一 caspase家族蛋白酶的组成
Caspase与细胞凋亡
Caspase与细胞凋亡Caspase与细胞凋亡沈阳市第一人民医院神经内科（110041）李莉摘要：细胞凋亡，又称程序性细胞死亡（Programmed cell death, PCD）是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡过程。
是细胞内由基因编码调控的按严格程序执行的细胞自杀过程。
细胞凋亡是细胞生长发育过程的重要生命现象，是目前生物医学领域中的一个重要研究课题。
阐明细胞凋亡的分子机制可对一些疾病的防治（如肿瘤，神经退行性疾病等）产生积极影响。
许多实验提示细胞凋亡涉及一个瀑布式（Cascade）基因表达过程。
半胱氨酸蛋白酶（Caspase）在细胞凋亡中发挥始动和效应作用。
本文就其生物学特性及其在凋亡中的作用机制作一综述。
关键词：Caspase；细胞凋亡细胞凋亡的原词Apoptosis由两个拉丁字组成。
Apo指离开，ptosis是落下，意思是细胞凋亡有如秋天落叶，到一定时候即失去生命力，遂即脱落，细胞凋亡，又称程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD）是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡过程，是细胞内由基因编码调控的，按严格程序执行的细胞自杀过程。
通常需要30到60分钟，细胞凋亡形态学上的变化主要有DNA破碎，染色质凝集，细胞皱缩，线粒体肿胀和凋亡小体形成，而整个过程的结束以凋亡小体被吞噬为标志。
多数类型细胞在凋亡的最后阶段发生细胞核DNA的降解：DNA降解成180-200bp或其倍数的片段，因此在琼脂糖凝胶电泳上可见到有特征性的梯形图谱。
目前对凋亡的研究深入到分子水平，发现多种半胱氨酸蛋白酶（Cysteine aspartase）在细胞凋亡之中发挥着重要作用。
1、什么是Caspase通过对美丽线虫（nematode caenorhabditis elegans）的细胞死亡机制的研究发现，至少有3个基因直接参与了细胞凋亡的调节。
ced-3、ced-4直接介导细胞死亡，为促凋亡基因，其编码的蛋白分别为CED-3、CED-4、ced-3在细胞中起关键作用，称为线虫自杀基因，CED-3则称为死亡蛋白酶；ced-9则拮抗其作用，为抗凋亡基因，其编码的蛋白质为CED-9。
《caspase蛋白》课件
深入了解Caspase蛋白的结构和功能，探索其在细胞凋亡和疾病中的重要作用。
概述
什么是Caspase蛋白？
Caspase蛋白是一类关键的囊泡内蛋白酶，参与细胞凋亡和炎症反应等生物学过程。
Caspase蛋白的功能
Caspase蛋白在细胞的正常生理过程和疾病发展中发挥关键作用，如信号传导和废弃机制。
多种转录因子可以调控Caspase基因的表
翻译后调控
2
达，影响Caspase蛋白的产生。
Caspase的翻译后修饰，如磷酸化和乙酰
化，可以调控其活性和稳定性。
3
活性调控
通过蛋白激酶、抑制剂和结合蛋白的调 控，控制Caspase的活性和水平。
Caspase的信号通路
1
Hale Waihona Puke Caspase-8信号通路
Caspase-8通常参与由死受体复合体(DRC)激活的细胞凋亡信号通路。
2
Caspase-9信号通路
Caspase-9是线粒体介导的细胞凋亡信号通路中的关键成分。
Caspase在细胞凋亡中的作用
1 Caspase在凋亡信号通路中的地位
Caspase蛋白在细胞凋亡信号通路中起到重要的调节和执行作用。
2 Caspase的活化与废弃作用
Caspase蛋白的活化和废弃作用是细胞凋亡的关键步骤。
Caspase的分类
根据结构分
• 主要分为Caspase-1家族和Caspase-3家族。 • 每个家族包含多个亚型，具有不同的底物特
异性。
根据功能分
• 活化Caspase：负责激活其他Caspase蛋白。 • 废弃Caspase：负责降解细胞内的关键蛋白，
触发细胞死亡。
caspase家族
细胞色素c
Caspase-8酶原 活化的 Caspase-8 CARD Caspase-9酶原 活化的 Caspase-3 活化的 Caspase-9 Apaf-1
Caspase-3酶原
凋亡复合体
切割底物，产生效应
细胞凋亡的膜受体通路
FASL+FAS +FADD
凋亡诱导复合物（DISC） 胞质中游离的caspase8聚集到这个复合物上 细胞有足够caspase8 死亡受体活化， 细胞凋亡 细胞caspase8浓度不够 切割Bid tBid从胞质到线粒体 CtyC 释放
未活化的caspase 酶原Y
原结构域
活化的caspaseX
较多活化的caspaseY
大量活化的caspaseZ
切割细胞质蛋白
切割细胞核蛋白
外源途径 内源途径 其他刺 激因素
Fas DD FADD
Fas DD + DD DED
Fas
Fas DD DED DISC切的Bid
2002年诺贝尔医学及生理学奖
凋亡起始者 Caspase 9、8、2、10、11
同性活化——切割自身前体
凋亡执行者 Caspase 3、6、7
异性活化——切割结构蛋白、功能蛋白
Caspase级联效应
NH2 活化的 caspase X
大亚基
切割位点
小亚基 切割活化 COOH 活化的 caspase Y
Caspase 家族
及其在细胞凋亡中的作用
Caspase （天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶）
是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白
酶，它们的活性位点均包含Cys残基，能够特异 性的切割靶蛋白Asp残基后的肽键。Caspase能 选择性的切割某些蛋白质，从而造成细胞凋亡。
caspase-1介导的细胞焦亡与炎症反应
03
Caspase-1还能促进细胞因子的产生和分泌，如IL-1β
和IL-18，这些因子在炎症反应中发挥重要作用。
