小麦转基因研究进展

第 2 期 武丽敏 (等) : 小麦转基因研究进展 1 77
定证据的小麦转基因植株 。王永勤等[9 ] 对影响小 麦农杆菌转化的因素作了系统研究 ,为该方法的应 用奠定了基础 。Xia[10 ] 、叶兴国[11 ] 等也分别报道了 利用农杆菌介导法获得转基因小麦植株 ,并经分子 检测和遗传分析证明外源基因能够稳定表达和遗 传 。农杆菌介导法具有操作简单 、成本低 、转化效率 高 、重复性好 、可以导入大片段 DNA ,整合后外源基 因结构变异小 ,且导入基因一般为单拷贝整合 ,所以 很少有基因沉默现象发生 。在小麦农杆菌介导转化 中 ,外植体种类 、农杆菌细胞的浓度 、接种及共培养 时间 、培养基成分 、表面活性剂以及 vir 基因诱导物 等都将影响 T - DNA 的转移效率 。随着该转化体 系的不断深入研究和完善 ,出现了碳化硅纤维[12 ] 、 超声波辅助农杆菌介导法[13 ] ;农杆菌与病毒结合的 “Agroinfection”法 ,该方法由农杆菌介导病毒基因转 移 ,但并不引起病毒在植物基因组中整合 ;还有基于 农杆菌 转 化 机 理 结 合 基 因 枪 法 创 建 的“农 杆 枪 法 (Agrolistic) ”, 它 是 将 virD1 、virD2 基 因 连 同 T DNA 上的目的基因一同用基因枪打入植物细胞中 , 表达的 virD1 、virD2 基因能在植物细胞内切割保守 序列的 DNA ,并将 T - DNA 转入细胞核中[14 ] ,该方 法集中了农杆菌转化方法中精确切割转移和低拷贝 整合等特性及基因枪法中无宿主范围限制的优点 , 是一种很有发展前途的新方法 ,将使农杆菌介导法 在小麦遗传转化上发挥主导作用 。 1. 2 基因枪法
(四川农业大学 小麦研究所 , 四川 都江堰 611830)
摘要 : 综述了自第一株转基因小麦报道以来 ,利用不同的外植体 ,通过基因枪法 、农杆菌介导法 、花粉管通道法等技 术 ,将抗病虫 、抗除草剂 、抗逆以及提高品质的基因转化到小麦中的研究进展 。讨论了基因枪法 、农杆菌介导法和花 粉管通道法在小麦转基因中的应用现状及其存在的主要问题与对策 。 关键词 : 小麦 ; 遗传转化 ; 基因转移技术 中图分类号 : S512. 1 文献标识码 : A 文章编号 : 1000 - 2650 (2003) 02 - 0176 - 06
bar
hpt
-
Gus ,luc ,gfp , Anthocyanin Gus
Gus
-
-
Gus
1 ,15 ,23 , 45 ,53 8～11
47
48
49
12
1. 1 农杆菌介导法 农杆菌 Ti 质粒介导基因转化是一种天然有效
的遗传工程系统 。在农杆菌浸染植物时 ,其 Ti 质粒 (包括 Ri 质粒) 上一段转移 DNA ( T - DNA 区) 插入 到植物基因组中 ,使其携带的目的基因在植物中得 以表达[2 ] 。该方法自 1983 年创建以来 ,在双子叶植 物遗传转化中得到广泛应用 。至于单子叶植物 ,尤 其是禾本科粮食作物 ,被认为不是农杆菌天然寄主 。 随着对农杆菌转化植物细胞的原理进行系统研究 , 发现农杆菌对单子叶植物浸染的不敏感性 ,可能是 因为单子叶植物创伤后 ,在伤口附近往往发生木质 化或硬化 ,而且没有明显的细胞分裂发生 ,内源信号 分子相对不足 ,不能形成足量的诱导 vir 区基因表 达的酚类化合物[3 ] 。但通过添加外源信号物质如 乙酰丁香酮 (AS) 及其衍生物等可以促进农杆菌在 小麦培养细胞上的吸附性 ,从而大大提高遗传转化 效率[4 ,5 ] 。Hess[6 ] 、Mooney[7 ] 等分别对农杆菌介导 转化小麦的可行性进行了研究 ,但未获得转基因植 株 。直到 1997 年 Cheng[8 ] 才利用该方法获得有一
