小鼠胚胎心肌细胞的分离及电生理特性
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Department of Physiology, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
Abstract: To explore the electrophysiological characteristics of embryonic cardiomyocytes, single embryonic cardiomyocytes were obtained from mice at different periods by a collegenase B digestion approach, whole cell patch clamp recording technique was used to record If and ICa-L, and spontaneous action potential was also recorded. The morphological and spontaneous contractile properties of the isolated cells appeared to be typical embryonic cardiomyocytes when the cells were assessed by phase-contrast microscope. Whole cell recording of isolated cells is easily performed by the whole cell patch clamp technique. Elelctrophysiolgical properties of If and Ica-L from embryonic cardiomyocytes have been proved to be similar to those from adult pacemaker cells or cardiomyocytes. The established method of isolation is simple, stable, effective and reliable. It allows to obtain as early as 8.5-day embryonic myocytes. The electrophysiological recording of embryonic cardiomyocytes will provide a useful model for exploring the electrophysiological characteristics of embryonic cardiomyocytes and the possible mechanism underlying some heart diseases.
Key words: embryo; cardiomyocyte; mice; isolation
近年来的研究发现, 肥大及衰竭心脏的基因表达 和信号转导模式与胚胎心脏的情形极为相似[1, 2], 或者 说是其幼稚状态的反演。If 主要分布在自律性心肌细 胞上, 但是已有研究发现, 幼稚心脏(处于胚胎期和新 生期)的心室肌细胞上也有If通道的表达, 这些结论来
自对鸡胚和新生大鼠心室肌细胞的研究报告[3,4]。心 肌肥大会使胚胎时期出现过的基Baidu Nhomakorabea重新表达[5], 所以 在胚胎心脏上曾经存在的电流可能会在病理情况下重 新表现, 从而导致某些心脏病的发生, 事实上, 在自发 性高血压大鼠和人体衰竭心脏的心室肌细胞上都记录
Received 2003-11-25 Accepted 2004-02-18 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30070279). *Corresponding author. Tel: +86-27-83692622; Fax: +86-27-83692608; E-mail: tangming49@hotmail.com
(Collagenase B: 1 mg/ml, Roche Molecular Biochemicals, Mannheimm, Germany; CaCl2 10 mmol/L, 3 µl/ml)酶解, 温度 37℃, 时间 35~37 min。用 KB (mmol/L)液 (KCl 85、K2HPO4 30、MgSO4 5、EGTA 1、Na2ATP 2、 pyruvate 5、kreati 5、taurine 20、glucose 20)终止消 化并震荡 30 min 后, 将分离下来的单个心肌细胞(5 × 105~1 × 106 个 /ml) 2~3 滴滴入预先放有盖玻片(预铺 明胶)的培养皿中, 加含有 20% 胎牛血清的 DMEM 培 养基(Gibco 公司), 置于 37℃, 5% CO2 培养箱中培养。 18~24 h 后, 选用跳动的心肌细胞进行膜片钳实验。
