caspase信号通路教程
Westernblot检测caspase3地步骤及原理
蛋白免疫印迹检测caspase-3的活化原理及步骤
【原理】
蛋白免疫印迹技术是以某种抗体作为探针，使之附着于固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原部位发生特异性反应，从而对复杂的混合物中的某些特定蛋白进行鉴别和定量。
基本过程：蛋白质样品先经SDS-PAGE分离，后通过电转移将凝胶上的蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上，经封闭后再用抗待检蛋白的特异性抗体作为探针与之结合，经洗涤后，将滤膜与辣根过氧化物酶偶联的抗IgG二抗结合。
辣根过氧化物酶可催化鲁米诺氧化并发光，试剂中的增强剂能使发光增强1000倍。
当加入免疫印迹化学发光剂后，鲁米诺发生氧化发光，并发射波长为428nm的光，此光可经X光胶片感光记录下来。
以此确定抗原-抗体-抗抗体复合物在滤膜上的位置及丰度。
【步骤】。
Caspase活性检测说明书
Caspase活性检测（基于p NA标记底物的比色法）在caspase 的底物多肽上标记发色团如：p NA，可用于检测凋亡细胞中的caspase活性及筛选caspases的激活剂或抑制剂。
本操作步骤主要针对使用酶标仪进行读数而设计。
其中使用的细胞抽提物、底物、抑制剂及p NA的用量为每个样本140ul。
若您希望设计针对分光光度计读数的实验，建议对每种溶液体积进行进一步优化。
所需溶液、试剂及设备• Caspase底物• Caspase抑制剂• 细胞裂解缓冲液：50mM HEPES, pH7.4, 100mM NaCl, 0.1%CHAPS, 1mM DTT, 100uM EDTA • 检测缓冲液：50mM HEPES, pH7.4, 100mM NaCl, 0.1%CHAPS, 10mM DTT, 100uM EDTA, 10%Glycerol• PBS：将8g NaCl、200mg KCl和1.44g Na2HPO4溶于800ml蒸馏水；用HCl调至pH7.4；定容至1L• 酶标板和酶标仪其它试剂(推荐)• 纯化的Caspase（阳性对照）• p NA细胞抽提物的制备以适合的凋亡诱导剂对细胞进行诱导（参考前述操作方法），同时做阴性对照，包括未处理细胞、用诱导剂的无诱导活性类似物处理细胞（若可得到），或一个凋亡诱导处理“零时间”样品。
应保证有足够细胞进行重复实验，包含或不含抑制剂的对照以检测蛋白浓度。
一般来说，我们下面推荐的裂解前细胞数量可以产生足够蛋白浓度供酶标仪检测；然而不同大小、体积的细胞及蛋白浓度可能需要增加铺板密度。
当裂解2×107/ml细胞是，产生的蛋白浓度约为1-3mg/ml，体积10ul，含约10-30ug蛋白。
依据其细胞系，最少应有106个细胞，体积50ul的裂解缓冲液进行处理。
• 细胞计数，离心收集细胞。
以PBS缓冲液洗涤一次。
若细胞已被caspase抑制剂处理过，建议多洗几次以防止后继实验中可能造成的不利影响。
Caspase信号通路
Caspases are a family of cysteine proteases that act in concert in a cascade triggered by apoptosis signaling. The culmination of this cascade is the cleavage of a number of proteins in the cell, followed by cell disassembly, cell death, and, ultimately, the phagocytosis and removal of the cell debris. The Caspase cascade is activated by two distinct routes: one from cell surface and the other from mitochondria (Ref.1). The pathway leading to Caspase activation varies according to the apoptotic stimulus. Initiator Caspases (including 8, 9, 10 and 12) are closely coupled to pro-apototic signals. Pro-apoptotic stimuli include the FasL (Fas Ligand), TNF (Tumor Necrosis Factor), Granzyme-B, GRB (Growth Factor Receptor-Bound Protein), DNA damage, Ca2+ (Calcium) channels and ER (Endoplasmic Reticulum) stress. Once activated, these Caspases cleave and activate downstream effector Caspases (including 3, 6 and 7). Caspase8 cleaves BID (BH3 Interacting Death Domain). tBID (Truncated BID) disrupts the outer mitochondrial membrane to cause release of the pro-apoptotic factors CytoC (Cytochrome-C) which is crucial for activating pro-Caspase9. CytoC that is released from the intermembrane space binds to APAF1 (Apoptotic Protease Activating Factor-1), which recruits Caspase9 and in turn can proteolytically activate Caspase3. SMAC (Second Mitochondria-Derived Activator of Caspase)/DIABLO is also released from the mitochondria along with CytoC during apoptosis, and it