工程的发展。但该方法转化易形成嵌合体 ,一般是多 拷贝整合 ,出现共抑制和基因沉默现象 ,外源基因在 后代中易丢失 ,转化效率较低 (011 %～215 %) ,转化 成本很高 ,限制了基因枪法的普遍应用。 1. 3 花粉管通道法
花粉管通道法是 80 年代初期 ,由我国学者周光 宇根据植物远缘杂交理论提出的 ,是在授粉后向子 房注射含目的基因的 DNA 溶液 ,利用植物开花 、受 精过程形成的花粉管通道 ,将外源 DNA 导入受精 的卵细胞 ,并进一步被整合到受体细胞的基因组中 , 随受精卵的发育而成为转基因新个体 。其最大优点 是不依赖组织培养 ,人工再生植株 ,技术简单 ,不需 装备精良的实验室 ,常规育种工作者易于掌握。 1993 年阎新莆等[16 ]将抗白粉病的二棱大麦总 DNA 通过花粉管通道法直接导入小麦感病品种花 76 ,获 得 5 个稳定的抗白粉病株系 。曾君祉[17 ] 也报道了 花粉管通道法转基因小麦的获得 ,并对转基因植株 后代进行了性状表达分析和分子生物学鉴定 ,证明 通过花粉管通道法能够获得可以稳定遗传的转基因 小麦 。成卓敏等[18 ] 获得大麦黄矮病毒 CP 基因转 化的小麦 ;黄承彦等[19 ] 获得抗旱耐盐小麦新品种 。 郭宝太等[20 ]将 Gus 和 Tsc 基因通过该方法导入到 小麦栽培品种 ,经过 PCR 检测证明该外源基因已经 成功导入 。最近牟红梅等[21 ] 将慈菇蛋白酶抑制剂 基因 、吴茂森等[22 ] 将 B YDV - GPV 株系缺失复制 酶基因成功转入小麦 ,说明花粉管通道法在小麦遗 传转化中的应用是完全可行的 。但花粉管通道法易 受环境条件影响 ,重复性差 ,经验性强 ,转基因植株 后代情况复杂 ,转化效率低 (一般在 1 %以下) [1 ] 。 1. 4 其他直接转化法
表 1 小麦遗传转化系统
转化方法 外植体
选择基因 报告基因 参考文献
基因枪
幼胚、盾片、愈伤 组织、花药、花序
农杆菌 幼胚
P E G
幼胚分离的原 生质体
电穿孔 幼胚
脂质转染
幼胚分离的原 生质体
硅化纤维素 幼胚
bar , npt Ⅱ, hpt ,pmi bar ,npt Ⅱ npt Ⅱ
1 78 四川农业大学学报 第 21 卷
品 种
表 2 小麦遗传转化的目的基因及功能
基因产物
表 型
Bobwhite , RH770019 , Fielder , Paton ,Combi , Turbo , Hanno ,Naxo
Bobwhite
L188 - 6 ,L188 - 31
Bobwhite Bobwhite ,京 411 京 411 ,京 841 扬麦 158 ,扬麦 10 号 辽 10 ,东农 7742
Jinghong # 5
Bobwhite
Golin ,greina 豫麦 18 号
-
PA T (bar)
EPSPS ( CP4 ) 1Ax1 ,1Dx5 1Ax1 Snowdrop lectin Cp TI W YMV - Nib8 Chitinase Vst Ⅰ RIP Killing protein TA29 - Barnase BAD H
小麦转基因技术的发展和应用解决了远缘杂交 的诸多不利因素 ,使有益的外源基因能够导入小麦 , 如改善品质 、抗除草剂 、抗病虫 、抗逆性等 (见表 2) , 实现了常规育种无法实现的遗传重组 。 2. 1 抗除草剂小麦的遗传转化
在小麦的转基因研究中 ,使用最广泛的是具有
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第 21 卷 第 2 期 2003 年 6 月
Journal
of
四川农业大学学报 Sichuan Agricultural
U niversity
Vol. 21 No. 2 J un. 2003