关键词: 胚胎; 心肌细胞; 小鼠; 分离 中图分类号: Q463; R329
Isolation and electrophysiological characteristics of embryonic cardiomyocytes in mice
LUO Hong-Yan, TANG Ming*, HU Xin-Wu, SONG Ming-Ke, LIANG Hua-Min, DU Yi-Mei, ZHANG Yi
玻璃毛细管(南京六合县泉水教学实验仪器厂)经 两步法拉制, 冲灌电极内液后阻抗为 2~5 MΩ。记 录 If 电极内液成分(mmol/L): NaCl 10、potassium aspartate 130、Na2ATP 2、EGTA 1、MgCl2 2、Na2GTP 0.1、HEPES 10, pH 7.2 (adjusted with KOH)。记录 ICa-L 电极内液成分(mmol/L): CsCl 115、HEPES 10、 EGTA 10、Tea-Cl 20、MgATP 5、Tris-GTP 0.1、 phosphocreatine 10、CaCl2 1, pH 7.2 (adjusted with CsOH)。膜电容(Cm)由 ISO2 程序自动测出, 数据存 盘, 实验后用 ISO2 和 Sigma Plot 6.0 软件分析。
骆生红理艳学等报: 小Ac鼠ta胚Ph胎ys心iol肌og细ica胞S的ini分ca离, O及cto电be生r 2理5,特20性04, 56 (5): 651-655
651
http://www.actaps.com.cn
实验技术
小鼠胚胎心肌细胞的分离及电生理特性
骆红艳, 唐 明*, 胡新武, 宋明柯, 梁华敏, 杜以梅, 张 毅
1.4 数据分析 电流强度的测定: 在激活过程中电流刚 出现时与电流最大激活时之间的差值。电流密度的 测定: 电流强度与膜电容的比值(pA/pF)。数据以mean ± SE 的形式表示。
2 结果
2.1 细胞的形状和状态 采用上述方法分离获得的单个胚胎心肌细胞的形
态, 早期胚胎心肌细胞多呈圆形, 细胞显得较厚实; 晚 期胚胎心肌细胞多类似卵圆形, 细胞核清晰, 细胞膜 边界清楚, 细胞有节律性的自发跳动, 记录电流时,选
择跳动的细胞做膜片钳实验。图 1 为 16.5 d 的单个 胚胎心肌细胞。
2.2 胚胎心肌细胞的 If 电生理特性 图 2A 中，左图是 If 通道稳态激活曲线的原始
华中科技大学同济医学院生理系, 武汉 430030
摘 要: 本文旨在探索小鼠胚胎心肌细胞的分离方法并观察其电生理特性。应用胶原酶 B 消化法获得不同时期单个小鼠胚胎 心肌细胞; 利用全细胞膜片钳技术, 记录胚胎心肌细胞的超极化激活的非选择性内向阳离子电流(If)和 L- 钙电流( ICa-L ), 并用电流 钳记录其自发性动作电位。胚胎心肌细胞通过相差显微镜依据其形态和自发性收缩进行鉴定。本法分离所获得的胚胎心肌 细胞容易进行全细胞膜片钳记录, 可用于记录 If、ICa-L 电流和自发性动作电位, 已证实胚胎心肌细胞 If 和 ICa-L 的电生理特性与 成年起搏细胞或心肌细胞相似。本实验建立的分离方法简单、稳定、有效、可靠, 最早可获得 8.5 d 的胚胎心肌细胞。胚 胎心肌细胞的电生理记录为探索胚胎心肌细胞的电生理特性提供了一个可用的模型, 并可能为某些心脏疾病产生的机制提供实 验依据。
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生理学报 Acta Physiologica Sinica, October 25, 2004, 56(5): 651-655
到了 If [1, 2]。肥大和衰竭心脏的心室肌细胞重新表达 If, 可能与心律失常的发生有关。故研究胚胎心肌细 胞有利于研究心脏的病理生理学现象, 阐明某些心脏 病的病理生理机制, 对于临床心脏病的防治有重要的 参考价值。过去研究胚胎心肌细胞的离子通道特性 多应用鸡胚胎心肌细胞[3], 而分离最早期的小鼠胚胎 心肌细胞一般为 10.5 d[6], 11.5 d[7], 原因主要是早期胚 胎心脏细小, 我室对其分离方法进行了改良, 采用胶 原酶B消化的方法可获得8.5 d的胚胎心肌细胞, 对研 究极早期的胚胎心肌细胞的电生理特点有重要意义。
1.2 胚胎心肌细胞的分离及培养(无菌条件下操 作) 将所需胎龄的孕鼠取出, 以颈椎脱臼法处死后, 剪开腹腔, 取出胚胎, 置于冰 PBS (mmol/L)溶液(NaCl
