现代生化药学课后题答案

第一章PCR1 PCR的英文全称是什么? Polymerase Chain Reaction2 PCR是谁发明的？Kary Mullis3 PCR的基本原理是什么？PCR的基本工作原理是以拟扩增的DNA片段为模板，以一对分别与模板DNA互补的寡核苷酸为引物，在DNA聚合酶的作用下，根据半保留复制的机制沿着模板DNA链延伸，直至新的DNA合成。

不断重复这一过程，则可使目的DNA片段得到扩增。

4 PCR反应的产物中一般会生成几种长度不同的产物？反应结束时他们的含量分别是怎样的？PCR反应中一般会产生2种不同长度的产物：一种是预期长度的产物，一种是比预期长度长得多的产物；前者以指数级数增加（2n），后者以几何级数增加（2n）。

因此后者在总产物中所占比重很小，可忽略不计。

5 一般PCR反应中包括几种基本成份？它们的功能分别是什么？7种基本成分:模板,特异性引物,热稳定DNA聚合酶,脱氧核苷三磷酸(dNTP),二价阳离子,缓冲液及一价阳离子,石蜡油(可忽略)模板：待扩增的DNA或RNA,甚至细胞；引物：与靶DNA的3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。

只有每条引物都与靶DNA特异性结合，才能保证其特异性，引物越长，特异性越高。

两段引物间的距离决定了扩增片断的长度；两引物的5’端决定了扩增产物的5’端位置。

说明引物决定了扩增片断的长度、位置和结果。

DNA聚合酶：a.聚合作用，将dNTP中脱氧单核苷酸逐个加到3’-OH末端,b.3’-5’外切酶活性，校正功能,c.5’-3’外切酶活性，切除错配核苷酸；石蜡油：维持恒热和整个体系中盐浓度，减少PCR过程中尤其是变性时液体蒸发所造成的产物的丢失。

6 PCR反应对模板有什么要求（种类及质量要求等）？基因组DNA、噬菌体DNA、质粒DNA、cDNA、mRNA、预先扩增的DNA均可作为模板。

PCR反应对模板纯度要求不是很高，经过标准分子生物学方法制备的样品即可以作为模板；但是模板中绝对不能含有蛋白酶、核酸酶、Taq酶抑制剂和任何可以结合DNA的蛋白；虽然片段长短不是影响PCR效率的关键因素，短片段模板PCR效率更高；为保证反应的特异性，应使用ng级的克隆DNA、μg级的单拷贝染色体DNA、或104拷贝的待扩增片段。

7 什么叫PCR的引物？什么叫特异性引物？什么叫简并性引物？引物：所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的5’末端位置。

(引物要大大过量)特异性引物：引物是与靶DNA的3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。

只有当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列复性形成稳定的结构，才能保证其特异性。

简并性引物：简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。

为了增加特异性,可以参考密码子使用表,根据不同生物的碱基使用偏好,减少简并性。

8 引物设计的基本原则有哪些？a.引物长度一般在20～24bp(≥16,≤30)：这样长度的引物保证了不易形成杂合体；b.（G+C）%含量：两段引物的此数值应相近；在已知模板序列时应与模板的相近。

40%-60%c.引物本身不能形成明显的次级结构，如发卡结构；d.两引物间不可发生互补(特别是3’端，若不可避免那3’端互补碱基不可超过2个碱基)；e.引物3’端配对：引物3’端为DNA聚合酶连上寡核苷酸的地方，因此该端5-6个碱基与DNA的配对必须严格、准确。

9 PCR中使用的DNA聚合酶有哪几种，各具有哪些特点？a.Klenow片段：为DNA聚合酶Ⅰ的片段，有聚合酶活性和3’~5’外切酶活性(最适37℃)；b.Taq酶：耐热DNA聚合酶，可耐受93～95摄氏度(最适74-75℃)，是PCR普及的关键。

它避免了不断补加DNA聚合酶的繁琐操作，提高了退火和延伸的温度，减少了非特异性产物和DNA二级结构对PCR 的干扰，提高了PCR的特异性、敏感度和产量。

它没有3’~5’外切酶活性，无校对功能，点突变较多。

依赖Mg2+。

c.Stoffel片段：第二代耐热DNA聚合酶，去除Taq酶的5’~3’外切酶活性，将97.5摄氏度的半衰期提高到20min，而Taq酶只有5min；对复合PCR（2个或以上模板位点的PCR）更有效；d.Vent TM DNA多聚酶：耐受100摄氏度以上高温达2h；具有校对功能(3’~5’外切酶活性)。

e.RTth 逆转录酶：有依赖于RNA的耐热DNA聚合酶活性和依赖于DNA的耐热DNA聚合酶活性，这两种活性分别依赖于Mn2+和Mg2+。

10PCR反应中对于加入的dNTP有什么要求？1）dNTP应具有一定浓度：50-200μmol/L, 不得低于10-15。

浓度过高会抑制Taq酶活性，较低浓度可降低错误掺入；高浓度dNTPs易产生错误掺入，而浓度过低会导致产量过低；2）标准PCR中包含四种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，否则会诱导聚合酶错误掺入而降低产率、提前终止反应；3)不能反复冻融，否则会降解。