functions to promote caspase activation by inhibiting IAP (Inhibitor of Apoptosis) family proteins. ER stress leads to the Ca2+-mediated activation of Caspase12 (Ref.2).Fas and the TNFR (TNF Receptor) activate Caspases8 and 10. Cell death caused by activation of the TNFR or Fas receptors is brought about by the recruitment of the adaptor protein FADD (Fas Associated Death Domain). In the case of the TNFR1, FADD recruitment requires prior binding of TRADD (TNFR-Associated Death Domain Protein). FADD in turn recruits ProCaspase8. The TNFR1 receptor can also mediate activation of Caspase2 via the recruitment of a death-inducing signaling complex. In this case RIP (Receptor-Interacting Protein) acts as an adaptor for the recruitment of RAIDD (RIP-AssociatedICH-1/CED-3-homologous protein with a Death Domain), which subsequently binds to ProCaspase2. TNFR also activates Caspase3, 6,7 via TRADD, TRAF2 (TNF Receptor-Associated Factor-2) and RICK (RIP-like Interacting Clarp Kinase). TNF not only induces apoptosis by activating Caspase8 and 10, but can also inhibit apoptosis signaling via NF-KappaB (Nuclear Factor-KappaB), which induces the expression of IAP, an inhibitor of Caspases3, 7 and 9 (Ref.3).GRB (Growth Factor Receptor-Bound Protein), Granzyme B and perforin proteins released by cytotoxic T-Cells induce apoptosis in target cells, forming transmembrane pores, and triggering apoptosis, perhaps through cleavage of Caspases, although Caspase-independent mechanisms of Granzyme-B mediated apoptosis have been suggested (Ref.4). After activation, down stream Caspases cleave cytoskeletal and nuclear proteins (structural, signaling proteins or kinases) like PARP (Poly ADP-Ribose Polymerase), DNA-PK (DNA-Dependent Protein Kinase), Rb (Retino Blastoma Tumor Supressor Protein), PAK1 (p21-Activated Kinase-1), GDID4, Fodrin, Lamin-A, Lamin-B1, Lamin-B2, thus inducing apoptosis. Caspase3 cleaves ICAD (Inhibitor of CAD) to free CAD (Caspase-Activated DNase) to cause DNA fragmentation. The events culminating in Caspase activation and the subsequent disassembly of the cell are the subject of intense study because of their role in many neurodegenerative disorders such as Parkinson's and Alzheimer’s diseases, autoimmune disorders, and tumorigenesis.References:1. Srinivasula SM,Ahmad M,Fernandes-Alnemri T,Alnemri ES.Autoactivation of procaspase-9 by Apaf-1-mediated oligomerization.Mol Cell. 1998 Jun;1(7):949-57.2. Pirnia F,Schneider E,Betticher DC,Borner MM.Mitomycin C induces apoptosis and caspase-8 and -9 processing through a caspase-3 and Fas-independentpathway.Cell Death Differ. 2002 Sep;9(9):905-14.3. Swanton E,Savory P,Cosulich S,Clarke P,Woodman P.Bcl-2 regulates a caspase-3/caspase-2 apoptotic cascade in cytosolic extracts.Oncogene. 1999 Mar 11;18(10):1781-7.4. Pinkoski MJ,Heibein JA,Barry M,Bleackley RC.Nuclear translocation of granzyme B in target cell apoptosis.Cell Death Differ. 2000 Jan;7(1):17-24.。
