临床微生物学与检验

4.用镊子将E-TEST试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表 4.用镊子将E TEST试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表 面，有刻度的一面向外，直径140mm的平板可放置 面，有刻度的一面向外，直径140mm的平板可放置 6条，9mm平板只能放置1～2试条 。 条，9mm平板只能放置1 5.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。 5.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。
第四章 抗菌药物的敏感性试验
徐元宏
常用方法：
纸片扩散法 微量液体稀释法 E-TEST法 TEST法
原理：
纸片扩散法（Kirby纸片扩散法（KirbyBauer法 Bauer法）
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测 试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼 脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减 的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试 菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈 即为抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏 感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。 感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
5.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终 5.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终 浓度10 CFU/ml。 浓度105 CFU/ml。
6.用微量加样器接种100μl 6.用微量加样器接种100μl 到96孔中，盖上盖板。 96孔中，盖上盖板。 同时作阳性、阴性对照。
6.根据选择的菌株挑选相应的抗菌纸片。 6.根据选择的菌株挑选相应的抗菌纸片。
肠杆菌科：氨苄西林、阿米卡星、哌拉西林/ 肠杆菌科：氨苄西林、阿米卡星、哌拉西林/ 他唑巴坦、头孢噻肟、环丙沙星、亚胺培 南、氨曲南、庆大霉素； 铜绿假单胞菌：头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林、 阿米卡星、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺培南； 阿米卡星、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺培南； 葡萄球菌属：头孢西丁、青霉素、红霉素、万古霉 素、环丙沙星、庆大霉素、利福平 ；
肠球菌属：青霉素 、万古霉素 、甲氧苄啶/磺胺异 、甲氧苄啶/ 噁唑 、庆大霉素、环丙沙星、红霉素、氨苄西林 不动杆菌属：头孢他啶 、亚胺培南、阿米卡星、哌拉 西林/ 西林/他唑巴坦、头孢吡肟 、头孢曲松 、环丙沙 星、米诺环素； 洋葱伯克霍德菌：头孢他啶 、米诺环素、甲氧苄啶/磺 、米诺环素、甲氧苄啶/ 胺异噁唑 、美罗培南 ；
嗜麦芽窄食单胞菌：甲氧苄啶/ 嗜麦芽窄食单胞菌：甲氧苄啶/磺胺异噁唑、左氧氟沙 星、米诺环素 ； 嗜血杆菌属：氨苄西林、甲氧苄啶/磺胺异噁唑、头孢 嗜血杆菌属：氨苄西林、甲氧苄啶/ 他啶、美罗培南、阿奇霉素、环丙沙星、头孢克洛； 淋病奈瑟菌：头孢曲松、环丙沙星、青霉素、大观霉素、 四环素 ； 肺炎链球菌：红霉素 、苯唑西林 、甲氧苄啶/磺胺异噁唑、 、甲氧苄啶/ 克林霉素、左氧氟沙星、四环素、万古霉素 ； 除肺炎链球菌外的其他链球菌：红霉素、青霉素、克 林霉素、万古霉素、头孢曲松、左氧氟沙星。
4.用无菌棉签浸入细菌悬 4.用无菌棉签浸入细菌悬 液中，将拭子在试管上壁 轻轻挤压以挤去过多的菌 液。棉签在三个方向均匀 抹琼脂表面（每次转60℃ 抹琼脂表面（每次转60℃） 使菌液均匀分布，最后沿 平板内缘涂抹一周。
5.盖上平板的盖子，放置培养箱内孵育，放置3~10分钟 5.盖上平板的盖子，放置培养箱内孵育，放置3~10分钟 后贴上标准抗生素纸片。
微量液体稀释法 (microdilution test)
原理：
聚乙烯板内含有各种稀释度的抗菌药物，实验时 加入100μl浓度为10 CFU/ml的菌液，盖上盖板，35℃ 加入100μl浓度为105 CFU/ml的菌液，盖上盖板，35℃ 16～20h观察结果。孔底部清晰不出现细菌沉淀的最低 16～20h观察结果。孔底部清晰不出现细菌沉淀的最低 抗菌药物浓度即为该抗菌药物对细菌的最小抑菌浓度， 通过CLSI标准判断其敏感和耐药。再取0.01ml容量接种 通过CLSI标准判断其敏感和耐药。再取0.01ml容量接种 环取肉眼观察无菌生长的液体接种于血琼脂平板作次代 培养，经35℃过夜培养后观察最低抗菌药物浓度能杀死 培养，经35℃过夜培养后观察最低抗菌药物浓度能杀死 99.9％原始种入的细菌即为该菌的最低杀菌浓度(MBC)。 99.9％原始种入的细菌即为该菌的最低杀菌浓度(MBC)。
6.孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交 6.孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交 处的刻度即为抗菌药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC) 处的刻度即为抗菌药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC) 。
操作方法：1.抗菌药物的稀释和融解
2.抗菌药物母液的稀释
3.在微量聚乙烯微板孔中加入各种不同浓度的抗生素 3.在微量聚乙烯微板孔中加入各种不同浓度的抗生素 100μl，从低浓度往高浓度加样，不需要更换吸管。 100μl，从低浓度往高浓度加样，不需要更换吸管。
4.挑选18~24小时的菌落置M-H肉汤增菌4~6小时。 4.挑选18~24小时的菌落置M 肉汤增菌4
操作方法 ：
1.将在约56℃恒温的无菌M-H琼脂倾注直径为90mm 1.将在约56℃恒温的无菌M 琼脂倾注直径为90mm 的平板，其厚度 4mm。 4mm。
2.无菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5个菌落。 2.无菌挑取孵育16～24h的血平板上4
3.置于无菌生理盐水中，校正其浊度于McFarland 3.置于无菌生理盐水中，校正其浊度于McFarland No 0.5管。 0.5管。
7.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂 用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M 的表面，于15mm。 心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。
8.经过35℃16～24h孵育。 8.经过35℃16～24h孵育。 9.取抑菌环直径，根据 9.取抑菌环直径，根据 CLSI（ CLSI（clinical and laboratory standards institute ）标准，报 告细菌对该抗生素 敏感(susceptible,S)、 敏感(susceptible,S)、 耐药(resistant,R)、 耐药(resistant,R)、 中介(intermediate,I)。 中介(intermediate,I)。
7.手工看浊度或仪器自动 7.手工看浊度或仪器自动 判读。按照CLSI标准报 判读。按照CLSI标准报 告细菌对某抗菌药物为 敏感、耐药和中介。
E-TEST
原理：
E试条是一条5mm×50mm无孔试剂载体，一面 试条是一条5mm×50mm无孔试剂载体，一面 固定有一系列预先制备的浓度呈连续指数增长稀释抗 菌药物，另一面有读数和判别的刻度。抗菌药物的梯 度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围。将E 度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围。将E 试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围 绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点 的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度， 对照CLSI标准判断其敏感、耐药、中介。 对照CLSI标准判断其敏感、耐药、中介。
操作方法：
1.挑取16～20h的菌落 1.挑取16～20h的菌落 2.用无菌生理盐水制备成0.5麦氏比浊管浊度的菌液。 2.用无菌生理盐水制备成0.5麦氏比浊管浊度的菌液。
3.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻 3.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻 轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向平均涂抹 琼脂表面（每次转60℃ 琼脂表面（每次转60℃）使菌液均匀分布，最后沿平 板内缘涂抹一周。