11 PCR反应中加入的二价阳离子有什么功能？常用的是什么离子？缓冲液中二价阳离子的存在至关重要，因为耐热DNA聚合酶需要游离的二价阳离子作为辅助离子，它影响着PCR的产量和特异性。

常用Mn2+和Mg2+, Ca2+无效。

(引物与dNTP都有二价阳离子结合)12 PCR反应一般分为几个步骤？各步骤有什么特点？A变性：双链DNA变成单链DNA。

变性温度的高低由G+C含量决定；变性时间由DNA链长度决定。

常B 退火，将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；退火是使引物和模板DNA复性。

复性过程采取的温度（Ta）至关重要。

复性温度过高，引物不能与模板很好地复性，扩增效率很低；复性温度太低，引物将产生非特异性复性，导致非特异性的DNA片段的扩增。

退火温度通常在比理论计算的引物和模板的熔解温度低3～5℃的条件下进行。

C 延伸：寡核苷酸引物的延长，一般在耐热DNA聚合酶的最适温度下进行。

对于Taq酶，为72～78度。

D 循环数：PCR扩增所需的循环数取决于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的效率。

一般扩展条件：94℃60s→37℃60s→72℃120s，共25-30个循环13 什么叫PCR的反应平台？形成的原因可能是什么？PCR反应不是无穷的进行，到了PCR后期，当产物达0.3～1pmol/L时，由于产物的堆积，使原来以指数增长的速率变成平坦的曲线。

形成原因：由于引物和dNTP的减少，Taq酶失活；或由于底物过剩、非特异性产物的竞争、变性时解链不完全、退火时产物单链自己缔合、最终产物的阻化作用。

14 提高PCR反应的特异性一般可以使用哪几种方法？A 引物设计：引物长度、碱基配对是否严格、GC%含量、退火温度、引物浓度与纯度、稳定性、是否为简并性引物等；B 使用热启动：在变性完成之后再加入DNA聚合酶(或聚合酶才有活性)，这样可以提高特异性，因为DNA 聚合酶在低温时也有活性，可能引起非特异的扩增。

C 镁离子浓度：不同的模板和引物有不同的镁离子浓度，应进行预实验进行探索；较高的镁离子浓度会提高产量，同时降低特异性；dNTP浓度较高时应适当提高镁离子浓度。

E 促进PCR的添加剂：降低DNA熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区，可提高特异性和产率；F 使用巢式PCR：降低扩增多个靶位点的可能性，提高特异性15 常用的促进PCR特异性的试剂有哪些？甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱，PCRx Enhancer Solution。

16 什么是热启动？在模板DNA完全变性后再加入DNA聚合酶（或使DNA聚合酶有活性）的方法，可减少低温下DNA聚合酶活性造成的非特异性扩增。

17 RACE的全称是什么？Rapid Amplification of cDNA Ends（cDNA末端的快速扩增）18 什么叫定量PCR？利用PCR反应来测定样品中的DNA或RNA的原始拷贝数量。

利用每个循环都能同步侦测到PCR产物的19 为什么PCR中对产物进行终点检定量不准确？(PCR扩增曲线为S型曲线)随着PCR的进行，反应体系中的引物、dNTP，甚至模板都会供不应求，导致PCR的效率下降，产物增长速度越来越慢。

直到Taq酶都被饱和后，反应就进入平台期。

在实际实验中，由于各种环境因素的复杂相互影响，每个反应进入平台期的时间及平台期的高低都不同，导致终产物浓度各不相同。

即使是重复实验，也不可能做到同时进入平台期。

因此反应终产物与原始拷贝数无线性关系，定量不准确。

20 什么是定量PCR的Ct值？Ct值是如何确定的?Cycle threshold（Ct）：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，即在PCR中，荧光信号开始由本底进入指数增长的拐点处所对应的循环数。

Ct值的含义是：PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。

确定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省没置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

实验操作中，Ct值定义为极限上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发射所对应的PCR循环次数。

“基线上方”也就是阈值高度的量化，定义是基线范围内荧光信号强度标准偏差的10倍。

阈值所在的横线与PCR扩增曲线的交点所指的PCR循环次数就是Ct值。

Ct值越小，模板DNA的起始拷贝数越多；Ct值越大，反之。

正常：18～30。

Ct值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于试验质量。

21 简述Taqman探针技术的原理。

Taqman探针法是高度特异性的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的5’→3’外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号，由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。

在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。

探针只与模板特异性的结合，其结合位点在两条引物之间。

探针的5’端标记有报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，当探针完整的时候，报告基因所发出的荧光能量被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。

随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’→3’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不被吸收，即产生荧光信号。

所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。

信号强度就代表了模板DNA的拷贝数。

根据其3，端标记的荧光猝灭基团的不同分为：普通的Taqman探针和TaqmanMGB探针22 解释下列各种PCR的基本原理：(1) RT-PCR （Reverse Translation-PCR）(获得基因完整编码区序列)RT-PCR是一种从细胞mRNA中高效灵敏地扩增cDNA序列的方法。