细胞凋亡的信号通路
山东农业大学学报(自然科学版),2015,46(4):514-518VOL.46N0.42015 Journal of Shandong Agricultural University(Natural Science Edition)doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2015.04.007细胞凋亡的信号通路谢昆,李兴权红河学院生命科学与技术学院,云南蒙自661199摘要:细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种方式，与自噬和坏死有明显的区别。
细胞凋亡的信号途径比较复杂，在凋亡诱导因子的刺激下经历不同的信号途径。
本文就细胞凋亡的三条信号通路——线粒体途径、内质网途径和死亡受体途径做一综述，以便为人们进一步了解细胞凋亡发生的机制，从而对癌症及其他一些相关疾病的治疗奠定基础。
关键词:细胞凋亡;信号通路;线粒体途径;内质网途径;死亡受体途径中图法分类号:R329.2+8文献标识码:A文章编号:1000-2324(2015)04-0514-05The Signal Pathway of ApoptosisXIE Kun,LI Xing-quanDepartment of Life Science and Technology/Honghe University,Mengzi661199,ChinaAbstract:Apoptosis is a process of programmed cell death which distinguishes from autophagy and necrosis.The signal pathways of apoptosis are complex and different under apoptosis induced factor stimulating.Three kinds of signal pathways of apoptosis including Mitochondrial pathway,Endoplasmic Reticulum pathway and Death Receptor pathway were summarized in this review in order to make people further comprehend the mechanism of apoptosis，so that it should make a basis for us all to treat cancer and other related diseases.Keywords:Apoptosis;signal pathway;Mitochondrial pathway;Endoplasmic Reticulum pathway;Death Receptor pathway细胞凋亡是细胞程序性死亡（Program cell death，PCD）中特有的一种细胞死亡方式，是细胞在一系列内源性基因调控下发生的自然或生理性死亡过程。
干货细胞信号通路图解之细胞凋亡信号通路【珍藏版】
干货细胞信号通路图解之细胞凋亡信号通路【珍藏版】（1）通路综述：细胞凋亡是一种受调节的细胞自杀机制,通常表现为核浓缩、起皱、膜发泡以及DNA片段化。
Caspase家族属于半胱氨酸蛋白酶。
起始组Caspase包括caspase-2,-8,-9,-10,-11和-12,与促凋亡信号紧密相连，一旦激活，这些酶会切割并激活下游的效应组Caspase，包括Caspase-3,-6,-7。
效应 Caspase通过对细胞内蛋白特定的天冬氨酸残基位置处进行切割实现细胞的凋亡。
FasL和TNF对Fas和 TNFR的结合能够激活caspase-8和-10。
DNA损伤诱导PIDD 的表达，PIDD与RAIDD 和caspase-2结合并激活caspase-2。
受损线粒体中释放的细胞色素C与caspase-9的活化相关。
XIAP抑制Caspase-3,-7,-9。
线粒体释放多种促凋亡因子,如Smac/Diablo、AIF、HtrA2、EndoG，和细胞色素C。
Smac/Diablo与XIAP结合，解除XIAP对凋亡的抑制。
Caspase-11被病理的促发炎信号和促凋亡信号诱导表达并激活，它能促进Caspase-1的活化,Caspase-1直接作用于caspase-3以促进凋亡和炎症反应。
Caspase-12和-7在内质网应激的情况下被激活。
抗凋亡生长因子和细胞因子激活 Akt和 p90RSK。
Akt 直接磷酸化并抑制Bad蛋白和间接抑制Bim的表达，这是通过磷酸化并抑制Bim所需的转录因子Fox0实现的。
Fox0通过上调促凋亡因子如FasL和Bim促进调亡。
（2）细胞生存需要积极的抑制凋亡发生，一方面需要抑制促凋亡因子的表达，另一方面则需要表达一些抗凋亡因子。
PI3K 通路被许多生存因子活化，能够激活Akt，Akt是生存信号传导中一个重要的角色。
PTEN抑制PI3K通路。
活化的Akt抑制促凋亡Bcl-2家族成员Bad，Bax，caspase-9，GSK-3和Fox01。
细胞凋亡信号通路详细资料与总结
凋亡抑制剂
凋亡促进剂，与 BCL-2 和 BCL-XL 结合 线虫中的凋亡抑制剂，BCL-2 同源物 腺病毒凋亡抑制剂，与 Bax 和 Bak 结合
Bcl-2家族 引自Katja C. Zimmermann等2001
◆当 Caspase8 活化后，它一方面作用 Procaspase3，另一方面使Bid 裂解成 2 个片 段，其中含 BH3 结构域的 C-端片段被运送 到线粒体，与 Bcl-2/Bax 的 BH3 结构域形成 复合物，导致Cyt c释放。Cyt c 与胞质中 Ced4 同源物 Apaf-1（凋亡蛋白酶活化因子 apoptosis protease activating factor）结合并活 Apaf-1，活化的 Apaf-1 再活化Procaspase9， 最后引起细胞凋亡。
解 DNA。 –CAD 为caspase-activated Dnase（脱氧核苷酸酶），存在于胞质中。
细胞色素释 放引起的凋 亡（线粒体 凋亡通路）