caspase-1与炎症性疾病的关系
01
Caspase-1与多种炎症性疾病 的发生和发展密切相关。
02
研究表明，caspase-1的激活 和细胞焦亡过程在类风湿性关 节炎、克罗恩病和动脉粥样硬 化等疾病中发挥重要作用。
caspase-1在细胞内的定位与分布
细胞质
Caspase-1主要分布在细胞质中，与细胞质中的其他蛋白相互作用，参与细胞凋亡和炎 症反应等过程。
细胞核
Caspase-1也可以进入细胞核，与核内的DNA和蛋白质相互作用，影响基因表达和 DNA修复等过程。
03
caspase-1介导的细胞焦亡
细胞焦亡的定义与特征
01
进一步研究caspase-1在细胞焦亡和炎症反应中的具体作用机制，
有助于发现新的药物靶点。
药物设计与优化
02
基于对caspase-1结构和功能的深入了解，可以设计和优化更有
效的药物分子，提高治疗效果并降低副作用。
临床试验与验证
03
开展临床试验以验证针对caspase-1的药物在人体中的安全性和
有效性，为将来的药物上市提供依据。
细胞焦亡的生Leabharlann 学意义细胞焦亡在天然免疫中发挥重要作用，能够清除 被感染或受损的细胞，并引发炎症反应。
细胞焦亡有助于维持组织稳态，防止病原体扩散 和感染。
细胞焦亡与多种疾病的发生和发展密切相关，包 括炎症性疾病、神经退行性疾病和癌症等。
04
caspase-1与炎症反应
炎症反应的概述
炎症反应是机体对损伤、感染或 异常刺激的一种防御性反应，表 现为红肿、发热、疼痛等症状。
Caspase家族与细胞凋亡的关系
Caspase家族与细胞凋亡的关系一、本文概述细胞凋亡，也被称为程序性细胞死亡，是一种由基因控制的细胞自主有序的死亡方式。
它在生物体的发育、生长、平衡和稳态维持等过程中起着至关重要的作用。
在细胞凋亡的过程中，Caspase家族蛋白酶起着关键的角色。
本文旨在深入探讨Caspase家族与细胞凋亡之间的关系，包括Caspase家族的基本特性、它们在细胞凋亡中的功能机制，以及相关的调控网络和潜在应用。
我们将对Caspase家族进行简要的介绍，包括其成员的分类、结构特点以及活性调控等。
然后，我们将详细阐述Caspase家族在细胞凋亡过程中的关键作用，包括凋亡信号的接收、传递、放大和执行等阶段。
我们还将探讨Caspase家族与其他凋亡相关蛋白的相互作用，以及它们在细胞凋亡调控网络中的地位。
我们将展望Caspase家族在未来生物医学研究中的应用前景，特别是在癌症治疗、神经退行性疾病防治等领域中的潜在作用。
通过本文的阐述，我们期望能够更深入地理解Caspase家族与细胞凋亡的关系，为未来的生物医学研究提供有益的参考和启示。
二、Caspase家族概述细胞凋亡，也称为程序性细胞死亡，是生物体内一种至关重要的生理过程，负责维持机体的稳态，去除受损或不需要的细胞。
在这一过程中，Caspase家族扮演着核心的角色。
Caspase，全称为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Cysteine-dependent Aspartate-directed Proteases），是一组存在于细胞质中的半胱氨酸蛋白酶，具有特定的天冬氨酸切割位点。
Caspase家族成员众多，按其功能和在凋亡过程中的作用，可以分为启动型Caspase（也称为上游Caspase，如Caspase-2, -8, -9, -10）和执行型Caspase（也称为下游Caspase，如Caspase-3, -6, -7）。
启动型Caspase在凋亡信号刺激下首先被激活，然后它们会激活执行型Caspase。
Caspase
Caspase生化特性caspase家族属于半胱氨酸蛋白酶，一般在细胞内以无活性酶形式存在；当其作用于特异性底物，产生异二聚体，同时发出光子。
Caspase检测凋亡的原理通过检测细胞内caspase酶活性了解细胞的凋亡功能。
试剂渗透进入细胞后，使细胞内caspase 酶释放，作用于其特异性底物，产生发光体或荧光，发光酶（荧光酶）作用于发光体，产生光。
发光度与细胞内caspase酶活性成正比。
Caspase酶活性反映了细胞内凋亡途径激活情况，即细胞的凋亡能力。
如何做对照组？阴性对照：caspase抑制剂和培养基；或者只加完全培养基。
试剂盒没有caspase抑制剂？不必要。
Caspase试剂盒组成：caspase3/7特异性底物；含发光酶，细胞溶解液的缓冲液。
Caspase试剂盒分类：caspase3/7,caspase8,caspase9.(后两个是内源性凋亡途径参与物）试剂盒的选择：一般细胞凋亡检测选用caspase3/7试剂盒，如果用于分析凋亡上游启动子，根据对凋亡途径（内源性/外源性）的兴趣，选择caspase8/caspase9试剂盒即可。
Caspase3/7介绍Caspase3/7是一种发光分析法，可用于检测粘附细胞或悬浮生长细胞内caspase3/7的酶活性。
试剂盒中包含了发光前体caspase3/7的Z-DEVD-aminoluciferin 冻干底物，DEVD为抑制剂，保证了试剂盒的特异性。
底物被切割后产生发光体，发光体作为发光酶的底物与之反应后，发出光。
Caspase3/7试剂已经对caspase酶活力，发光酶活力以及细胞溶解做了优化。
将试剂以混合物形式加入样本，导致细胞溶解，底物的切割和产生流性光信号。
可用于研究细胞凋亡和凋亡抑制。
实验大概需用2小时一轮。
检测波长一般检测发光体没有内置的波长选择功能，都采用全部可见光检测。
原因有二：1.不需用滤光；2.滤光后敏感度降低。
内源性凋亡途径：病毒，紫外线或线粒体胞膜破坏，细胞色素C释放至胞液等因素导致内源性凋亡途径激活，从而产生含有caspase-9前体的凋亡小体复合物，复合物导致caspase-9活化，接着caspase-9使下游介导凋亡的死亡效应caspase酶活化，包括caspase3,caspase6,caspase7。
caspase蛋白1
Caspase-9酶原
凋亡复合体
执行Caspase与底物作用方式