120, KCl 5.4, MgSO4 5, Na-Pyruvat 5, taurine 20, HEPES 10, glucose 20)中。去掉胎膜及胎盘, 用尖镊子将心 脏取出放入另一盛有冷 PBS培养皿中, 置于体视显微 镜下, 分离出心房和心室(在 10.5 d 之前, 心房尚未发 育) 。把心房和心室剪碎分别置于酶解液中
(mmol/L): CdCl2 0.5、BaCl2 1、4-aminopyridine 2, 以 排除 ICa、IK1 和 Ito 的干扰。记录 ICa-L 电流时台氏液 中加入 50 µmol/L 的 TTX 阻断 INa 电流。
在记录生物电信号时, 采用传统的全细胞膜片钳 记录技术[9], 选择有自发性收缩活动的细胞。记录 If 的钳制电压为 -35 mV, 持续 200 ms, 测试电压为 -110 mV, 持续 2 500 ms。记录 ICa-L 的钳制电压为 -40 mV, 持续 100 ms, 测试电压为 0 mV, 持续 300 ms。用电 流钳模式记录动作电位。信号采集频率为 10 Hz, 滤 波频率为 2 kHz。所用设备为 Axopatch 200-A(Axon Instruments, CA, USA), 用 ISO2 程序(MFK, Frankfurt, FRG)驱动。
1.3 电生理研究 细胞置于倒置显微镜(Zeiss,Germany) 上的恒温灌流槽中, 温度控制在37℃, 先用标准台氏 液灌流(mmol/L): NaCl 140、NaOH 2.3、KCl 5.4、CaCl2 1.8、MgCl21、HEPES 10、glucose 10, pH 7.4 (adjusted with NaOH)。记录 If 电流时台氏液中加入以下物质
1 材料与方法
1.1 胚胎的获得及胎龄的确定 第 1 d 上午给成年的 雌性小鼠腹腔注射孕马血清(PMSG) 10 U, 48 h后再腹 腔注射 HCG 10 U; 当日晚上, 雌雄鼠合笼; 第 2 d 上午 将雌雄鼠分笼饲养, 如雌鼠受孕, 则记为 0.5 d。胚胎 发育的第 13.5 d 前为胚胎心脏发育的早期, 13.5~16.5 d为胚胎心脏发育中期, 16.5 d及其后为胚胎心脏发育 晚期。
Abstract: To explore the electrophysiological characteristics of embryonic cardiomyocytes, single embryonic cardiomyocytes were obtained from mice at different periods by a collegenase B digestion approach, whole cell patch clamp recording technique was used to record If and ICa-L, and spontaneous action potential was also recorded. The morphological and spontaneous contractile properties of the isolated cells appeared to be typical embryonic cardiomyocytes when the cells were assessed by phase-contrast microscope. Whole cell recording of isolated cells is easily performed by the whole cell patch clamp technique. Elelctrophysiolgical properties of If and Ica-L from embryonic cardiomyocytes have been proved to be similar to those from adult pacemaker cells or cardiomyocytes. The established method of isolation is simple, stable, effective and reliable. It allows to obtain as early as 8.5-day embryonic myocytes. The electrophysiological recording of embryonic cardiomyocytes will provide a useful model for exploring the electrophysiological characteristics of embryonic cardiomyocytes and the possible mechanism underlying some heart diseases.