死亡受体凋亡通路
fas 又称作 APO-1， TNFR（ 肿瘤坏死因子受体）和 NGF 受体家族。 1993 年人白细胞分型国际会议统一命名为 CD95。 Fas 蛋白（受体）与 Fas 配体组成 Fas 系统，二者的 结合导致靶细胞走向凋亡。
信号转导研究方法
• 免疫共沉淀 • 荧光共振能量转移（FRET） • 荧光漂白恢复 • 荧光相关光谱 • 免疫荧光显微技术 • 电镜显微技术
◆ bcl-2 蛋白，是膜的整合蛋白，主要存在于线粒体外膜、核膜及部分内质 网中。
◆ Bcl-2家族成员都含有1-4个Bcl-2同源结构域（BH1-4），并且通常羧基末 端有一穿膜的结构域 (transmembrane region，TM)。其中BH4是抗凋亡蛋 白所特有的结构域，BH3是与促进凋亡有关的结构域。
凋亡相关通路及抑制剂
Z-LEHD-FMK Z-YVAD-FMK
Z-WEHD-FMK
3. Bcl-2家族抑制剂：Bcl-2家族属于较大的蛋白家族，所有成员 至少包含4个bcl-2 同源结构域（BH，分别命名为BH1，BH2，BH3， BH4）之一，BH对凋亡功能的发挥意义重大。依据BH结构域组成的 差异，其中有的成员是抗凋亡因子如Bcl-2，Bcl-xl和Mcl 1，而有 的成员是促凋亡因子如Bax，Bak和Bok，后者又可以细分为只含BH3 的促凋亡蛋白（如Bid，Noxa，Puma和Bad）以及同时包含BH1~3的 多结构域蛋白（如Bax和Bak）。绝大多数Bcl-2家族成员含有C端跨 膜结构域，该结构域能促使蛋白与线粒体外膜或其他胞外膜结合从 而发挥各自功能。Bcl-2基因与多种不同肿瘤的发展和治疗抵抗性 密切相关。
• （见图1 细胞凋亡信号通路）
死亡受体通路
• 胞外的死亡信号可通过死亡受体转入胞内。死亡受体为一类跨膜 蛋白, 属肿瘤坏死因子受体(NFR)基因超家族。其胞外部分都含 有一富含半胱氨酸的区域, 胞质区有一由同源氨基酸残基构成的 结构,有蛋白水解功能, 称“死亡区域”( death domain)。“死 亡区域” 使死亡信号得以 进一步传递而启动凋亡。已知的死亡 受体有五种, TNFR-1 (又称 CD120a 或 p55) , Fas( CD95 或 Apo1) , DR3 (死亡受体3,又称 Apo3, WSL-1, TRAMP, LARD) , DR4 和 DR5( Apo2,TRAIL-R2, TRICK2, KILLER)。前三种受体相 应的配体分别为 TNF, FasL(CD95L),Apo3L(DR3L),后两种均为 Apo2L(TRAIL)。
ABT-263
Obatoclax (GX15-070)
Caspase的活化及其在细胞凋亡中的作用
当细胞受到某些刺激时，线粒体释放出促凋亡因子，如 Bcl-2家族的成员，这些因子会激活Caspase-9，进而激活 下游的Caspase，引发细胞凋亡。
内质网途径
当内质网应激时，会释放出Ca2+和活性氧，这些物质会 激活Caspase-12，进而引发细胞凋亡。
04 Caspase活化的研究方法
Caspase的活化及其在细胞凋亡 中的作用
目 录
• 引言 • Caspase的概述 • Caspase在细胞凋亡中的作用 • Caspase活化的研究方法 • Caspase活化与疾病的关系 • 展望与未来研究方向
01 引言
研究背景
细胞凋亡是生物体内一种重要的生理过程，它涉及到一系列复杂的分子事件和信 号转导途径。Caspase是一类在细胞凋亡过程中起关键作用的蛋白酶，其活化是 细胞凋亡的标志之一。
细胞凋亡的概述
01
细胞凋亡是细胞自我消亡的过程，是机体正常发育和维持内环 境稳定的重要机制。
02
细胞凋亡是由基因控制的程序性死亡，涉及一系列复杂的生化
反应。
细胞凋亡过程中，细胞膜保持完整，不会引起周围组织的炎症
03
反应。
Caspase在细胞凋亡中的角色
01
Caspase是一类蛋白酶，在细胞凋亡过程中起关键作 用。
当死亡受体（如Fas或TNFR）与其配体结合后，会募集并活化Caspase-8，引发细胞凋亡。
线粒体途径
当细胞受到某些刺激时，线粒体释放凋亡因子（如Cytochrome c），与Caspase-9前体结合 形成复合物，激活Caspase-9，进而活化效应Caspase引发细胞凋亡。
03 Caspase在细胞凋亡中的 作用
caspase
摘要内皮细胞通过分泌的细胞间通讯的重要介质血管壁细胞阵列和张力的调节中起着重要的作用。
人血管内皮细胞（EC）营养剥夺引起的非常规分泌导致nanovesicles不同于凋亡小体的多泡体标记和承载释放形式（MVB）。
营养的缺乏也是一个有效的诱导的自噬小泡运输途径可以帮助细胞自噬。
营养缺乏引起的一个显着和自噬功能的迅速增加，通过电子显微镜和免疫印迹分析LC3-II / LC3-I比成像。
增加自噬通量在血清饥饿细胞巴弗洛霉素A确认1。
诱导的自噬后的凋亡反应的指标，如通过显微镜和聚（ADP-核糖）评估在细胞膜通透性的指示坏死缺失聚合酶裂解。
与zvad-fmk泛caspase抑制并没有阻止细胞自噬的发展而受到负面影响自噬泡（AV）成熟。
采用免疫印迹法验证多维蛋白质组学的方法，我们确定营养剥夺EC释放AV组件（lc3i，LC3-II，ATG16L1和LAMP2）而zvad-fmk 泛caspase抑制剂阻断AV释放。
同样，在主动脉的小鼠EC营养剥夺的分离研究/半胱天冬酶3-缺失的小鼠没有凋亡自噬LC3和未能迅速释放。
总的来说，本研究结果表明，自噬成分释放的营养剥夺细胞凋亡的人类细胞的细胞膜通透性的缺失。
这些结果也确定caspase-3作为一种新型的AV释放器。
关键词自噬，自噬，caspase的激活，caspase-3，营养剥夺，非常规分泌说明内皮细胞通过分泌的细胞间通讯的重要介质血管壁细胞阵列和张力的调节中起着重要的作用。
响应于各种细胞应力是免疫或非免疫内皮细胞凋亡是血管疾病最关键。
凋亡细胞的凋亡小体膜结合主动释放来自皱缩，细胞膜。
1，2我们最近证明，除了膜起泡，非常规形式的分泌在人类凋亡激活的内皮细胞（EC）导致纳米囊泡的生化和功能不同的凋亡小体的多泡体标记和承载释放（MVB）。
3泛半胱天冬酶失活或小干扰靶向研究显著降低凋亡细胞释放的MVB成分RNA。
然而，MVB成分释放被描述在一个实验中，在人类EC敏锐地剥夺生长因子，一个经典的促凋亡刺激，但也是一种有效的诱导细胞自噬。
Caspases-中文版
80
100
120mins
TNF受体的双重功能
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凋亡中各种变化的出现时间