四、Caspase家族与细胞凋亡的关系
细胞凋亡过程可以分为激活期和执行期。前期细 胞应答死亡信号，起始Caspase活化，后期执行 Caspase活化，执行细胞死亡程序。起始Caspase的 活化属于同性活化，即酶原分子聚集成复合物达到一 定浓度时，就彼此切割或者构象改变产生有活性的二 聚体形式；执行Caspase的活化属于异性活化，即起 始Caspase招募执行Caspase酶原分子后，对其进行 切割，产生具有活性的执行Caspase切割细胞内重要 的结构和功能蛋白，导致细胞凋亡。
内源途径
内源性细胞凋亡途径始于线粒体,细胞色素c 从线粒体内释放是关键的一步。在细胞凋亡信 号的刺激下,细胞色素c从线粒体内释放到胞浆 内，胞浆内的细胞色素c在dATP存在下通过Cys 蛋白酶募集域的作用。与凋亡细胞蛋白酶激活 因子Apaf-1结合，募集并激活 Caspase-9，然 后激活下游的效应半胱氨酸蛋白酶,如Caspase2、3、6、7、8、9，启动Caspase的级联反应， 引起细胞凋亡。
别名
ICE ICH-1 CPP32, Yama, apopain TX, ICH-2, ICErel-II ICErel-III, TY Mch2 Mch3, ICE-LAP3, CMH-1 MACH, FLICE, Mch5 ICE-LAP6, Mch6 Mch4 ICH3, FLICE2
识别 序列 YVAD
外源途径
Fas Fas
Fas
DD DD
DD
+
DD
DED
FADD
DED
+
Caspase-8酶原
人半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)说明书
控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本 OD 值
计算 以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的
OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与 OD 值计算出标
准曲线的直线回归方程式，将样品的 OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，
即为样品的实际浓度。
注意事项 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未
试剂盒组成 1 30 倍浓缩洗涤液 2 酶标试剂 3 酶标包被板 4 样品稀释液 5 显色剂 A 液 6 显色剂 B 液
20ml×1 瓶 6ml×1 瓶 12 孔×8 条 6ml×1 瓶 6ml×1 瓶 6ml×1/瓶
7 终止液
6ml×1 瓶
8 标准品（320 pmol/L） 0.5ml×1 瓶
9 标准品稀释液
2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50µl，待测样品孔中先加样品稀释液 40µl， 然后再加待测样品 10µl（样品最终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽 量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3. 温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。 4. 配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用 5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此 重复 5 次，拍干。 6. 加酶：每孔加入酶标试剂 50µl，空白孔除外。 7. 温育：操作同 3。 8. 洗涤：操作同 5。 9. 显色：每孔先加入显色剂 A50µl，再加入显色剂 B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 10 分钟. 10. 终止：每孔加终止液 50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止 液后 15 分钟以内进行。 操作程序总结：
Caspase半胱氨酸蛋白酶家族蛋白介绍
抗体动物种属来源缩写：R-兔、M-小鼠、r-大鼠、Sh-山羊、H-人
Caspase-6(CT)半胱氨酸蛋白酶蛋白-6（C端）
◆WB=1:300-600 Elisa=1:500-1500 IP=1:50-150 IHC=1:300-600
◆Caspase-6（NT）与Caspase-3有38%的同源性，属胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族。在凋亡执行阶段起中心作用，可被Caspase-7、-8、-10剪贴。它是唯一一个可以剪贴核纤维层蛋白的Caspase.分子量为：34KDa。
抗体动物种属来源缩写：R-兔、M-小鼠、r-大鼠、Sh-山羊、H-人
CD4（Mouse Anti-Human CD4 Monoclonal Antibody）
S-0551M
◆小鼠抗人CD4单克隆抗体
◆200ul/800.00 1ml/2200.00 (100ug/200ul 500ug/1ml)亲和纯化抗体
◆WB=1:300-600 Elisa=1:500-1500 IP=1:50-150 IHC=1:300-600 ICM=ICM=1:100-200
◆小鼠抗人CD3单克隆抗体（Mouse Anti-Human CD3 Monoclonal Antibody）经亲和纯化，溶于PBS（pH7.4）中，含BSA等稳定剂，识别17-19KDε链，可与人CD3抗原的ε链和T细胞抗原受体(CD3/TCR)复合体反应。类别：IgG2a,κ。CD3抗原在60-80%正常人外周血淋巴细胞和60-70%的人胸腺细胞上表达。在T细胞发育的早期，CD3抗原主要在胞浆中表达，晚期出现在膜上。在抗原识别中，CD3抗原起着信号传递的重要作用。有报道，CD3抗原在NK细胞的胞浆中(非膜上)表达，为研究T细胞和NK细胞的发育关系和共同的前体细胞提供了一种手段。抗CD3抗体在微量时对T细胞有强的致分裂原效应(在可溶性或固相条件下)，大剂量时有免疫抑制作用。
