烟草植物组织培养 (1)

烟草植物组织培养实验
一实验目的学习和掌握植物组织培养技术，理解植物细胞的全能性。

二实验原理
植物组织培养是从20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。

由于其拥有占地少、繁殖系数大等特点，现以在全世界的园林植物尤其是花卉的种苗繁育上得到广泛应用。

本文着重介绍组织培养技术的理论原理、操作过程、生产技术以及经济核算等方面的内容，使大家对组织培养在园林植物尤其是花卉的种苗繁育的应用有所了解，为以后的实际操作提供依据。

在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。

从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。

①起动期是指细胞准备进行分裂的时期。

用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。

起动期是通过一些刺激因素（如机械损伤、改变光照强度、增加氧等）和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。

机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出现愈伤组织。

在植物组织培养中沿用了愈伤组织这一名词，但是植物组织培养中诱导外植体细胞分裂形成的愈伤组织，大都不是损伤的结果。

外源的生长素类物质对诱导细胞开始分裂效果很好，因此生长素类物质在植物组织培养中得到广泛应用，常用的有生长素（2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、萘乙酸NAA、萘乙酰胺NAD和吲哚乙酸IAA、吲哚丙酸IPA和吲哚丁酸IBA）细胞分裂素（6-苄氨基嘌呤6-BA、6-糠氨基嘌呤（KT）氯吡苯脲（KT-30，CPPU））等。

分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。

处于分裂期的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。

外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的不同而有很大差别。

例如，烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。

分化期是指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。

这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞，等等。

外植体的细胞经过起动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。

如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。

如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地（如2～4周）将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。

愈伤组织的形态发生方式经过起动、分裂和分化期产生的愈伤组织，其中虽然发生了细胞分化，但是并没有器官发生。

只有满足某些条件，愈伤组织的细胞才会发生再分化，产生芽和根，进而发育成完整植株。

愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式（器官发生型）和胚状体方式两种。

不定芽方式是在某些条件下，愈伤组织中的分生细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。

胚状体方式是由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。

这种由愈伤组织中的薄壁细胞不经过有性生殖过程，直接产生类似于胚的结构，叫做胚状体。

在植物组织培养中，不定芽方式和胚状体方式是愈伤组织形态发生的两种最常见和最重要的方式。

胚状体方式比不定芽方式有更多的优点，如胚状体产生的数量比不定芽多，胚状体可以制成人工种子，等等。

培养基的主要指标为营养的组分，植物生长物质的浓度，特别是后者对外植体的分化起着极其重要的作用。

培养基的组织成分主要包括：1. 矿质营养。

矿质营养又叫无机营养，
是指植物在生长发育的过程中所需要的各种化学元素，其中包括大量的元素如N、P、K和微量元素如Fe、B、Mn、Zn、Cu等，其对植物的生长发育中有着重要的生理作用。

2. 维生素。

维生素能够以辅酶的形式参与多种酶系的反映，直接影响到蛋白质、糖、脂肪等物质的代谢活动。

主要有Vb、Vb1、Vc、Vu、Vb5等。

3. 植物生长物质。

其在较低浓度下能够对植物产生显著生理作用，主要包括：细胞分裂素和生长素。

4. 碳源。

其不仅为外植体提供能量，而且也能维持一定的渗透压。

如果糖、葡萄糖、蔗糖等。

5. 琼脂。

琼脂是组织培养中固体培养基的凝固剂，用来控制培养基的硬度。

6. 辅助添加物。

添加物主要有氨基酸与植物材料，前者包括丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰氨、酪氨酸、天冬酰氨等是主要的有机氮源，有助于外植体的蛋白质合成。