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凋亡诱导
受体激活
细胞色素C/Apaf -1复合物出现
线粒体膜电位降低 Caspases被激活，级联反应开始 PS外翻 细胞形态变化
DNA片段出现
10 20
60
以TNF-alpha/ 放线菌素D诱导的Hela细胞
• These substrates can be used for screening caspase activity or for screening caspase inhibitors这些底物可用于检测caspase 活力或筛选 caspase 抑制剂
AFC: 7-amino-4-trifluoromethyl) coumarin (Exc. ~400 nm; Em. ~505 nm)
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凋亡体(apoptosome )的形成
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Ca2+ (~1 mM)
Ca2+ (~500 nM)
Ca 2+
PTP Open
1.5 kDa + molecules
Cyt c
Fura 2/AM
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Fluo 3/AM
线粒体在凋亡中的作用
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III. 线粒体膜电位(∆Ψm)
可染色后通过光学或电子显微镜检测： HE，甲基绿 -派诺宁等
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凋亡中各种变化的出现时间
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凋亡诱导
受体激活
细胞色素C/Apaf -1复合物出现
caspase信号通路讲解
Caspase蛋白酶在死亡受体介导的细胞凋亡中起着中心的作用
1. Fas与配体结合而活化后， 2. 引起YVAD和zVAD敏感 的ICE家族蛋白酶活化， 3. 活化DEVD敏感的蛋白酶。 其中caspase-8是这一凋 亡过程中首先被活化的 ICE家族蛋白酶。 4. Caspase-8活化后， ① 剪切活化caspase-3、 caspase-7、 caspase-4、 caspase-9和 caspase-10，通过 这些蛋白酶剪切底物 使凋亡得以进行； ② 活性被CrmA所抑制， 籍此可作为细胞凋亡 负调控因素作用的环 节。
Caspase家族蛋白酶的识别序列及作用底物
蛋白酶 caspase 1 caspase 4 caspase 5 mICH3 mICH4 caspase 2 caspase 9 caspase 3 caspase 6 caspase 7 caspase 8 caspase 10 caspase 11 CED-3 别名 ICE TX, ICH-2, ICErel-II ICErel-III, TY 序列 底物 YVAD pro-IL-1b , pro-caspase 3, pro-caspase 4 pro-caspase 1
Caspase-2：
细胞发生凋亡时，48kDa的caspase-2先被一种caspase-3样蛋白酶在Asp316 剪切成p33和p14，然后再缓慢地在Asp152和Asp330处剪切为p18和p12组成的 活性蛋白酶，后一过程要在2~3h后才能完成。caspase-2可能参与CTL细胞的杀 伤作用，但它并不能被颗粒酶B直接活化，必须被一种caspase-3样蛋白酶活化。
Caspase家族蛋白酶的结构特征
Caspase家族蛋白酶的同源性 Caspase-1亚族：
caspase信号通路
细胞外途径：
细胞死亡信号蛋白盘 绕粘附到它的同源细 胞表面接收器上，死 亡配体与其受体结合， 导致其死亡结构域相 互积聚，并与转接器 分子的死亡结构域相 互结合，使死亡受体 分子活化。导致细胞 内pro- caspase 局 部聚集，FADD与募 集的pro- caspase 8地DED（长原域中 包含的死亡效应域结 合形成信号复合物， 使pro- caspase -8 自我水解、活化，形 成活性caspase -8。 激活的caspase -8激 活下游caspase，引 起细胞凋亡。
2. 当信号分子是多肽时：只能与细胞膜上的蛋白质等受体结合，这些受体大都 是跨膜蛋白，通过构象变化，将信号从膜外域传到膜内域，然后再与下一级 别受体作用，通过磷酸化等修饰化激活下一级别通路。
接收
转导
效应
Caspase
信号通 路
细胞外途径
细胞内途径
细胞内途径：
由线粒体介导的内源 性凋亡通路是哺乳动 物细胞程序性死亡的 主要途径。 凋亡刺激-死亡促进因 子（DPF），包括细 胞色素C、凋亡诱导 因子（AIF）、促死 亡蛋白、 caspase酶 原的释放-dATP、 ATP存在下活化 caspase-细胞凋亡。
在正常的细胞内，每一种caspase都是以非活性状态存在的，这种非活 性的caspase称作酶原（zymogen），它是酶的非活性前体，其肽链 比有活性时长一些，将多出的部分切除，就转变成有活性的caspase。
Caspase家族
Caspase家族蛋白酶的识别序列及作用底物 Casቤተ መጻሕፍቲ ባይዱase家族蛋白酶的结构特征 Caspase家族蛋白酶的同源性 Caspase蛋白酶在细胞凋亡中的活化顺序 Caspase蛋白酶在死亡受体介导的细胞凋亡 中起着中心的作用 Caspase蛋白酶家族
caspase信号通路详解
信号通路（signal pathway） ： 分类：
当细胞里要发生某种反应时，信号从细胞外到细胞内传递了一种信息，细胞要根 据这种信息来做出反应的现象，叫做信号通路。
1. 当信号分子是胆固醇等脂质时：可以轻易穿过细胞膜，在细胞质内与目的受 体相结合； 2. 当信号分子是多肽时：只能与细胞膜上的蛋白质等受体结合，这些受体大都 是跨膜蛋白，通过构象变化，将信号从膜外域传到膜内域，然后再与下一级 别受体作用，通过磷酸化等修饰化激活下一级别通路。
Caspase家族蛋白酶的识别序列及作用底物
