土壤微生物群落多样性研究方法及进展_1

第27卷增刊V ol 127,Sup 1广西农业生物科学Journal o f Guangx i A g ric 1and Biol 1Science 2008年6月June,2008收稿日期:20080122。

基金项目:广西大学博士启动基金项目(X05119)。

作者简介:姚晓华(广西大学副教授,博士;E -mail:x hy ao@g xu 1edu 1cn 。

文章编号:10083464(2008)增008405土壤微生物群落多样性研究方法及进展姚晓华(广西大学农学院,广西南宁530005)摘要:微生物多样性是指群落中的微生物种群类型和数量、种的丰度和均度以及种的分布情况。

研究土壤微生物群落多样性的方法包括传统的以生化技术为基础的方法(直接平板计数、单碳源利用模式等)和以现代分子生物技术为基础的方法(从土壤中提取DN A ,进行G+C%含量的分析,或杂交分析,或进行PCR,产物再进行D GGE/T GG E 等分析)。

现代生物技术与传统微生物研究方法的结合使用,为更全面地理解土壤微生物群落的多样性和生态功能提供了良好的前景。

关键词:微生物多样性;生化技术;分子生物学技术;DN A中图分类号:.Q 938115 文献标识码:AAdvancement of methods in studying soil microbial diversityYAO Xiao -hua(Co llege of Ag ricultur e,G uangx i U niv ersit y,N anning 530005,China)Abstract:Species div ersity consist o f species richness,the total number of species,species ev enness,and the distribution of species 1Methods to measure microbial diversity in so il can be categ orized into tw o g roups:biochemica-l based techniques and m olecular -based techniques 1The fo rmer techniques include plate counts,sole carbon so urce utilizatio n patterns,fatty acid methy l ester analysis,and et al 1The latter techniques include G +C%,DNA reassociation,DNA -DNA hy br idization,DGGE/TGGC,and et al 1Ov er all,the best w ay to study soil microbial diversity w o uld be to use a variety of tests w ith differ ent endpoints and degr ees o f r esolutio n to o btain the bro adest picture possible and the most inform ation r eg ar ding the microbial co mmunity 1Key words:microbial diversity;biochem ica-l based techniques,mo lecular -based techniques,DNA微生物多样性研究是微生物生态学最重要的研究内容之一。

微生物在土壤中普遍存在,对环境条件的变化反应敏捷,它能较早地预测土壤养分及环境质量的变化过程,被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一[1]。

但土壤微生物的种类庞大,使得有关微生物区系的分析工作十分耗时费力。

因此,微生物群落结构的研究主要通过微生物生态学的方法来完成,即通过描述微生物群落的稳定性、微生物群落生态学机理以及自然或人为干扰对群落产生的影响,揭示土壤质量与微生物数量和活性之间的关系。

利用分子生物学技术和研究策略,揭示自然界各种环境中(尤其是极端环境)微生物多样性的真实水平及其物种组成,是微生物生态学各项研究的基础和核心,是重新认识复杂的微生物世界的开端。

1 土壤微生物群落多样性的概念土壤微生物群落多样性,是指土壤微生物群落的种类和种间差异,微生物群落多样性包括物种多样性、遗传多样性及生理功能多样性等。

物种多样性是群落中的微生物种群类型和数量,其中丰度和均度是多样性指数中的两个组成部分,也是多样性分析中最直观、最容易理解的要素。

与高等生物相比,不同种群间的遗传物质和基因表达具有很大的差异,因此,微生物多样性在分子水平尤为突出。

微生物有多种多样的代谢方式和生理功能,可以适应各种生态环境,并以不同生活方式与其他生物相互作用,这就表现出功能上的多样性。

起初研究的重点在物种多样性和遗传多样性,随着各项技术的发展和研究角度的拓宽,功能多样性越来越受到重视。

遗传多样性是物种多样性的基础,但又与物种多样性有区别,它揭示了不同类型的外界压力在物种演替过程中的遗传轨迹,除了微生物自身的遗传改变以外,环境影响及生态上的相互作用,也导致了功能的多样性。

2 土壤微生物群落结构的研究方法典型的多样性研究是指在梯度压力或者其他生物、非生物因素影响下,种群的相对多样性。

我们无法保证目前方法的精确性,所以利用现有技术很难研究真正的多样性。

研究者试图把所搜集的信息降低为离散的、用数字表示的度量形式,比如多样性指数。

目前研究土壤微生物多样性的方法可以分为两类:生化技术方法和分子生物学方法。

211 以生化技术为基础的研究微生物多样性的方法21111 平板计数和形态学分析 传统的方法是利用选择性的平板来分离培养微生物,使用显微镜观察所分离的微生物,通过形态特征来确定微生物的种类,直接评估多样性。