而后者成分十分繁杂，如马铃薯、香蕉、椰乳等，但有助于外植体分化提高繁殖系数。

植物组织培养的培养基种类很多，MS培养基（如表一）是使用最广泛，很多花卉的组织培养均在MS培养基上进行。

此外，在兰花的组织培养中常使用VW培养基。

培养基配方设计是组培法育苗中的关键步骤。

根据理论与实际经验，对不同种类的花卉及不同的取材部位，需设计出相适应的配方，并从中筛选出最佳者。

继代芽增殖培养：很多花卉植物经过2-6 周的培养即可分化出大量的不定芽。

根据情况可以将这些增殖了大量新芽的外植体重新分割进行几代培养，以扩大繁殖规模直至满足繁殖需要为止。

三实验用品
1、每组：1 玻璃烧杯、1玻璃棒、1pH试纸(5.5-9.0) 、培养瓶若干
1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、1个无菌白瓷板
2、公用用品：1/2MS干粉式培养基、冷凝脂、蔗糖、
激素（2,4-D、NAA、6-BA均为1mg/ml）、1N NaOH、1N HCl
蒸馏水、70%酒精、0.01%升汞、
移液器、微波炉、灭菌器、超净工作台、
酒精灯、解剖刀、镊子
四实验材料烟草叶片
五实验内容
1、培养基配置与分装
培养基配置：大量、微量、有机、铁盐
琼指7g/l 搅拌蔗糖30g/l 调节pH为5.8 加热溶解加激素分装50ml/瓶
注意：认真计算由储备液配制成工作液所需添加的各种溶液的量
计算公式：母液吸取量（ml）=待配培养基总量（ml）/母液扩大倍数
MS培养基中加激素的量和组合如下：①MS+2,4D0.5
②MS+6-BA0.1+NAA0.5
③MS+6-BA0.5+NAA0.5
注意：右下角标数值单位为mg/l，添加激素前认真计算激素储备液配制成工作液所需的量计算公式：生长调节物质母液吸取量（ml）=工作液中所需激素浓度（mg/l）/每毫升母液中含激素的量（mg）
2、培养基的灭菌-----高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）
3、无菌苗的获得
4、烟草叶片愈伤组织的诱导和不定芽的分化步骤
于超净台中彻底冲洗外植体；70%酒精消毒3min；无菌水冲洗3遍，每遍3mini；将烟草叶片残留的水分用灭过菌的滤纸吸干；白瓷板上用消毒的解剖刀分割为1-1.5cm2的小块；接入相应的MS培养基上，每瓶接种4-5块。

3、培养与观察
将培养瓶由超净台中转移到光照培养箱，给予适合的条件：26~28℃，光照1000lux~2000lux培养；
观察：取三个时间观察，分别是2~3天；13天；23天。

可从愈伤组织的诱导情况，生长情况观察，还可借助倒置显微镜观察体细胞胚的发育阶段。

例如：①MS+2,4D0.5 沿切口已长出大量白色、疏松呈颗粒状的胚性愈伤组织。

取愈伤组织块置实体显微镜下观察，可发现愈伤组织内含有大量处于不同发育阶段的体细胞胚，如球形胚、心型胚、鱼雷型胚、早子叶胚等。

②MS+6-BA0.1+NAA0.5愈伤组织为黄绿色，其上已分化出许多小苗，具有两片小子叶，类似于典型的种子苗。

显微切片观察证明，这些小苗来源于愈伤组织中的单个胚性细胞，是通过体细胞胚发生途径形成的。

③MS+6-BA0.5+NAA0.5愈伤组织颜色较绿，质地较为致密，已分化出许多从生芽，形态特征与2中的明显不同，这是通过器官发生途径。

数据统计：
烟草叶片愈伤组织诱导情况
编号每瓶接种数愈伤组织诱导率愈伤组织状态染菌率
六实验结果与分析
1、将观察结果加以描述和统计；对出现诱导失败和污染的情况要加以认真分析，找到原因。

2、绘图或照片
七．思考题
1、外植体脱分化形成愈伤组织的过程中，哪些激素起作用？
2、如果时间允许，请设计下游诱导愈伤组织分化和再生植株的实验。

实验三愈伤组织的诱导
一、实验目的
利用植物的快速无性繁殖技术诱导愈伤组织。

二、实验原理
利用附加2,4-D 2mg/L的MS培养基上诱导愈伤组织。

三、实验材料
烟草叶片
四、实验步骤
1、培养基的配制、消毒及各种器皿的消毒灭菌。

2、接种室灭菌：打开紫外灯30min。

3、外植体的选取：取生长良好的烟草幼嫩叶片进行诱导。

4、操作台的消毒：进入接种室前关房间紫光灯，进入后关超净工作台上的
紫光灯，用70%的酒精擦洗超净工作台3-4遍，将双手也用乙醇消毒。

然后在无菌条件下将外植体接种到培养基表面。

5、实验后将工作台面清理干净，各种仪器工具洗净归位。

五、实验结果
由烟草叶片成功诱导出的愈伤组织
实验结果：烟草的愈伤组织形成、发育良好，没有染菌，所配培养基适合烟草形成愈伤组织。

随着愈伤组织的生长，褐色区域也越明显，但对愈伤组织没有什么影响。

愈伤组织的主体呈黄绿色但出现许多绿色的生长端点，这些端点经诱导可形成根或芽。

分数________ 教师___________ 时间__________
实验四芽的诱导
一、实验目的：
了解植物快速无性繁殖技术。

选择适当的培养基诱导不定芽的产生
二、实验原理
配制MS培养基并加入10ml6-BA，2.5mlNAA，作为诱导芽的培养基，用由烟草叶片诱导成功的愈伤组织诱导产生芽。

三、实验步骤
1、实验前的准备：各种器具消毒、灭菌，培养基的配制及消毒，实验材料
的选取。

2、接种室的消毒：接种前一天晚上用过氧乙酸熏蒸灭菌，第二天接种前20分钟打开紫光灯。

3、外植体的消毒：使用无菌苗。

4、进入接种室前关房间紫光灯，进入后关超净工作台上的紫光灯，用70%的酒精擦洗超净工作台3-4遍，将双手也用乙醇消毒。

然后在无菌条件下将愈伤组织生长较好的部位切割下来接种到培养基表面，注意切口面向下。

5、将接种好的培养基置于培养室培养，定期观察记录结果。

6、实验后将工作台面清理干净，各种仪器工具洗净归位。

四、实验结果
由愈伤组织诱导生芽成功后的照片
实验结果：接种后没有被细菌及霉菌污染生长状况良好，发出新芽并有明显的生长。

由图片可以看出，培养基上方芽的生长不是很旺盛，而培养基下方的芽且生长的很旺盛，这是因为在接种幼嫩愈伤组织切块时，由于切块太小难以很好的区分出切面，导致切面没有向下所致。