蛋白酶 caspase 1 caspase 4 caspase 5 mICH3 mICH4 caspase 2 caspase 9 caspase 3 caspase 6 caspase 7 caspase 8 caspase 10 caspase 11 CED-3 别名 ICE TX, ICH-2, ICErel-II ICErel-III, TY 序列 底物 YVAD pro-IL-1b , pro-caspase 3, pro-caspase 4 pro-caspase 1
在正常的细胞内，每一种caspase都是以非活性状态存在的，这种非活性 的caspase称作酶原（zymogen），它是酶的非活性前体，其肽链比有活 性时长一些，将多出的部分切除，就转变成有活性的caspase。
Caspase家族蛋白酶的识别序列及作用底物
Caspase家族蛋白酶的结构特征 Caspase家族蛋白酶的同源性 Caspase蛋白酶在细胞凋亡中的活化顺序 Caspase蛋白酶在死亡受体介导的细胞凋亡 中起着中心的作用 Caspase蛋白酶家族
Caspase3在过度训练至大鼠心肌细胞凋亡信号传导途径中的作用
力竭后24h ES 24 h
n=8
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2、过度训练动物模型的建立
• 按 文 献 [2] 报 道 的 方 法 自 制 150cm×60cm×80cm 玻 璃 钢 游 泳 池。采用大鼠游泳至力竭，建 立过度训练模型（安静环境下 ，单次力竭，不加负重，水深 70cm，水温30±2℃）。为减少 实验误差，各组大鼠于实验前 一天适应性游泳30min，用吸水 纸把水擦干后放回笼子中，正 常饮食。
二相关知识14细胞凋亡caspase依赖的通非caspase依赖的通路死亡受体介导的凋亡通路线粒体细胞色素c介导的凋亡通路1516受体胞内dd区构象改变与接头蛋白fadd的dd区结合fadd的n端ded区与caspase8或10前体蛋白结合形成凋亡诱导的信号复合体disccaspase8或10自身剪切激活启动caspase级联应死亡受体与配体结合使受体三聚化caspase367激活降解cad抑制蛋白icaddff45释放出caspase依赖的dnasecad降解dan引发细胞凋亡17caspase家族的作用caspase蛋白酶家族成员在哺乳动物细胞凋亡中起重要作用
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• 次日再次放于水中游泳直到力竭，并 记录游泳时间。为保证大鼠游泳有足 够的活动空间，同时避免观察不及时 而发生溺水，每次各组取1只大鼠进行 力竭运动。
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力竭标准[2] ①沉入水底超过10秒钟； ②游泳动作明显不协调； ③捞出后没有逃避反应，且放在平面上
无法完成翻正反射。
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3、取材及标本收集
150cm×60cm×80cm玻璃钢游泳池。
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实验流程
模型制备
安静对照组
力竭即刻
力竭后6h
取材及标本收集 检测各项指标
细胞凋亡率
凋亡小体与炎症小体_Caspase蛋白酶的激活平台_柴继杰
WD40 结构域的 Apaf-1 蛋白的晶体结构呈现了其 结合 ADP 分子时关闭的构象，ADP 分子、CARD、 NBD、HD1、WHD 以及 HD2 结构域间的相互作用 共同维持了这种闭合的构象，其中 CARD 结构域 处于“半包裹”的状态，使得其无法招募 caspase-9[12]．全长 Apaf-1 蛋白的晶体结构揭示了 C 端的 WD40 结构域对于自抑制状态的维持也起到 非常重要的作用[13]．
目前已经明确 NLRP3 炎症小体的激活需要两 个信号．第一个信号需要激活 NF-κB 转录因子， 从而提高 IL-1b 以及 NLRP3 蛋白的表达水平 ． [33] NLRP3 蛋白组装成炎症小体则需要上述提到的危 险信号作为第二个信号[27]．虽然 NLRP3 蛋白表达 量的提高有利于炎症小体的激活，但有研究表明， 短暂地刺激 Toll 样受体(信号 1)，在不引起 NLRP3 表达水平提高的情况下，也足以使得 NLRP3 炎症 小体被 ATP 激活 ． [34] 在第二信号过程中，K63 去 泛素酶 BRCC3 能移除 NLRP3 蛋白 LRR 结构域上 的泛素链，该去泛素化作用对 NLRP3 炎症小体的 激活是需要的，但其具体的分子机制尚不明确[35]．
Perspectives 前沿评述
生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biophysics 2014, 41(10): 1056~1062
凋亡小体与炎症小体：Caspase 蛋白酶的激活平台
柴继杰 ＊ 施一公 ＊
(清华大学生命科学学院，清华北大联合中心，北京 100084)
·1057·
死亡调节信号分子 死亡调节信号分子受体
细胞膜
FADD
线粒体
信号通路1-—-Apoptosis
信号通路1-—-Apoptosis信号通路1 —ApoptosisApoptosis凋亡的启动由激活机制紧密调节，因为⼀旦凋亡开始，其不可避免地导致细胞死亡。
⽐较清楚的两个激活机制分别是内源性途径（也称为线粒体途径）和外源性途径。
⼀、内源性途径：线粒体是多细胞⽣命所必需的。
没有他们，细胞停⽌有氧呼吸，迅速死亡。
线粒体蛋⽩ SMACs (second mitochondria-derived activator of caspases) 随着线粒体膜渗透性的增加被释放到细胞质中，与抑制凋亡蛋⽩(IAPs，inhibitors of apoptosis proteins)结合，使IAPs失活，促进凋亡。
细胞⾊素c在线粒体凋亡诱导通道（MAC）形成后也从线粒体释放到线粒体外膜中，细胞⾊素c被释放后，与凋亡蛋⽩酶激活因⼦-1（Apaf-1）和ATP结合，然后ATP 结合pro-caspase-9产⽣⼀种蛋⽩质复合物，被称为凋亡体。
然后召集并激活caspase-3，进⽽引发caspases级联反应，导致细胞凋亡。
⼆、外源性途径：1. TNF pathTNF-α是主要由活化的巨噬细胞产⽣的细胞因⼦。
⼈体中的⼤多数细胞具有两种TNF-α受体：TNFR1和TNFR2。