caspase-3
caspase-3Caspase家族Caspase属于半胱氨酸蛋白酶，相当于线虫中的ced-3，这些蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶，一旦被信号途径激活，能将细胞内的蛋白质降解，使细胞不可逆的走向死亡。
它们均有以下特点：①酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性；②总是在天冬氨酸之后切断底物，所以命名为caspase（cysteine aspartate-specific protease），方便起见本文称之为凋亡酶；③都是由两大、两小亚基组成的异四聚体，大、小亚基由同一基因编码，前体被切割后产生两个活性亚基。
最早发现人类中与线虫ced-3同源的基因[1]是ICE，即：白介素-1 β转换酶（Interleukin-1 β-converting enzyme）基因，因该酶能将白介素前体切割为活性分子，故名。
通过cDNA杂交和查找基因组数据库，在人类细胞中已发现11个ICE同源物[2]，分为2个亚族（subgroup）：ICE亚族和CED-3家族（图15-6），前者参与炎症反应，后者参与细胞凋亡，又分为两类：一类为执行者（executioner 或effector），如caspase-3、6、7，它们可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通过自催化（autocatalytic）或自剪接的方式激活；另一类为启动者（initiator），如caspase-8、9，受到信号后，能通过自剪接而激活，然后引起caspase级联反应，如caspase-8可依次激活caspase-3、6、7。
细胞中还具有caspase的抑制因子，称为IAPs（inhibitors of apoptosis proteins），属于一个庞大的蛋白家族。
它们能通过BIR结构域（baculovirus IAP repeats domain）[3]与caspase结合，抑制其活性，如XIAP。
非活性状态的pro-Caspase-3和活性状态的cleaved-caspase-3存在于细胞质中，当pro-caspase-3被剪切后剩下p17和p12 2个亚基，而产生活性。
什么情况下Caspase-1启动细胞凋亡而不是细胞焦亡？
什么情况下Caspase-1启动细胞凋亡而不是细胞焦亡？大多数不必要或危险的细胞，如病毒感染细胞，会通过激活内置的自杀程序自杀。
这种细胞死亡被称为“程序性细胞死亡”。
在2000年左右，人们将这种细胞死亡方式定义为细胞凋亡，至少在哺乳动物中，这几乎被认为是程序性细胞死亡的唯一模式。
近年来，根据细胞的分子机制和形态学特征，人们又定义了其他类型的“非凋亡”程序性细胞死亡，如细胞焦亡和坏死。
在细胞凋亡过程中，一组叫做半胱天冬酶（caspases）的蛋白酶起“自杀酶”的作用，人体约有10种。
caspase-1是在哺乳动物中发现的第一种caspase，已被报道在脑梗塞、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化（ALS）等神经疾病的动物模型中诱导神经元凋亡。
随后有研究表明，在被细菌感染的巨噬细胞中，caspase-1诱导坏死样和炎症性程序性细胞死亡，后来这被称为细胞焦亡。
说明caspase-1可以在不同的情况下诱导细胞焦亡或凋亡（上图），这其中的机制未被揭示。
最近，有研究表明，细胞焦亡是由于一种叫做Gastermin D （GSDMD）的蛋白质被caspase-1水解引起的。
GSDMD基因被破坏的巨噬细胞在caspase-1激活后表现出细胞死亡，但比野生型巨噬细胞慢。
因此，caspase-1介导的细胞死亡机制似乎与GSDMD无关。
然而，这种细胞死亡的形式和分子机制仍不清楚。
结果由神奈川大学、北海道大学、东京大学和日本国家遗传学研究所的科学家组成的研究小组，研究了caspase-1介导的巨噬细胞程序性细胞死亡。
首先，他们发现缺乏GMDSD的巨噬细胞在感染沙门氏菌时会发生凋亡，野生型巨噬细胞在同样条件下也会发生凋亡。
但caspase-1缺陷的巨噬细胞在相同条件下几乎没有细胞死亡，很明显caspase-1介导了细胞焦亡和细胞凋亡这两种程序性细胞死亡。
接下来，研究小组调查了caspase-1介导的GSDMD缺陷细胞凋亡所需的caspase家族成员。
caspase蛋白1
二、Caspase家族蛋白酶的结构与功能
人类的Caspase-1和Caspase-3的3D结构（NCBI）
其它Caspase蛋白酶
2
4
5
6
7
9
10
11
3
图 ： 蛋 白 酶 家 族 的 同 源 性
蛋白酶名称
caspase 1 caspase 2 caspase 3 caspase 4 caspase 5 caspase 6 caspase 7 caspase 8 caspase 9 caspase 10 caspase 11 caspase 12 caspase 13 caspase 14 caspase 15
三、Caspase家族蛋白酶的活化
细胞凋亡过程中Caspase级联效应
NH2
活化的
caspase X
大亚基
切割位点
COOH 未活化的 caspase酶原Y
切割活化
原结构域
小亚基
活化的 caspase Y
活化的caspaseX 较多活化的caspaseY 切割细胞质蛋白
大量活化的caspaseZ 切割细胞核蛋白
内源途径
内源性细胞凋亡途径始于线粒体,细胞色素c 从线粒体内释放是关键的一步。在细胞凋亡信 号的刺激下,细胞色素c从线粒体内释放到胞浆 内，胞浆内的细胞色素c在dATP存在下通过Cys 蛋白酶募集域的作用。与凋亡细胞蛋白酶激活 因子Apaf-1结合，募集并激活 Caspase-9，然 后激活下游的效应半胱氨酸蛋白酶,如Caspase2、3、6、7、8、9，启动Caspase的级联反应， 引起细胞凋亡。