Key words: embryo; cardiomyocyte; mice; isolation
近年来的研究发现, 肥大及衰竭心脏的基因表达 和信号转导模式与胚胎心脏的情形极为相似[1, 2], 或者 说是其幼稚状态的反演。If 主要分布在自律性心肌细 胞上, 但是已有研究发现, 幼稚心脏(处于胚胎期和新 生期)的心室肌细胞上也有If通道的表达, 这些结论来
自对鸡胚和新生大鼠心室肌细胞的研究报告[3,4]。心 肌肥大会使胚胎时期出现过的基Baidu Nhomakorabea重新表达[5], 所以 在胚胎心脏上曾经存在的电流可能会在病理情况下重 新表现, 从而导致某些心脏病的发生, 事实上, 在自发 性高血压大鼠和人体衰竭心脏的心室肌细胞上都记录
Received 2003-11-25 Accepted 2004-02-18 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.30070279). *Corresponding author. Tel: +86-27-83692622; Fax: +86-27-83692608; E-mail: tangming49@hotmail.com
(Collagenase B: 1 mg/ml, Roche Molecular Biochemicals, Mannheimm, Germany; CaCl2 10 mmol/L, 3 µl/ml)酶解, 温度 37℃, 时间 35~37 min。用 KB (mmol/L)液 (KCl 85、K2HPO4 30、MgSO4 5、EGTA 1、Na2ATP 2、 pyruvate 5、kreati 5、taurine 20、glucose 20)终止消 化并震荡 30 min 后, 将分离下来的单个心肌细胞(5 × 105~1 × 106 个 /ml) 2~3 滴滴入预先放有盖玻片(预铺 明胶)的培养皿中, 加含有 20% 胎牛血清的 DMEM 培 养基(Gibco 公司), 置于 37℃, 5% CO2 培养箱中培养。 18~24 h 后, 选用跳动的心肌细胞进行膜片钳实验。
关键词: 胚胎; 心肌细胞; 小鼠; 分离 中图分类号: Q463; R329
Isolation and electrophysiological characteristics of embryonic cardiomyocytes in mice
LUO Hong-Yan, TANG Ming*, HU Xin-Wu, SONG Ming-Ke, LIANG Hua-Min, DU Yi-Mei, ZHANG Yi
玻璃毛细管(南京六合县泉水教学实验仪器厂)经 两步法拉制, 冲灌电极内液后阻抗为 2~5 MΩ。记 录 If 电极内液成分(mmol/L): NaCl 10、potassium aspartate 130、Na2ATP 2、EGTA 1、MgCl2 2、Na2GTP 0.1、HEPES 10, pH 7.2 (adjusted with KOH)。记录 ICa-L 电极内液成分(mmol/L): CsCl 115、HEPES 10、 EGTA 10、Tea-Cl 20、MgATP 5、Tris-GTP 0.1、 phosphocreatine 10、CaCl2 1, pH 7.2 (adjusted with CsOH)。膜电容(Cm)由 ISO2 程序自动测出, 数据存 盘, 实验后用 ISO2 和 Sigma Plot 6.0 软件分析。
骆生红理艳学等报: 小Ac鼠ta胚Ph胎ys心iol肌og细ica胞S的ini分ca离, O及cto电be生r 2理5,特20性04, 56 (5): 651-655
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http://www.actaps.com.cn
实验技术
小鼠胚胎心肌细胞的分离及电生理特性
骆红艳, 唐 明*, 胡新武, 宋明柯, 梁华敏, 杜以梅, 张 毅
1.4 数据分析 电流强度的测定: 在激活过程中电流刚 出现时与电流最大激活时之间的差值。电流密度的 测定: 电流强度与膜电容的比值(pA/pF)。数据以mean ± SE 的形式表示。
2 结果
2.1 细胞的形状和状态 采用上述方法分离获得的单个胚胎心肌细胞的形
态, 早期胚胎心肌细胞多呈圆形, 细胞显得较厚实; 晚 期胚胎心肌细胞多类似卵圆形, 细胞核清晰, 细胞膜 边界清楚, 细胞有节律性的自发跳动, 记录电流时,选
