CNBr-4B活化填料使用说明书(译文)

CNBr活化柱说明书

溴化氰活化琼脂糖™-4B是一种预活化并固定配体来结合氨基的介质。它提供了一个非常方便的固定溴化氰配体的方法。这个偶联反应是自发的、快速和容易实现的。它的应用领域涵盖了固定化蛋白质、多肽和核酸等。

注：线性流速=体积流速（L/h）/ 层析柱横截面积（cm2）

这里所给出的范围是基于我们的立论知识和经验估计的。请注意以下几点：

pH值稳定、长期保存的pH值区间指的是凝胶在很长一段时间内可以保持稳定，没有在其随后的层析分离时出现不利的影响。pH值稳定、短期保存的pH值区间是相对于再生、在线清洗和维护程序来说的。

准备阶段

溴化氰活化琼脂糖™-4 B是以添加剂的形式冻干处理得到的。这些添加剂在填料螯合所需的配体前必须在低pH（pH 2 – 3）条件下进行清洗。活化后的活性基团也应该使用低pH 值（pH值2 – 3）保存，而在高pH值则会出现降解。

称取所需量的冻干粉(1 g冻干粉可获得3.5ml终体积的介质)，使用1mM HCl悬浮。介质会立刻膨胀，再用1mM HCl在玻璃过滤器中进行清洗15min。每克冻干粉添加约200ml 1mM 的HCl溶胀，实际按几等分的量来添加。

螯合配体

常规的配体螯合过程

1.在螯合前，使用0.1 M NaHCO3、0.5 M NaCl pH 8.3的螯合缓冲液来溶解配体，每克冻干粉使用5ml螯合缓冲液溶解。一般，每毫升的填料介质可以结合5-10mg的蛋白配体。对于较小的配体，一般每毫升填料介质添加1-10μM的配体。

2.称出所需量的溴化氰活化琼脂糖-4B填料。如上所述，用1mM HCl来溶胀和清洗冻干粉。

3. 在一个密封的容器里，将溶解的配体与待螯合的介质混合。在室温下反复旋转混合约1 h或在4℃下过夜混合，其他温和的搅拌方法也可以使用的。

4.使用至少5倍填料体积的螯合缓冲液来洗去多余的配体。

5.排除任何剩余的活性配体，将填料转移到0.1M Tris-HCl缓冲液pH 8.0或1M 乙醇胺，pH值8.0溶液中，保持2h。

6.每个循环均要使用包括0.1M 醋酸盐缓冲液，0.5M NaCl pH4.0以及0.1M Tris-HCl，0.5M NaCl，pH8.0的缓冲液来清洗，交替用两种pH缓冲液清洗填料至少三个循环，每次至少用5倍填料体积的缓冲液来清洗。

影响螯合的因素

pH

偶联反应最有大效率是pH值在8 – 10的范围内，此时配体上的氨基主要是以非质子化的形式存在。pH值在8.3的缓冲体系最常用于结合蛋白。

螯合反应在低pH值下效率较是很低的，但是也可能是有效的，比如说当采用多点附着稳定固定的时候，配体生物活性有所损失，或是在大量的高分子配体固定化时，结合位点之间出现位阻，此时pH在6.0的缓冲液则是适合配体的螯合。

螯合用缓冲液

螯合过程应该在碳酸氢盐或硼酸盐缓冲液中完成。Tris和其他包含氨基的缓冲盐液不应使用，因为这些氨基将会结合到凝胶上。

配体可能需要有机溶剂来溶解，可以使用终浓度在50%的二甲基甲酰胺和二恶烷，而在螯合缓冲液也应使用相同浓度的有机溶剂。由于有机溶剂通常处于较低pH值，在溶解配体后需要调整pH值。