CARD
Caspase-9酶原
凋亡复合体
执行Caspase与底物作用方式
《caspase蛋白》课件
研究Caspase蛋白与其他分子的相互作用， 有助于更全面地了解其在细胞内的功能。
探讨Caspase蛋白在临床诊断、治疗和预后 评估中的应用前景，为相关疾病的诊疗提 供新的思路和方法。
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命名
Caspase是半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶的简称，因为其活性位点包含半胱氨酸和天冬氨酸残基。
Caspase蛋白的结构和功能
结构
Caspase蛋白属于 cysteine protease 家族，具有一个或多个活性位点。
功能
Caspase蛋白在细胞凋亡过程中起关 键作用，通过切割特定的蛋白质引发 细胞死亡。
Caspase与肿瘤免疫
Caspase还参与肿瘤免疫应答，它们可以调 节免疫细胞的活性，影响抗肿瘤免疫反应。
Caspase蛋白与神经退行性疾病的关系
神经退行性疾病的病理机制
神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病等，与Caspase蛋白的活性密切相关。
Caspase在神经退行性疾病中的作用
Caspase可以通过诱导神经元凋亡或自噬，加速神经元的死亡，参与神经退行性疾病的发 病过程。
详细描述
目前已经发现多种Caspase蛋白抑制剂，如Z-VAD-FMK、Ac-DMQD-CHO等，这些抑制剂可以通过与Caspase 蛋白结合，抑制其活性，从而阻止细胞凋亡的发生。其中，一些抑制剂已经在临床试验中显示出良好的疗效，为 治疗某些疾病提供了新的可能。
Caspase蛋白与药物研发的关系
总结词
03
Caspase蛋白与疾病的关 系
Caspase蛋白与癌症的关系
癌症发生机制
Caspase蛋白在癌症发生过程中起着关键作 用，它们参与细胞凋亡和自噬等过程，调节 肿瘤细胞的生长和死亡。
caspase家族蛋白酶的结构与功能
caspase家族蛋白酶的结构与功能按照结构同源性的大小，可以将caspase蛋白酶分为三个组，分别以caspase-1、caspase-2和caspase-3为代表。
其中最重要的是caspase-1、caspase-3 和caspase-8。
(一)caspase-1(ICE)1. ICE的结构与生物学作用ICE即IL-1b 转化酶(IL-1b converting enzyme)，是单核细胞合成的一种蛋白酶，可以将34kD的IL-1b 前体(pro-IL-1b )剪切为17kD的成熟IL-1b ，这种剪切对于IL-1b 活性的发挥是必须的。
不表达ICE的细胞系转化IL-1b 基因后可以产生pro-IL-1b ，但不能分泌有活性的成熟IL-1b ；ICE特异性抑制剂可以阻断金黄色葡萄球菌刺激引起的IL-1b 的分泌。
ICE 属于半胱氨酸蛋白酶，活性中心有高活性的巯基，对氧化剂很敏感，但对丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶的抑制剂不敏感。
(1)ICE活化时的剪切过程：ICE基因定位于11q13-23，编码的ICE前体(pro-ICE)全长404aa，约45kD，蛋白酶活性中心是位于283~287位置的Gln-Ala-Cys-Arg-Gly(QACRG)五肽序列，其中Cys285是发挥酶切活性的关键残基。
在活化过程中pro-ICE在4个位点Asp103~Ser104、Asp119~Asn120、Asp297~Ser298和Asp316~Ala317进行自我催化剪切形成两个片段P20和P10，P20和P10首先形成异源二聚体，然后两个P20/P10异源二聚体再通过P10小亚基多聚化形成同源二聚体，所以ICE的活性形式是(P20/P10)2。
pro-ICE活化过程中的剪切并不是在四个酶切位点同时进行的，最先被剪切的是第三个位点(Asp297~Ser298)，形成P35和P12两个片段，P35的酶切活性比pro-ICE要高，它既可以进一步在第三个酶切位点剪切其它pro-ICE，还可以剪切其它三个酶切位点，形成P20和P10两个片段，再由P20和P10形成四聚体。
caspase家族及在细胞凋亡中的作用
caspase家族及在细胞凋亡中的作用admin注:本文仅是基础知识,目前这方面进展十分快，需要更新更多的知识。
如caspase家族目前发现至少14种。
这里仅介绍几种常见的成员。
目的是让大家了解到caspase家族的概况,以及在细胞凋亡中的作用。
一caspase家族蛋白酶的组成未活化的caspase家族蛋白酶是以酶原形式存在的，酶原的氨基端有一段被称为“原结构域”(pro-domain)的序列.酶原活化时不但要将原结构域切除，并且要将剩余部分剪切成一大的形式组成的。
这一小两个亚基，分别称为P20和P10,活性酶就是由这两种亚基以(P20/P10)2种活化反应也是Asp特异的，剪切发生在酶原中保守序列的Asp与其后的氨基酸残基之间，一般是先切下羧基端的小亚基，然后再从大亚基的氨基端切去原结构域.这种剪切可以是酶原及中间活性酶自我催化，也可以是其它ICE家族蛋白酶的作用，还有其它酶类如颗粒酶B参与。
表5。
caspase家族蛋白酶的识别序列及作用底物已命名的caspase家族成员均已克隆成功,它们不但在氨基酸序列上具有同源性，而且在空间结构上也很相似。
目前已经获得了caspase—1（ICE)和caspase—3（CPP32）的X线结晶图像，结果显示它们具有相似的空间结构,在P20的C端和P10的N端有200多个氨基酸残基的序列尤为保守，在空间结构上组成相似的β折叠中心和相邻的α螺旋，保守的、对蛋白酶活性有特殊意义的氨基酸残基均位于这一段，并形成特定的结构。