·综 述·
小麦转基因研究进展 Ξ
武丽敏 , 郑有良 , 魏育明 , 吴 卫 , 颜泽洪 , 张志清
1 小麦转基因技术的研究现状
1992 年第一株转基因小麦的报道 ,是小麦转基 因研究的里程碑[1 ] 。此后许多学者利用不同方法 将不同目的基因导入小麦 ,获得转基因植株 。小麦 转基因技术大体分为两类 :一是农杆菌介导的转化 ; 二是目标 DNA 直接转化 ,包括基因枪法 、花粉管通 道法 、显微注射法 、激光微束穿刺法 、PEG 介导和电 击穿孔法等 ,其中应用较广泛的是基因枪和花粉管 通道法 (表 1) 。
Ξ收稿日期 : 2002 - 12 - 23 基金项目 : 国家科技部基础研究快速反应支持项目 。
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采用远缘杂交技术将小麦野生近缘物种中的有 益外源基因导入小麦栽培品种 ,对其抗性 、品质 、产 量的提高发挥了重要作用 。但由于双亲亲缘关系较 远造成杂交不结实 、杂种不育 、杂种后代长期分离 、 预见性差 ,使该技术在小麦遗传改良上的应用受到 一定限制 。植物转基因技术被证明是进行外源基因 定向转移独特而有力的手段 ,一定程度上补充或改 进了传统的育种方法 。通过植物遗传转化技术 ,可 以按照需要 ,将有遗传信息的 DNA 片段即目的基 因进行人工重组 ,在离体条件下转入宿主细胞进行 复制 、表达 ,定向改造植物 ,可以打破基因流的界限 , 而且大大缩短育种周期 。小麦是举世公认的最难转 化的重要农作物之一 ,且转基因研究起步较晚 ,经过 许多学者十几年的不懈努力 ,取得了长足的进展。在 提高小麦抗病虫 、抗逆性 、改善品质和雄性不育利用 等方面展示出良好的应用前景 。本文概述了小麦转 基因研究常用遗传转化技术及其在小麦遗传改良中 的应用 ,讨论了存在的主要问题及采取的应对措施。
DNA 直接转化法还有显微注射法 、PEG 介导 法等 。尽管都有成功的报道 ,但转化效率都很低 。 同时转化受体材料都是原பைடு நூலகம்质体 ,对基因型依赖性 很大 ,而且理想状态原生质体受体和再生植株的获 得很困难 ,这可能是以原生质体或单细胞为受体的 小麦转基因和获得再生植株很困难的主要原因 。
2 遗传转化技术在小麦育种上的应用
基因枪法又称粒子轰击技术 ( Particle bombard2 ment) ,它是借助高速运动的金属微粒使附着于其表 面的核酸分子穿过受体的细胞壁 ,释放出的 DNA 分子随机整合到植物基因组中 ,然后通过细胞和组 织培养技术 ,再生出植株[2 ] 。基因枪法不受受体基 因型的限制 ,而且可以用于转化的受体材料也十分 广泛 ,如悬浮细胞系 、胚性愈伤组织 、未成熟胚 、盾 片 、成熟胚和花粉粒等都获得成功 ,因此成为小麦转 基因的主要应用技术 。Vasil 等[1 ] 采用基因枪转化 法 ,将 Gus 和 bar 基因转化到小麦中首次获得转基 因植株 。随后 ,人们采用基因枪法将具有耐除草剂 、 抗病 、抗虫 、优质 、人工雄性不育及报告基因等转入 到小 麦 , 获 得 一 批 转 基 因 植 株 ( 表 1 ) 。1994 年 Nehra[15]以分离的盾片组织作为转化受体 ,易于形成 胚性愈伤组织 ,加速体细胞胚的发生 ,在较短时间内 就可以形成完整的小植株 ,而且这种切除胚芽的盾片 具有较大的基因独立性 ,转化效率较高。基因枪转化 法大大推动了小麦遗传转化的研究 ,促进了小麦基因
除 草 剂
品 质 抗 虫
抗病
雄性不育 抗逆性
抗膦丝菌素 (Basta)
抗草甘膦 增加面团弹性 提高高分子谷蛋白的质量和数量 1Ax1 抗蚜虫 36 鳞翅目 、鞘翅目 抗黄矮病 抗白粉病 ,赤霉病 抗白粉病 抗真菌病 抗黑穗病 核雄性不育 抗旱
参考文献
1 ,15