TNF-α与TNFR1的结合通过中间膜蛋⽩TRADD（TNF receptor-associated death domain）和FADD（Fas-associated death domain protein）来活化caspase通路。
这些活化的caspase可将细胞内的重要蛋⽩降解，引起细胞凋亡。
TNFR1的信号传导也可能以不依赖caspase的⽅式诱导细胞凋亡。
2. Fas pathFas受体（也称为Apo-1或CD95）是结合Fas配体（FasL）的TNF家族的跨膜蛋⽩。
Fas和FasL相互作⽤导致死亡诱导信号转导复合物（DISC）的形成，其包含FADD，caspase-8和caspase-10。
细胞凋亡的原理及不同信号通路
细胞凋亡概念细胞凋亡(apoptosis)是指为维持内环境稳定，在一定的条件下，细胞遵循固细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
从形态学上看，细胞凋亡是一变化的过程。
首先细胞变圆，随即与周围细胞脱离；细胞失去微绒毛，胞浆浓缩，内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，核染色质密度增高，凝聚在核膜周边；然后核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体聚集在一起，被反折的细胞膜包围。
从外观上看，细胞表面产生了许多泡状或芽状突起；接着这些突起逐渐分隔，形成单个的凋亡小体(apoptotic body)；最后凋亡小体被邻近的正常细胞吞噬并消化。
细胞凋亡过程中有一些标志性的生物化学变化：细胞膜上的磷脂酰丝氨酸(PS)由膜内侧面翻到外侧面；胞质内蛋白酶活化，发生级联反应，同时有能量消耗、新基因转录或蛋白质合成等变化；细胞核内染色质DNA被核酸酶酶切成以核小体180～200bp为重复单位的片段，如果将从凋亡细胞中提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，会形成梯状的DNA条带(DNA ladder)。
从细胞功能上看，细胞凋亡对多细胞生物体具有重要的意义。
一方面在生物发育过程中细胞凋亡可以清除没有功能的、不需要的、不正常的和有害的细胞，优化组织器官的结构和细胞数目，确保正常个体发育。
另一方面在生物体整个生命过程中，每天都会产生许多功能异常的细胞，如癌变细胞、衰老细胞、被微生物侵袭的细胞等。
细胞凋亡可以将这些细胞清除，并且由新诞生的功能正常的细胞替换。
因此，体内细胞的诞生和死亡处于动态平衡，从而维持机体组织器官中细胞数量稳定和功能正常。
细胞凋亡信号转导通路细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化(Caspase)→进入连续反应过程。
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含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)：
是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶。它们的活性位点均包含半胱 氨酸残基，能够特异性的切割靶蛋白天冬氨酸残基上的肽键，细胞生长、 3. 分化与凋亡 作用机理：caspase负责选择性地切割某些蛋白质，从而造成细胞凋亡。
Caspase家族蛋白酶的识别序列及作用底物
蛋白酶 caspase 1 caspase 4 caspase 5 mICH3 mICH4 caspase 2 caspase 9 caspase 3 caspase 6 caspase 7 caspase 8 caspase 10 caspase 11 CED-3 别名 ICE TX, ICH-2, ICErel-II ICErel-III, TY 序列 底物 YVAD pro-IL-1b , pro-caspase 3, pro-caspase 4 pro-caspase 1
Caspase家族蛋白酶的结构特征
Caspase家族蛋白酶的同源性 Caspase-1亚族：
Caspase-2亚族：
Caspase-1、4、5、11； Caspase-2、9； Caspase-3、6、7（细胞凋亡执行者）、8、10。
Caspase-3亚族：
Caspase蛋白酶在细胞凋亡中的活化顺序 分类：
接收 转导 效应
细胞外途径
细胞内途径
细胞内途径：
由线粒体介导的内源 性凋亡通路是哺乳动 物细胞程序性死亡的 主要途径。 凋亡刺激-死亡促进因 子（DPF），包括细 胞色素C、凋亡诱导 因子（AIF）、促死 亡蛋白、 caspase酶 原的释放-dATP、 ATP存在下活化 caspase-细胞凋亡。
Caspase-2：
细胞发生凋亡时，48kDa的caspase-2先被一种caspase-3样蛋白酶在Asp316 剪切成p33和p14，然后再缓慢地在Asp152和Asp330处剪切为p18和p12组成的 活性蛋白酶，后一过程要在2~3h后才能完成。caspase-2可能参与CTL细胞的杀 伤作用，但它并不能被颗粒酶B直接活化，必须被一种caspase-3样蛋白酶活化。
Caspase蛋白酶在死亡受体介导的细胞凋亡中起着中心的作用
1. Fas与配体结合而活化后， 2. 引起YVAD和zVAD敏感 的ICE家族蛋白酶活化， 3. 活化DEVD敏感的蛋白酶。 其中caspase-8是这一凋 亡过程中首先被活化的 ICE家族蛋白酶。 4. Caspase-8活化后， ① 剪切活化caspase-3、 caspase-7、 caspase-4、 caspase-9和 caspase-10，通过 这些蛋白酶剪切底物 使凋亡得以进行； ② 活性被CrmA所抑制， 籍此可作为细胞凋亡 负调控因素作用的环 节。
Caspase蛋白酶家族 Caspase-8：
在caspase-8发现之前，人们虽然知道多种细胞膜外的因素可以引起细胞凋亡， 而且知道caspase家族蛋白是这种细胞凋亡过程中的效应物质，但对凋亡信号如 何由细胞膜外转递到细胞浆，并如何引起caspase蛋白酶活化的过程却知之甚少 。含有死亡结构域的胞浆信号蛋白的发现，证明死亡信号是通过这些蛋白质向胞 浆内部传递，并最终引起caspase蛋白酶的活化的。caspase-8的分布很广泛， 在许多胚胎和成人组织中都有分布。颗粒酶B可以活化caspase-8，活化后可以 剪切PARP。乳腺癌细胞系MCF7转染caspase-8基因后出现凋亡，这种作用可 以被z-VAD fmk所阻断。当活性中心的半胱氨酸被突变后，caspase-8失去促凋 亡的作用。
