37度吸附1h，倒掉，加维持液（含2%的血清和HEPE8的MEM）约5ml，维持天。
出现75%-100%的病变时，以PBS（预冷）冲洗细胞两次，直接在细胞瓶中加入Trizol试剂1ml/10cm2，吹吸几次，以裂解细胞（细胞瓶有两种常用规格：大的约45cm2，小的约30cm2，故所用Trizol试剂分别约为4.5ml和3ml。
Trizol试剂的加入是依细胞瓶而定，以盖满瓶底为度，而不是依据细胞的数量，否则可导致DNA的污染）具体方法如下：（样品一定要新鲜）（1）组织接入预冷的EP管中，加入Trizol试剂1ml/10cm2（量一定要加足，否则易污染），混匀，吹吸几次，以破裂细胞，置室温5min，以使核蛋白复合物彻底分离。
（2）加氯仿0.2ml（每1ml Trizol试剂加入氯仿0.2ml），盖好，剧烈震荡15s，置室温2-3分钟。
（3）4度离心，10000g，15min，离心后，混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。
RNA包含在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%。
（4）仔细吸取上层水相，移至另一EP管中。
（5）加0.5ml异丙醇，以沉淀RNA（每1ml Trizol试剂加入0.5ml异丙醇），置室温10min。
（6）4度离心，10000g，10min。