盐离子

在螯合缓冲液中，为减少蛋白质吸附和蛋白质聚集的形成，建议高盐环境，如含0.5 M NaCl的缓冲液。

温度

螯合过程在室温下一般需要2h来完成，20~25℃。如果需要在冷库内完成，则是需要过夜螯合。

配体浓度

非常高的配体浓度会对亲和层析带来不利的影响。首先，由于结合位点之间的位阻会出现，吸附剂的结合效率可能会减少。其次，物质更强烈地结合到固定化的配体上，这可能导致难以被洗脱。第三，在高配体浓度下，非特异性结合的程度会增加。

对于一个高效的吸附剂，推荐每毫升介质螯合1~10μM配体。对蛋白质配体来说，推荐每毫升介质螯合5 – 10mg蛋白质。

控制螯合效率

对于结构不稳定的配体，有时可能需要减少螯合组分的数量来保护结合位点的结构，或是用来避免在高密度螯合时出现不易洗脱的情况，再或是为减少大分子配体在螯合过程中的空间位阻效应。

在结合之前，控制活性介质的水解可降低结合活性，或是在一个较低的pH下进行螯合。预水解可以降低具有结合能力活性基团的数量，也可以减少蛋白质与基质间结合位点的数量，以及降低结合蛋白的数量，用这种方法可以得到更高活性的胶。在pH为3.0的条件下，螯合过程较为缓慢，而在pH值8.3时活性降低的也是相当的快。在pH8.3条件下，经过4h 的预水解后的活性位点减少到介质没有降低前数量的一半。

排除剩余的活性配体

结合之后，基质中残留的一些活性组分应该进行灭活，活性组分可在一个弱碱性条件下被水解（在室温下2h或在4℃下16h）。

另外，这些残留配体也可以通过添加少量的伯胺类物质（例如Tris-HCl、乙醇胺、甘氨酸），大约在pH 8.0（在室温下2h或在4℃下16 h）加以去除。

这些阻滞剂会引入一小部分带电的基团到介质之中，这些带电介质对亲和层析的影响会被后续的缓冲液中较高浓度的盐（0.5M NaCl）所抵消。

吸附剂的清洗

为了在螯合结束后去除多余的未螯合的配体，填料需要在高pH或低pH下冲洗至少三次。比较合适的是选择0.1M 醋酸盐缓冲液，0.5M NaCl pH4.0和螯合缓冲液，pH8.3的缓冲液交替来清洗。这一步确保了没有游离的配体残留而不可预料的结合到固定的配体上。

洗脱方式

pH洗脱pH的变化会改变结合位点组分的电离度，pH降低通常会影响洗脱过程，基质、

配体以及结合物质的化学稳定性决定洗脱所采用的pH值范围。

离子强度采用多线或者梯度的洗脱的方式时，需要增加缓冲液的离子强度。梯度增加洗脱液中的盐离子浓度，可以对结合到吸附剂上的不同物质进行分离。酶类的洗脱时盐离子浓度通常在1M或者更低的浓度。如果结合物质与吸附剂高度亲和，就需要适当提高盐离子浓度。

竞争洗脱竞争洗脱通常是从吸附剂上选择性洗脱结合物质，也可以在亲和力较低时洗脱特异性吸附物质，而选择性保留下来的物质在低浓度洗脱液中才能被置换出来，一般浓度低于10mM，采用线性洗脱或是梯度洗脱都可以。

降低极性如果洗脱物质不能被固定，可以在洗脱液中添加二氧己环（10%）或是乙烯（50%）来降低洗脱液的极性，从而促进洗脱的进行。

变性洗脱如果上述洗脱方式不是很好的洗脱，可适当添加一些变性剂，如盐酸胍胡、离液序列较高的盐或是尿素来改变蛋白质的结构，从而促进洗脱的进行。

再生与保存

再生亲和填料再生时使用0.1M Tris-HCl，0.5M NaCl，pH8.5与0.1M 醋酸盐缓冲液，0.5M NaCl pH4.5交替清洗，清洗三个循环后，使用结合缓冲液进行再生，待下一次的使用。

保存溴化氰填料干粉一般保存在2-8℃，溶胀后需要添加抑菌剂后再在2-8℃下保存，一般抑菌剂选择NaN3.