植物生理学实验-叶绿素a b测定

叶绿素a,b含量测定

［实验目的］熟悉在未经分离的叶绿素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。

［实验原理］在叶绿素a和b的吸收光谱曲线中，红波波长范围内，叶绿素a的最大吸收峰在663nm，叶绿素b的最大吸收峰在645nm。吸收曲线彼此又有重叠。

根据Lambert—Beer定律，最大吸收峰不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与光密度OD之间有如下关系：OD1＝Ca·ka1+Cb·kb1 (1)

OD2＝Ca·ka2+Cb·kb2 (2)

Ca为组分a的浓度（g/L） Cb为组分b的浓度（g/L）

OD1为在波长λ1（即组分a的最大吸收峰波长）时，混合液的光密度OD值。

OD2为在波长λ2（即组分b的最大吸收缝波长）时，混合液的光密度OD值。

ka1，kb1，ka2，kb2分别为组分a，b的比吸收系数，即组分a（b）的浓度为（1g/L）时，其在相应波长（λ1，λ2）时的光密度OD值。

叶绿素A和B的80%丙酮溶液，当浓度为1时，比吸收系数K值如下表：

将表中数值代入上式（1），（2）并整理的：

Ca=0.0127OD663-0.00269OD645

Cb=0.0229OD645-0.00468OD663

若把Ca，Cb的浓度单位从原来的g/L改为mg/L，则上式可改写为下列形式：

Ca=12.7OD663-2.69OD645 (3)

Cb=22.9OD645-4.68OD663 (4)

Ct=Ca+Cb=8.02OD663+20.21OD645 (5)

Ct为叶绿素总浓度，单位为g/L。

利用（3），（4），（5）式即可计算出叶绿素A和B及总叶绿素的浓度（g/L）。

［器材与试剂］

1.实验仪器：高级型分光光度计，离心机，台天平，剪刀，研钵，漏斗，移液管

2.实验试剂：丙酮，碳酸钙

3.实验材料：植物叶片

［实验步骤］

1.色素的提取：取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块，称取0.5G放入研钵中加纯丙酮5ML，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加80%丙酮5ML，将匀浆转入离心管，并用适量80%丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后弃沉淀，上清液用80%丙酮定容至20ML。

2.测定光密度：取上述色素提取液1ml，加80%丙酮4ml稀释和转入比色杯中，以80%丙酮为对照，分别测定663nm，645nm处的光密度值。

3.按公式分别计算色素提取液中叶绿素A，B及叶绿素总浓度。再根据稀释倍数分别计算每克鲜重叶片中色素的含量。

［注意事项］

1.由于植物子叶中含有水分，故先用纯丙酮进行提取，以色素提取液中丙酮的最终浓度近似80%。

2.由于叶绿素A，B的吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差，因此最好能用波长较正确的高级型分光光度计。

［实验作业］

1.试比较阴生植物和阳生植物的叶绿素A和叶绿素B的比值有无不同。

2.分光光度法和比色法有何不同？

3.叶绿素A和叶绿素B在红光区和蓝光区都有最大吸收峰，能否用蓝光区的最大吸收峰波长进行叶绿素A和叶绿素B 的定量分析，为什么？