不同源的序列主要存在于P20的N端和P20与P10交界处，这两个部位的氨基酸残基在蛋白酶活化过程中一般被全部或部分切除。
所有的成员都保守性地包含有与底物P1Asp作用的氨基酸残基，如在ICE中，它们是催化中心的Cys285,与酶/抑制剂复合物的巯基半缩醛以氢键结合的His237,以及可以稳定反应中间物氧阴离子的Gly238。
另外，Arg179、Arg341、Gln383和Ser347形成容纳P1Asp的“口袋”，Ser339靠近Cys285的巯基，以氢键结合P1位的酰胺。
caspase
ICE在细胞凋亡中的作用
普遍研究： ICE用ATP或过量内毒素刺激单核细胞，活 化ICE可增加IL-1b 的分泌来促进细胞凋亡。这种凋亡 可被牛痘病毒蛋白CrmA或细胞凋亡拮抗蛋白BCL-2所抑 制。 不同研究：稳定高表达IL-1b 的细胞系并不自发凋亡 ；在具有ICE活性的细胞中用YVAD抑制ICE活性后，细 胞凋亡过程也不受影响；凋亡的鸡细胞DU249的细胞提 取液不具有剪切pro-IL-1b 的能力，但凋亡的DU249细 胞提取液的另一种成分prICE可将不作为ICE底物的 PARP剪切成典型的凋亡片段。
3
caspase-1(ICE)
ICE的结构:ICE即IL-1b 转化酶，是单核细胞合成的
一种蛋白酶，可以将34kD的IL-1b 前体(pro-IL-1b ) 剪切为17kD的成熟IL-1b,其剪切的位点是一个四肽序 列。
生物学作用: 不表达ICE的细胞系转化IL-1b 基因后可
以产生pro-IL-1b ，但不能分泌有活性的成熟IL-1b ； ICE特异性抑制剂可以阻断金黄色葡萄球菌刺激引起的 IL-1b 的分泌。ICE属于Cys蛋白酶，活性中心有高活 性的巯基，对氧化剂很敏感，但对Ser蛋白酶、金属蛋 白酶或Asp蛋白酶的抑制剂不敏感。
活化的caspase能够特异地水解一套地物，从而导致细 胞凋亡，此过程为不可逆反应
正常情况下细胞内总存在有Caspase的抑制剂，以防止 caspase酶原偶然被激活而对正常细胞造成损伤。
四、Caspase家族与细胞凋亡的关系
与caspase有关的凋亡通路主要有两种。一种是死亡受体介 导的信号传导途径，另一种是线粒体依赖途径。 死亡受体介导的信号传导途径:最具代表性的死亡受体是 FADD(又名Fas或APO一11，是一种跨膜受体蛋白，既能与细胞外 的CD95抗体及CD95配基结合。又能与细胞内的接头蛋白FADD结 合，FADD的C端含有死亡域DD, N端含有死亡效应域DED。同时 CD95及caspase-8分别含有DD及DED， 当死亡诱导信号CD95抗体 或 CD95配基作用于CD95后，CD95的构象发生改变，通过其DD与 FADD的DD结合, FADD又通过DED与procaspase-8的DED结合．共 同形成死亡诱导信号复合物DISC，DISC形成后，可诱导 pmcaspase-8自身激活，产生活性的caspase-8a/b，活化的 caspase-8则进一步激活下游的caspase-3, caspase-3激活后作 用于特定的凋亡底物，引起细胞凋亡 。
细胞凋亡蛋白酶caspase
包括Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7，能被上游的始动
子激活，激活后的Caspase作用于特异性底物使细胞发生生化
及形态学改变，导致细胞凋亡。
3、包括Caspase-1、Caspase-4、CasPase-5、Caspase-13、
Caspase-14， 主要参与细胞因子介导炎症反应并在死亡受体
内源性细胞凋亡途径起始于线粒体，细胞凋亡信号刺激细 胞色素 c（Cytc）从线粒体中释放并与凋亡蛋白活化因子-1 （Apaf-1）结合，募集并激活caspase-9，然后激活下游的 caspase-3、caspase-8 诱导细胞凋亡的发生。
Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 表达量随着染毒剂量的 升高呈上升趋势，DEHP 通过内源性线粒体促凋亡途径诱导卵 巢细胞凋亡，进而损害雌性动物卵巢功能。
污染物对其影响
十溴联苯醚（BDE-209）是近年来环境中含量增长较快的环 境有机污染物。
以往认为低剂量 BDE-209 无毒性，而忽略了 BDE-209 具有 PBDEs 的难降解性、环境稳定性、高脂溶性和生物放大作用，易 通过食物链在生物体内蓄积，当蓄积达到一定量后，会对生物体 产生危害，如神经发育毒性、生殖毒性等。
在脑组织损伤、缺血和发育中的凋亡过程中可检测到 caspase-3 的活性增强，caspase-3 与 BDE-209 暴露存在剂量关系， 且联合窒息可加重这种损伤作用。
污染物对其影响
PAEs 增塑剂中 邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯( di-(2-ethylhexyl ) phthalate，DEHP )
介导的细胞凋亡途径中起辅助作用。
Caspase特点
Caspase是一种具有特异天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶，是 一组在细胞凋亡过程中起着关键作用的酶，且具有以下特点：
Caspase-1介导细胞焦亡与炎症反应
Caspase1介导细胞焦亡与炎症反应细胞焦亡是一种程序性细胞死亡形式，与细胞凋亡和自噬不同，细胞焦亡会导致细胞肿胀、细胞膜破裂和细胞内容物的释放，从而引发强烈的炎症反应。
Caspase1作为一种关键的炎症小体成分，在细胞焦亡和炎症反应中发挥着至关重要的作用。
Caspase1是一种半胱氨酸蛋白酶，主要存在于细胞质中。
在受到病原体感染、损伤或内源性刺激时，Caspase1会被激活，进而切割并激活炎症小体。
炎症小体是一种多蛋白复合物，由NLRP3、ASC和Caspase1组成。
当炎症小体被激活后，Caspase1会被招募到炎症小体中，并被切割成有活性的形式。