择跳动的细胞做膜片钳实验。图 1 为 16.5 d 的单个 胚胎心肌细胞。
2.2 胚胎心肌细胞的 If 电生理特性 图 2A 中，左图是 If 通道稳态激活曲线的原始
华中科技大学同济医学院生理系, 武汉 430030
摘 要: 本文旨在探索小鼠胚胎心肌细胞的分离方法并观察其电生理特性。应用胶原酶 B 消化法获得不同时期单个小鼠胚胎 心肌细胞; 利用全细胞膜片钳技术, 记录胚胎心肌细胞的超极化激活的非选择性内向阳离子电流(If)和 L- 钙电流( ICa-L ), 并用电流 钳记录其自发性动作电位。胚胎心肌细胞通过相差显微镜依据其形态和自发性收缩进行鉴定。本法分离所获得的胚胎心肌 细胞容易进行全细胞膜片钳记录, 可用于记录 If、ICa-L 电流和自发性动作电位, 已证实胚胎心肌细胞 If 和 ICa-L 的电生理特性与 成年起搏细胞或心肌细胞相似。本实验建立的分离方法简单、稳定、有效、可靠, 最早可获得 8.5 d 的胚胎心肌细胞。胚 胎心肌细胞的电生理记录为探索胚胎心肌细胞的电生理特性提供了一个可用的模型, 并可能为某些心脏疾病产生的机制提供实 验依据。
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生理学报 Acta Physiologica Sinica, October 25, 2004, 56(5): 651-655
到了 If [1, 2]。肥大和衰竭心脏的心室肌细胞重新表达 If, 可能与心律失常的发生有关。故研究胚胎心肌细 胞有利于研究心脏的病理生理学现象, 阐明某些心脏 病的病理生理机制, 对于临床心脏病的防治有重要的 参考价值。过去研究胚胎心肌细胞的离子通道特性 多应用鸡胚胎心肌细胞[3], 而分离最早期的小鼠胚胎 心肌细胞一般为 10.5 d[6], 11.5 d[7], 原因主要是早期胚 胎心脏细小, 我室对其分离方法进行了改良, 采用胶 原酶B消化的方法可获得8.5 d的胚胎心肌细胞, 对研 究极早期的胚胎心肌细胞的电生理特点有重要意义。
1.2 胚胎心肌细胞的分离及培养(无菌条件下操 作) 将所需胎龄的孕鼠取出, 以颈椎脱臼法处死后, 剪开腹腔, 取出胚胎, 置于冰 PBS (mmol/L)溶液(NaCl
120, KCl 5.4, MgSO4 5, Na-Pyruvat 5, taurine 20, HEPES 10, glucose 20)中。去掉胎膜及胎盘, 用尖镊子将心 脏取出放入另一盛有冷 PBS培养皿中, 置于体视显微 镜下, 分离出心房和心室(在 10.5 d 之前, 心房尚未发 育) 。把心房和心室剪碎分别置于酶解液中
(mmol/L): CdCl2 0.5、BaCl2 1、4-aminopyridine 2, 以 排除 ICa、IK1 和 Ito 的干扰。记录 ICa-L 电流时台氏液 中加入 50 µmol/L 的 TTX 阻断 INa 电流。
在记录生物电信号时, 采用传统的全细胞膜片钳 记录技术[9], 选择有自发性收缩活动的细胞。记录 If 的钳制电压为 -35 mV, 持续 200 ms, 测试电压为 -110 mV, 持续 2 500 ms。记录 ICa-L 的钳制电压为 -40 mV, 持续 100 ms, 测试电压为 0 mV, 持续 300 ms。用电 流钳模式记录动作电位。信号采集频率为 10 Hz, 滤 波频率为 2 kHz。所用设备为 Axopatch 200-A(Axon Instruments, CA, USA), 用 ISO2 程序(MFK, Frankfurt, FRG)驱动。
1.3 电生理研究 细胞置于倒置显微镜(Zeiss,Germany) 上的恒温灌流槽中, 温度控制在37℃, 先用标准台氏 液灌流(mmol/L): NaCl 140、NaOH 2.3、KCl 5.4、CaCl2 1.8、MgCl21、HEPES 10、glucose 10, pH 7.4 (adjusted with NaOH)。记录 If 电流时台氏液中加入以下物质
1 材料与方法
1.1 胚胎的获得及胎龄的确定 第 1 d 上午给成年的 雌性小鼠腹腔注射孕马血清(PMSG) 10 U, 48 h后再腹 腔注射 HCG 10 U; 当日晚上, 雌雄鼠合笼; 第 2 d 上午 将雌雄鼠分笼饲养, 如雌鼠受孕, 则记为 0.5 d。胚胎 发育的第 13.5 d 前为胚胎心脏发育的早期, 13.5~16.5 d为胚胎心脏发育中期, 16.5 d及其后为胚胎心脏发育 晚期。