Westernblot试验技术

2、 按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌 胶时，可用 10ml 枪吸取 5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线 高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时 开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要 沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶 会被冲变型。）
注意事项
? 细胞裂解液的量 ? 超声的频率，时间，次数。插得深不起泡沫。 ? 检测蛋白的敏感性1－5ng,0.75mm厚的SDS－PAGE的一
个孔大约上100ug的总蛋白。 ? 只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可被检测。 ? 未知蛋白应同时作阳性对照。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：
SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水 性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺 基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋 白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位),而蛋白质结合固定 后,由于SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之 蛋白质带电价一致 (charge density),所以决定不同蛋白的泳动速率就 只剩下分子大小一项因素。
? 3、 弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯 2次（每次0.5ml），再用无菌 水洗一次。
? 4、 取一管考马斯亮蓝加95 μl 0.15mol/L NaCl NaCl溶液和5μl待测蛋白 样品，混匀后静置2min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
? 注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗 2次，无菌水洗一次。 可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很 多时间。测得的结果是5 μl样品含的蛋白量。
凝胶成份
? 丙烯酰胺和N,N' -亚甲双丙烯酰胺 ? SDS ? 配胶的Tris缓冲液 ? TEMED（四甲基乙二胺） ? 过硫酸铵(时间) ? Tris-甘氨酸电泳缓冲液
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％） 15 10 7.5 5.0
线性分离范围（ KD) 12-43 16-68 36-94 57-212
常来回摇动。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液 混合）
3、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（ 动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml 离心管中。于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离 心机预冷）（整个操作尽量在冰上进行。）
4、将离心后的上清分装转移并放于－80℃保存。
（2）组织中总蛋白的提取：
1、将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净 的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、加400ull单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中， 进行匀浆。然后置于冰上。
3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组 织尽量碾碎。
4、 裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离 心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分 装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。
Western Blot一般流程
? 蛋白样品的制备 ? SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
?转膜 ?封闭 ?一抗孵育 ?洗膜 ?二抗孵育 ?洗膜 ?底物显色
蛋白样品制备
（1） 单层贴壁细胞蛋白的提取： 1、倒掉培养液，按每培养皿细胞加4ml 4℃预冷的PBS 洗涤三次。 2、每培养皿细胞加入500ul含PMSF，cocktail的裂解液 ，于冰上裂解10min，为使细胞充分裂解培养皿要经
（2） 检测样品蛋白含量
? 1、 取足量的 1.5ml离心管，每管加入 4℃储存的考马斯亮蓝溶液 1ml。 室温放置30min后即可用于测蛋白。
? 2、 取一管考马斯亮蓝加0.15mol/L NaCl溶液100 μl，混匀放置2分钟可 做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测 空白样品。
蛋白浓度的测定--
? 1、 从-20℃取出1mg/ml BSA，室温融化后，备用。 ? 2、 取18个1.5ml 离心管， 3个一组，分别标记为 0μg，2.5μg，5.0μg
，10.0μg ，20.0μg ，40.0μg。 ? 3、 按下表在各管中加入各种试剂。
? 4、 混匀后，室温放置 2min。在生物分光光度计上比色 分析。
（3） 我们实验室常用方法：
1、将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min 。 2、弃上清，加入4ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后
2500rpm离心5min。弃上清后用PBS重复洗涤一次。 3、用枪洗干上清后，加100 ml裂解液（含PMSF）冰上
裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂 解。 4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm 离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－ 20℃保存。
Western blot 实验技术
定义：
?wk.baidu.com印迹法（ blotting ）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应 的探测反应来检测样品的一种方法。
? 1975年，Southern 建立了将 DNA转移到硝酸纤维素膜（ NC膜）上， 并利用DNA－RNA杂交检测特定的 DNA片段的方法，称为 Southern 印迹法。
? 而后人们用类似的方法，对 RNA和蛋白质进行印迹分析，对 RNA 的印迹分析称为 Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印 迹分析称为 Western 印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析 称为 Eastern 印迹法
Western Blot 基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
SDS－PAGE 电泳
? （1） 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦 洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾 干。
? （2） 灌胶与上样
1、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（ 可以用 1% 琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边，五分钟后重 复一次，这样可以保证基本不漏胶）