活化的Caspase1可以切割并激活多种炎症因子，如IL1β和IL18，这些炎症因子在细胞焦亡和炎症反应中发挥着重要作用。
IL1β和IL18能够诱导炎症细胞的募集和活化，促进炎症介质的释放，从而加剧炎症反应。
Caspase1还可以切割并激活Gasdermin D，Gasdermin D是一种细胞膜穿孔蛋白，能够导致细胞膜破裂和细胞内容物的释放，从而引发细胞焦亡。
除了直接参与细胞焦亡和炎症反应，Caspase1还可以通过调节其他细胞死亡途径来影响细胞焦亡和炎症反应。
例如，Caspase1可以切割并抑制细胞凋亡相关的蛋白，如Bcl2，从而促进细胞焦亡的发生。
Caspase1还可以切割并激活自噬相关的蛋白，如Beclin1，从而抑制自噬的发生。
Caspase1在细胞焦亡和炎症反应中发挥着至关重要的作用。
通过切割并激活炎症小体、炎症因子和细胞膜穿孔蛋白，Caspase1能够诱导细胞焦亡和炎症反应的发生。
Caspase1还可以通过调节其他细胞死亡途径来影响细胞焦亡和炎症反应。
因此，Caspase1在炎症性疾病和免疫性疾病中具有潜在的治疗价值。
Caspase1介导细胞焦亡与炎症反应细胞焦亡，作为一种程序性细胞死亡形式，在细胞免疫应答和炎症反应中扮演着重要角色。
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一caspase家族蛋白酶的组成未活化的caspase家族蛋白酶是以酶原形式存在的，酶原的氨基端有一段被称为“原结构域”(pro-domain)的序列。
酶原活化时不但要将原结构域切除，并且要将剩余部分剪切成一大一小两个亚基，分别称为P20和P10，活性酶就是由这两种亚基以(P20/P10)2的形式组成的。
这种活化反应也是Asp特异的，剪切发生在酶原中保守序列的Asp与其后的氨基酸残基之间，一般是先切下羧基端的小亚基，然后再从大亚基的氨基端切去原结构域。
这种剪切可以是酶原及中间活性酶自我催化，也可以是其它ICE家族蛋白酶的作用，还有其它酶类如颗粒酶B参与。
表5. caspase家族蛋白酶的识别序列及作用底物已命名的caspase家族成员均已克隆成功，它们不但在氨基酸序列上具有同源性，而且在空间结构上也很相似。
目前已经获得了caspase-1(ICE)和caspase-3(CPP32)的X线结晶图像，结果显示它们具有相似的空间结构，在P20的C端和P10的N端有200多个氨基酸残基的序列尤为保守，在空间结构上组成相似的β折叠中心和相邻的α螺旋，保守的、对蛋白酶活性有特殊意义的氨基酸残基均位于这一段，并形成特定的结构。
不同源的序列主要存在于P20的N端和P20与P10交界处，这两个部位的氨基酸残基在蛋白酶活化过程中一般被全部或部分切除。
所有的成员都保守性地包含有与底物P1Asp作用的氨基酸残基，如在ICE中，它们是催化中心的Cys285，与酶/抑制剂复合物的巯基半缩醛以氢键结合的His237，以及可以稳定反应中间物氧阴离子的Gly238。
另外，Arg179、Arg341、Gln383和Ser347形成容纳P1Asp的“口袋”，Ser339靠近Cys285的巯基，以氢键结合P1位的酰胺。
与P2~P4作用的氨基酸残基则变异比较大，这可能是各个成员识别不同底物的特异性之所在。
在活性Cys周围的氨基酸序列也很保守，一般都有Gln-Ala-Cys-Arg-Gly(QACRG)五肽序列，在caspase-8、caspase-10中为QACQG，在caspase-9中是QACGG，这三个成员都有一个氨基酸残基的变异，但这种变异不影响蛋白酶的剪切活性和特异性。
二caspase家族蛋白酶的结构与功能按照结构同源性的大小，可以将caspase蛋白酶分为三个组，分别以caspase-1、caspase-2和caspase-3为代表。
其中最重要的是caspase-1、caspase-3 和caspase-8。
(一)caspase-1(ICE)(二)caspase-3(三)caspase-8(四)其它caspase蛋白酶(一)caspase-1(ICE)1. ICE的结构与生物学作用ICE即IL-1β转化酶(IL-1β converting enzyme)，是单核细胞合成的一种蛋白酶，可以将34kD的IL-1β前体(pro-IL-1β )剪切为17kD的成熟IL-1β，这种剪切对于IL-1β活性的发挥是必须的。
不表达ICE的细胞系转化IL-1β基因后可以产生pro-IL-1β，但不能分泌有活性的成熟IL-1β；ICE特异性抑制剂可以阻断金黄色葡萄球菌刺激引起的IL-1β的分泌。
ICE属于半胱氨酸蛋白酶，活性中心有高活性的巯基，对氧化剂很敏感，但对丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶的抑制剂不敏感。
(1)ICE活化时的剪切过程：ICE基因定位于11q13-23，编码的ICE前体(pro-ICE)全长404aa，约45kD，蛋白酶活性中心是位于283~287位置的Gln-Ala-Cys-Arg-Gly(QACRG)五肽序列，其中Cys285是发挥酶切活性的关键残基。
在活化过程中pro-ICE在4个位点Asp103~Ser104、Asp119~Asn120、Asp297~Ser298和Asp316~Ala317进行自我催化剪切形成两个片段P20和P10，P20和P10首先形成异源二聚体，然后两个P20/P10异源二聚体再通过P10小亚基多聚化形成同源二聚体，所以ICE的活性形式是(P20/P10)2。
pro-ICE活化过程中的剪切并不是在四个酶切位点同时进行的，最先被剪切的是第三个位点(Asp297~Ser298)，形成P35和P12两个片段，P35的酶切活性比pro-ICE要高，它既可以进一步在第三个酶切位点剪切其它pro-ICE，还可以剪切其它三个酶切位点，形成P20和P10两个片段，再由P20和P10形成四聚体。
四聚体形式的ICE酶切活性非常强，实验证明即使在单核细胞大量分泌IL-1β时，细胞浆中活性形式的ICE也仅占很小的比例。
从pro-ICE上剪切下来的原结构域可以抑制ICE的进一步剪切，这可能是一种反馈机制。
