临床微生物学检验之药敏

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临床微生物学检验

一、纸片扩散法

又称Kirby-Bauer(K-B)法，由于其在抗菌药物的选择上具有灵活性，且花费低廉，被WHO 推荐为定性药敏试验的基本方法，已在临床广泛使用。

（一）实验原理

将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。

（二）培养基和抗菌药物纸片

1、抗菌药物纸片选择直径为6.35mm，吸水量为20µl的专用药敏纸片，用逐片加样或

侵泡方法使每片含药量达规定所示。含药纸片密封贮存2~8℃或-20℃无霜冷冻箱内保存，β-内酰胺类药敏纸片应冷冻贮存，且不超过一周。使用前将贮存容器移至室温平衡1~2小时，避免开启贮存容器时产生冷凝水。

2、培养基水解酪蛋白（Mueller-Hinton,M-H）培养基是CLSI采用的兼性厌氧菌和需氧

菌药敏试验标准培养基，pH为7.2~7.4，对那些营养要求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌等需加入补充物质。琼脂厚度为4mm。配置琼脂平板当天使用或置塑料密封袋中4℃保存，使用前应将平板置35℃温箱孵育15分钟，使其表面干燥。（三）实验方法

实验菌株和标准菌株接种采用直接菌落法或细菌液体生长法、用0.5麦氏比浊管标准的菌液浓度，校正浓度后的菌液应在15分钟内接种完毕。操作步骤如下：

1、接种用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂抹

接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板內缘涂抹一周。

2、贴抗菌药物纸片平板置室温下干燥3~5分钟，用纸片分配器或无菌镊子将含药纸片紧

贴于琼脂表面，各纸片中心相距》24mm，纸片距平板內缘》15mm，纸片贴上后不可再移动，因为抗菌药物会自动扩散到培养基内。

3、孵育置35℃孵育箱16~18小时后阅读结果，对苯唑西林和万古霉素敏感等应孵育24

小时。

（四）结果判断和报告

用游标卡尺或直尺量取抑菌圈直径（抑菌圈的边缘应是无明显细菌生长的区域），先量取质控菌株的抑菌环直径，以判断质控是否合格；然后量取试验菌株的抑菌环直径。根据CLSI 标准，对量取的抑菌圈直径作出“敏感”、“耐药”、“中介”的判断。

（五）质量控制

对于肠杆菌科细菌，M-H琼脂，生长法或直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准的细菌浓度，35℃+-2℃，空气，16~18小时观察结果，质控菌株推荐为大肠埃希菌A TCC25922，大肠埃希菌ATCC35218（为监控β-内酰胺酶/β-内酰胺抑制剂纸片用）；对于铜绿假单胞菌ATCC35218；对于葡萄球菌属细菌，16~18小时观察结果，测苯唑西林、甲氧西林、萘夫西林和万古霉素需24小时，试验温度超过35℃不能检测甲氧西林耐药葡萄球菌，推荐质控菌株为金黄色葡萄球菌A TCC25923，大肠埃希菌ATCC35218，纸片扩散法检测葡萄球菌对万古霉素的敏感性不可靠；对于肠球菌属细菌，16~18小时观察结果，测万古霉素需24小时，推荐质控菌株为粪肠球菌ATCC29212;对于流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌，推荐质控菌株为流感嗜血杆菌A TCC49247，流感嗜血杆菌ATCC49766，大肠埃希菌A TCC35218（测试阿莫西林/克拉维酸时）；对于肺炎链球菌和肺炎链球菌之外其他链球菌，培养基为M-H琼脂+5%羊血，35℃+-2℃，5%CO2,20~24小时观察结果，推荐质控菌株为肺炎链球菌ATCC49619.

二、稀释法

（一）肉汤稀释法

1、培养基使用M-H肉汤，需氧菌、兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在该培养液中

加入补充成分可支持流感嗜血杆菌、链球菌生长。培养基制备完毕后应校正pH为

7.2~7.4（25℃）。离子校正的M-H肉汤（cation-adjusted Mueller-Hinton broth，CAMHB）

为目前推荐的药敏试验培养基。

2、药物稀释药物原液的制备和稀释遵照CLSI的指南进行。

3、菌种接种配制0.5麦氏浓度菌液，用肉汤（宏量稀释法）、蒸馏水或生理盐水（微量

稀释法）稀释菌液，使最终菌液浓度（每管或每孔）为5x105CFU/ml，稀释菌液于15分钟内接种完毕，35℃孵育16~20小时，当试验菌为嗜血杆菌属、链球菌属孵育时间为20~24小时，葡萄球菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏试验应孵育时间为24小时。

4、结果判断以在试管内或小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度

（minimal inhibitory concentration，MIC）(µg/ml)。微量稀释法时，常借助于比浊计判别是否细菌生长。有时根据需要测定最低杀菌浓度（minimal bactericidal concentration,MBC）;把无菌生长的试管（微孔）吸取0.1ml加到冷却至50℃M-H琼脂混合倾注平板，同时以前述的稀释1:1000（或1:200）的原接种液作倾注平板，培养48~72小时后计数菌落数，即可得到抗菌药物的最小杀菌浓度。

5、质量控制对于常见需氧菌和兼性厌氧菌，M-H琼脂，孵育时间、环境、质控菌株同

纸片扩散法。

（二）琼脂稀释法

琼脂选择法是将药物混匀于琼脂培养基中，配制含不同浓度药物平板，使用多点接种器接种细菌，经孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得MIC。

1、培养基M-H琼脂为一般细菌药敏试验的最佳培养基，调整pH在7.2~7.4，pH的过高

或过低会影响药物效能。

2、含药琼脂制备将已稀释的抗菌药物按1:9加入在45~50℃水浴中平衡融化M-H琼脂

中，充分混合倾入平皿，琼脂厚度为3~4mm。室温凝固后的平皿装入密封塑料袋中，置2~8℃，贮存日期为5天，对易降解药物如头孢克洛，在使用48小时之内制备平板，使用前在室温中平衡，放于温箱中30分钟使琼脂表面干燥。

3、细菌接种将0.5麦氏比浊度菌液稀释10倍，以多点接种器吸取（约为1~2µl）接种于

琼脂表面，稀释的菌液于15分钟内接种完毕，使平皿接种菌量为1 x104CFU/点。接种后置35 ℃孵育16~20小时，特殊药需要24小时。奈瑟菌属、链球菌属细菌置于5%CO2，幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。

4、结果判断将平板置于暗色、无反光表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的药物稀释

度为终点浓度。

药敏试验的结果报告可用MIC（µg/ml）或对照CLSI标准用敏感（S）、中介（I）和耐药（R）报告。有时对于稀释法的批量试验，需要报告MIC50、MIC90.MIC50是指抑制50%试验菌的最低药物浓度，MIC90是指抑制90%试验菌株的最低药物浓度，例如被测大肠埃希菌100株，抗菌药物为头孢哌酮，在8µg/ml时可抑制90株大肠埃希菌生长，此时头孢哌酮对大肠埃希菌的MIC90是8µg/ml。

三、E-test

E-test法（epsilometer test）是一种结合稀释法和扩散法原理对抗菌药物药敏试验直接定量的药敏试验技术。

1.原理E试条是一种5mmx50mm的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的，浓度