高效液相色谱的操作步骤及常见问题分析

高效液相色谱的操作步骤及常见问题分析

高效液相色谱的常见问题分析

高效液相色谱仪操作步骤

1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。

2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。

3)．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。

4)．进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。

5)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。

6)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。

7)．设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。

若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。

8)．进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。

9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。

10)．填写登记本，由负责人签字。

注意事项：

1)．流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。

2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。

3)．所有过柱子的液体均需严格的过滤。

4)．压力不能太大，最好不要超过2000 psi

提高HPLC检测限、溶剂脱气等的几点经验

仅针对用反相碳十八烷基硅烷化填料的柱子和紫外检测器的HPLC通常在理论教学时，HPLC分析总要求实用HPLC纯的试剂、用孔径比填料粒度小的微孔滤膜过滤流动相、最好用真空或氦气脱气。实际上，按照不同的精确度，有时候并不需要做得那么严格。这里首先申明，虽然许多做法是我的经验，但请读到这篇文章的朋友自己做个判断，如果按我说的做，造成任何损失，我深表遗憾，但我不承担任何责任。这篇文章仅供交流和讨论。

关于HPLC纯。我想这里关键是两点：纯度高、紫外吸收小。纯度高一方面，没有杂质干扰测定；另一方面不会有金属离子损害纯度为99.99%以上的高纯度硅胶基质。但如果你的HPLC分析的是直接用分析纯试剂制备而没有其他色谱纯溶剂稀释步骤而且是中药之类的dirty sample（脏样品）；那么用自己重蒸的分析纯溶剂也可以了，当然还有一点是紫外吸收也要同时符合要求。这对于黄芩苷一类含量高、紫外吸收大的样品足够了。如果懒得自己重蒸，也可以用些便宜的色谱纯试剂。事实上，据我所知，许多

所谓的色谱纯也是国内制备灌国外品牌的瓶子卖的。水嘛，用去离子水就行了，也就是市售的纯水。水的紫外吸收与甲醇、乙腈相比，小得很，主要考虑不要有金属离子和细菌。不过，千万别买了假的纯水。保险做法，找家大的纯水供应点，买水回来，做一下紫外扫描、做下菌检、再来个水硬度检查，行的话就固定用他的。

滤膜过滤，除非是无机盐，否则我均不过滤，定期把前置的过滤头取下，放稀硝酸里清洗，再用纯水洗至中性就行了。能过过滤头的东西就让它过吧，懒得理它，有人可能会考虑堵塞的问题，没等它堵，我的柱子都会坏了，把柱子前面一点挖了，添上新的，就行了，当然这里操作要小心。至于长菌，能在甲醇里长，我也没办法了。

如果是高压二元梯度泵，用超声脱气就行了。把溶剂瓶放到59kz的超声清洗机超至没有白白的气泡上来就行了。四元的是混合后脱气，比较重要，一般都会配脱气机，我也没用过，不说了。如果是要求检测限很小的分析，有几点建议，首先，如果是等度洗脱，一定要改成单元等度，即流动相混合到一个瓶子里；第二，尽量用乙腈/水系统洗脱，乙腈紫外吸收小，相同条件下，噪音小很多；在前两样都解决不了，那只好通氦脱气了。梯度洗脱，如果像人参皂苷之类的，尽量用乙腈/水系统洗脱，不行就通氦啰。

做了那么久液相，堵塞流路的事情碰过几回，都是无机盐配的缓冲液惹祸，都不关过滤的事。缓冲液换有机相冲柱时，有人一不注意没冲干净无机盐就冲甲醇，结果就塞了。千万要用90%左右的水先冲干净盐。不锈钢管路堵了好办，烘箱烘之，再冲开。柱子堵了，我还没试过。

其实，做HPLC通常担心的是做不出理想的结果和坏柱子。理想的结果，主要的就靠流速精确的和检测限。流速精确才能保证保留时间精确，这与机器性能有关，不谈了。检测限越低就等于色谱峰可以的误差可以越小。根据我的经验，二元等度会使噪音峰高大大增加，所以做等度不要用二元，除非，你的样品峰高远远高于噪音（20倍以上吧）。可以的话，使用乙腈自然比甲醇好。空气的存在也会影响噪音，甚至是出鬼峰，还是那句，不行就通氦啰。additives（添加剂）也要注意，看看添加的三乙胺、乙酸之类的截止波长是多少，低于她的截止波长就是不透过，会极大的增大噪音。

噪音是怎样造成的呢，就是往复泵的脉冲和流动相的基础吸收，用单元泵是为了降低脉冲；用乙腈就是降低基础吸收。物质的紫外吸收系数一般是固定的，降低噪音提高检测限的出发点就是以上两方面了。但是物质在不同的溶剂里，紫外吸收系数是不一样的，有时候添加剂也会影响，特别是酸，乙酸、磷酸、盐酸有时候值得选择一下。保护柱子，就是不要堵了，不要污染。我一般不用保护柱，得不偿失，国内的不能用，国外得太贵。我就两招：用3%乙酸溶液和甲醇二元梯度100%甲醇到10%甲醇，一小时做个来回，柱子耐不了pH10的就用1%乙酸，这东西，降柱压有奇效，目前为止我是百试百灵；另一招就是挖柱填柱了。

1. 涡流扩散（Eddy diffusion）+ q. k5 T' z; k) f% B1 i! R0 A

原因和解决方法：流动相碰到较大的固体颗粒，就像流水碰到石头一样产生涡流。如果柱装填得不均匀，有的部分松散或有细沟，则流动相的速度就快；有的部位结块或装直紧密则流就慢，多条流路有快有慢，就使区带变宽。因此，固相载体的颗粒要小而均匀，装柱要松紧均一，这样涡流扩散小，柱效率高。

2. 分子扩散（Molecular diffusion）

原因和解决方法：分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动，也称纵向分子扩散。要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱。同时在操作时，如果流速太慢，被分离物质停留时间长，则扩散严重。4 V6 J4 t% 3. 质量转移（Mass transfer）* b& |- V. U) c7 A( P