(2)ICE识别的剪切位点和特异性抑制剂：ICE识别的剪切位点是一个四肽序列，除了在P1位置的Asp外，还要求在P4位置的氨基酸残基具有一个较大的疏水性集团，P2和P3位置上的氨基酸的变异则较大，P1’位置上一般是一个较小的疏水性氨基酸。
根据这一研究结果，人们合成了ICE的人工特异性四肽底物YVAD，醛化的YVAD(Ac-YVAD-CHO)是ICE的特异可逆抑制剂，醯酮化YVAD(Ac-YVAD-CMK)是特异性不可逆抑制剂。
YVAD抑制剂可以抑制单核细胞中成熟IL-1β的释放，而对其它细胞因子的释放没有作用，在体的实验也有同样的结果，说明这些特异性抑制可能具有一定的临床实用前景。
牛痘病毒产生的一种38kD的蛋白质CrmA(cytokine response modifier A)与丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)很相似，但它并不抑制丝氨酸蛋白酶的活性，反而抑制ICE的活性。
研究发现这是因为CrmA的氨基酸序列中有LVAD四肽结构，与ICE的特异性抑制剂YVAD很相似，可以作为假底物结合ICE，阻断ICE对pro-IL-1β的剪切，从而降低IL-1β的分泌。
所以CrmA在病毒感染时可以干扰宿主的炎症反应，促进病毒在体内的复制。
(3)ICE的空间构型：利用不可逆的抑制剂Ac-YVAD-CMK，Walker等于1994年获得了活性ICE的X线结晶图像。
分析发现，ICE是首先由P20/P10构成一个完整的结构域，然后两个相同的结构域再通过P10结合成一个蛋白酶。
在P20/P10异源二聚体中，中心位置是由6个β折叠股组成，其中4个来自于P20呈平行排列，另两个来自P10，其中一个与P20的4个折叠股平行排列，另一个则呈反平行排列。
β折叠股形成的核心周围是由分别来自P20和P10的α螺旋所包围。
两个P20/P10异源二聚体以反平行方式通过P10结合在一起，在外表形成一个可以容纳底物P1Asp侧链羧基基团的“口袋”。
这个“口袋”由P20的Arg179、Gln283和P10的Arg341、Ser347组成，Gly238和His237也参与这种构型的维持，活性中心的Cys285通过氢键与底物结合。
对ICE/CED-3家族其它成员的研究发现，在ICE中形成活性中心的氨基酸序列和形成容纳底物的“口袋”的四个氨基酸都很保守，提示它们可能具有相似的空间结构。
2. ICE在细胞凋亡中的作用Yuan等于1993年将CED-3基因克隆出来，发现它所编码的蛋白质的与人ICE 很相似，在一级结构上有28%的同源性。
CED-3包含503个氨基酸残基，有100aa 富含丝氨酸，与ICE的同源性主要表现在非富含丝氨酸的区域，尤其是羧基端的115aa，与ICE同源性高达43%，其中也包含活性中心QACRG(361~365)。
CED-3可能象ICE一样，也是一种半胱氨酸蛋白酶，通过剪切底物蛋白来参与细胞凋亡。
ICE是人体中CED-3的同源物，可以发挥与CED-3相似的作用，参与人体细胞的凋亡过程。
用ATP或过量内素毒素刺激单核细胞，可以通过活化ICE增加IL-1β的分泌，这些刺激同时也可以促进细胞凋亡。
将ICE cDNA转染入大鼠成纤维细胞系中过量表达ICE可以引起细胞凋亡，这种凋亡可以被牛痘病毒蛋白CrmA或细胞凋亡拮抗蛋白BCL-2所抑制；如果在转染前将ICE基因中编码酶切活性中心的氨基酸残基(Cys285、Gly287)突变，则不能诱导细胞发生凋亡；将CrmA导入鸡背根神经节细胞可以阻断撤除神经生长因子而引起的神经元细胞的凋亡过程。
但是有些研究与上述结果不相吻合：稳定高表达IL-1β的细胞系并不自动发生凋亡；ICE基因剔除的小鼠虽然不能分泌成熟IL-β，但其发育并不受影响，也不发生自身免疫性疾病，这些小鼠的胸腺细胞和巨噬细胞在受到特定信号刺激后仍能发生凋亡；在具有ICE活性的细胞中用YVAD抑制ICE活性后，细胞凋亡过程也不受影响；凋亡的鸡细胞DU249的细胞提取液不具有剪切pro-IL-1β的能力，但凋亡的DU249细胞提取液的另一种成分prICE(proteolytic resembling ICE)则可以将不能作为ICE底物的PARP剪切成典型的凋亡片段。
这些结果说明ICE本身可能不是人体细胞凋亡的真正效应剂，至少不是最主要的因素，在人体中可能有其它更重要的ICE样的蛋白酶参与细胞凋亡过程。
(二)caspase-31994年Fernandez-Alnemri等在BenBank表达序列标记(expression sequence tag, EST)数据库中找到一段ICE/CED-3活性中心同源的序列，用它合成探针后，筛选人Jurkat T淋巴细胞cDNA文库，从中克隆到一种新基因，因其编码分子量为32kD的半胱氨酸蛋白酶而称之为CPP32(cysteine protease protein, 32kD)。
随后，其它学者独立地将这一蛋白基因克隆出来，并分别命名为prICE、apopain(凋亡素)和Yama(印度传说中的死亡之神)。
1996年这种蛋白酶被命名为caspase-3。
现在一般认为caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分。
1. caspase-3的结构pro-caspase-3含有277个氨基酸残基，分子量约32kD，与ICE有30%同源性，与CED-3有35%同源，是caspase家族中与CED-3同源性最高的，不论从结构同源性还是从底物特异性来看都与CED-3很相似，所以有人认为它是CED-3在哺乳动物中的同源蛋白。
caspase-3的原结构域明显短于ICE只有28个氨基酸残基，但蛋白酶活性中心和与结合底物有关的保守的氨基酸均与ICE一致。
pro-caspase-3在活化过程中从Asp28~Ser29和Asp175~Ser176两处被剪切，形成P17(29~175)和P10(182~277)两个片段，相当于ICE的P20和P10，两种亚基再组成活性形式的caspase-3。