此方法快速、廉价,可以提供活的、异养类型的种群信息,特别是在水环境样品中,确实可以鉴定出许多种类。

随着显微技术的不断提高,一些含有特殊荧光的微生物可以通过荧光显微镜来鉴定。

如产甲烷微生物含F420辅助因子,在420nm 波长激发下产生绿色荧光,而鉴定含光合色素的微生物,如果与流式细胞仪结合使用,则可以对检测到的信息进行定量。

To rsv ik 等[2]利用DAPI (4,6-二胺基-2-苯基吲哚)染色,在荧光显微镜下观察到1g 土壤中有412@1010个细胞,利用平板计数最多只能培养出412@106个菌落。

据估计,每克土壤中有上千个不同的种,大约100亿个微生物,但由于培养基和培养条件的限制,目前通过实验室人工培养方法已经被分离、描述的微生物种类和数量仅占估计数量的1%~5%,而其余95%~99%微生物种群仍然未被分离[3]。

一些种类形态相似,仅凭显微镜无法准确判断,而有些微生物种类的形态特征相同,但是模式种已发生变异,故单凭形态学分析已不能把它们分开。

因此,采用培养和形态鉴别的方法用于微生物多样性的研究,不可避免地会低估了多样性的丰富度。

21112 群落水平单碳源利用模式(CLPP) Garland 等[4]首次利用96孔微量板,通过单一碳源利用能力(SCSU)来评价细菌群落的功能多样性。

目前该方法已经广泛应用于评价污染物对微生物群落及其代谢功能影响的研究中。

国内杨永华等[5]用CLPP 方法对农药污染土壤中的微生物群落进行了研究,测定结果显示,污染土壤的Shannon 指数和均度、Simpson 指数、M cIntosh 指数和均度均明显低于无污染的土壤。

这表明,农药污染导致了土壤中微生物代谢功能多样性的下降,同时也导致了微生物种类的减少。

由于这种方法只选择了在试验条件下可培养的、快速生长的微生物,所以从严格意义上来说,只反应了潜在的而不是原位的代谢多样性[4]。

例如,一个并不活跃或者只代表了原位群落中小部分的集团,可以在Biolo gy 孔中处于竞争优势,这就使我们错估了这些集团在原位群落中的地位。

此外,Biolo gy 孔中所包括的碳源并不能完全代表土壤中的碳源。

因此,仅利用Biolog y 信息得到的关于微生物多样性的结论受到很多人的置疑。

然而,毫无疑问的是,如果这种方法和其他方法联合起来研究微生物多样性,将是非常有用的工具。

21113 脂肪酸甲酯(FAME)/磷脂脂肪酸甲酯法(PLFA)分析法 生物不仅在形态上有区别,更重要的是在结构上也明显不同。

采用生物标记分子作为鉴定微生物种群的决定因子,可减少使用显微85增刊 姚晓华等:土壤微生物群落多样性研究方法及进展86广西农业生物科学第27卷镜等形态观察方法带来的人为误差,同时也给定量研究种群开辟了新的方法。

脂肪酸甲酯分析法就是基于此基础之上,且不依赖微生物培养技术,并提供了微生物种群中脂肪酸组成信息的一种分析法。

脂肪酸是细胞中相对稳定的组成成分。

微生物不同,脂质成分也不同。

每种微生物都有一种可以识别的脂质模式,是类群结构的信号。

因此,脂肪酸图谱的改变就代表着微生物种群的改变。

FA ME法已经广泛应用到化学物质污染和农业生产活动引起的微生物种群组成和结构改变的研究中。

尽管FAME分析方法可以用来研究微生物多样性,但是仍然具有不可避免的局限性。

如果用真菌的孢子来研究真菌潜在的多样性,需要大约130~150个孢子[6],这样就检测不到种群中数量少的种类。

细胞脂肪酸组成受到诸多因素的影响,比如温度、营养,而其他生物也可以形成FAM E图谱。

此外,很难将磷脂脂肪酸模式与微生物特殊的动力学联系起来,同时检测中所需要的仪器设备比较昂贵。

212以分子技术为基础的研究微生物多样性的方法目前许多以分子技术为基础的方法应用到微生物多样性的研究中。

分子生物学方法使许多悬而未决的问题得到解决,从遗传水平上说明了群落结构的完整性。

这些方法包括:DNA复性、DNA-DNA、DNA-RNA杂交、DNA克隆和测序,以及其他以PCR为基础的方法,诸如DGGE,TGGE, RISA,ARISA等。

21211G+C%含量微生物中G+C%含量是不同的。

不同类群的G+C%含量差别在3%~5%,因此,可以用G+C%含量来研究土壤细菌的多样性。

此方法的优点在于不受RCR偏差的影响。

不足之处在于分类上不同的类群也可以有相同的G+C%含量,而且需要大量的DNA。

Nusslein等[7]利用G+C%含量分析、ARDRA丰富度图谱和rDNA测序分析法,分析了夏威夷森林土壤、牧场的植被层中微生物多样性的变化。

这三种方法都检测到了微生物种群的变化,揭示了植被对微生物群落组成有强烈的影响。