Caspase蛋白酶家族 Caspase-7（Mch3，ICE-LAP3，CMH1）：
caspase-7包含304aa，分子量35kD，caspase-7是与caspase-3同源性最高 的成员，有58%的同源性，与其它caspase有35%的同源性。caspase-7与 caspase-3的同源区主要在具有酶活性的亚单位区，它也保留了 QACRG(184~188)五肽活性中心，与底物结合的氨基酸残基也都存在。 caspase-7可以分别在Asp23~Ala24、Asp198~Ser199和Asp206~Ala207之间 被剪切，形成P20/P12形式的caspase-7。caspase-7分布很广泛，在脑中也有 少量存在。用抗caspase-7的单抗发现caspase-7在Jurkat细胞中主要分布于胞 浆和近膜结构中，细胞核中未见分布。 用caspase-7基因转染乳腺癌细胞系发现全长蛋白不能引起细胞凋亡，但去除氨 基端53aa (其中包括原结构域)的caspase-7则可以引起细胞凋亡。进一步研究 证明去除原结构域的caspase-7具有自催化作用，可以自动催化成P10/P12形式 。酶活性中心的半胱氨酸对caspase-7的这种作用十分重要，突变为Ala后就失 去致凋亡作用。当Fas和TNF引起的细胞凋亡时细胞内caspase-7也被活化， CrmA可以阻断caspase-7引起的细胞凋亡。caspase 7不能剪切pro-IL-1 ， 但它可以剪切PARP和固醇调节元件，caspase-7对PARP的剪切可以被DEVDCHO所阻断，但不能被ICE敏感的YVAD-CHO所阻断。caspase- 7对DEVDCHO抑制剂的敏感性只有caspase-3的1/3，对CrmA则很不敏感。
Caspase蛋白酶家族 Caspase-1(ICE)， IL-1 转化酶(IL-1 converting enzyme)：
是单核细胞合成的一种蛋白酶，可以将34kD的IL-1 前体剪切为17kD的成熟IL-1， 这对于IL-1活性发挥是必须的。不表达ICE细胞系转化IL-1 基因后可产生pro-IL-1 ，但不能分泌有活性的成熟IL-1；ICE特异性抑制剂可以阻断金黄色葡萄球菌刺激 引起的IL-1的分泌。ICE属于半胱氨酸蛋白酶，活性中心有高活性的巯基，对氧化 剂很敏感，但对丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶的抑制剂不敏感。
细胞外途径：
细胞死亡信号蛋白盘 绕粘附到它的同源细 胞表面接收器上，死 亡配体与其受体结合， 导致其死亡结构域相 互积聚，并与转接器 分子的死亡结构域相 互结合，使死亡受体 分子活化。导致细胞 内pro- caspase 局 部聚集，FADD与募 集的pro- caspase 8地DED（长原域中 包含的死亡效应域结 合形成信号复合物， 使pro- caspase -8 自我水解、活化，形 成活性caspase -8。 激活的caspase -8激 活下游caspase，引 起细胞凋亡。
Caspase-3：
1994年Fernandez-Alnemri等在BenBank表达序列标记(expression sequence tag, EST)数据库中找到一段ICE/CED-3活性中心同源的序列，用它合成探针后，为32kD的半胱氨酸蛋白酶而称之为CPP32(cysteine protease protein, 32kD) 。随后，其它学者独立地将这一蛋白基因克隆出来，并分别命名为prICE、 apopain(凋亡素)和Yama(印度传说中的死亡之神)。1996年这种蛋白酶被命名 为caspase-3。现在一般认为caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶 ，也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分。
信号通路 caspase信号通路 Caspase与细胞凋亡 前景与展望
信号通路（signal pathway） ： 分类：
当细胞里要发生某种反应时，信号从细胞外到细胞内传递了一种信息，细胞要根 据这种信息来做出反应的现象，叫做信号通路。
1. 当信号分子是胆固醇等脂质时：可以轻易穿过细胞膜，在细胞质内与目的受 体相结合； 2. 当信号分子是多肽时：只能与细胞膜上的蛋白质等受体结合，这些受体大都 是跨膜蛋白，通过构象变化，将信号从膜外域传到膜内域，然后再与下一级 别受体作用，通过磷酸化等修饰化激活下一级别通路。
Caspase-9（ICE-LAP6）：
编码414aa，分子量46kD。序列分析表明它也属于ICE/CED-3家族，在相当于 ICE活性部分的序列中，caspase-9与其它成员有30%左右的同源性，它的原结 构域很长，与caspase-3相似。在caspase-9中与结合底物有关的6个氨基酸残 基都得到了保留，但它的酶活性中心的五肽序列与其它ICE/CED-3蛋白酶的 QACRT不同，是QACGG，这是继caspase-8的QACQG之后出现的另一种活 性中心变异，这种变异也不影响蛋白酶的酶切活性。
在正常的细胞内，每一种caspase都是以非活性状态存在的，这种非活性 的caspase称作酶原（zymogen），它是酶的非活性前体，其肽链比有活 性时长一些，将多出的部分切除，就转变成有活性的caspase。
Caspase家族蛋白酶的识别序列及作用底物
Caspase家族蛋白酶的结构特征 Caspase家族蛋白酶的同源性 Caspase蛋白酶在细胞凋亡中的活化顺序 Caspase蛋白酶在死亡受体介导的细胞凋亡 中起着中心的作用 Caspase蛋白酶家族
Caspase蛋白酶家族 Caspase-4：
caspase-4基因定位于人染色体11q22.2-22.3，所编码的蛋白包含377aa，分子 量约43kD，一级结构与ICE有53%的同源性，在切除104aa的原结构域后同源性 更高达60%，所有与酶活性中心(QACRG)和与结合底物有关的氨基酸残基都得 到了保留。虽然caspase 4与ICE高度同源，但它并不能催化pro-IL-1 为成熟 分子，但可以活化ICE前体及其自身的前体。caspase 4不能剪切DNA-PK，ICE 敏感的抑制剂YVAD-CHO可以阻断caspase 4的活性，但其敏感性仅为ICE的 1/20。caspase-4的活性形式也是由P20和P10两种亚基组成。
Caspase-5：