高效液相色谱的操作步骤及常见问题分析

高效液相色谱的操作步骤及常见问题分析

高效液相色谱的常见问题分析

高效液相色谱仪操作步骤

1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。

2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。

3)．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。

4)．进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。

5)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。

6)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。

7)．设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。

若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。

8)．进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。

9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。

10)．填写登记本，由负责人签字。

注意事项：

1)．流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。

2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。

3)．所有过柱子的液体均需严格的过滤。

4)．压力不能太大，最好不要超过2000 psi

提高HPLC检测限、溶剂脱气等的几点经验

仅针对用反相碳十八烷基硅烷化填料的柱子和紫外检测器的HPLC通常在理论教学时，HPLC分析总要求实用HPLC纯的试剂、用孔径比填料粒度小的微孔滤膜过滤流动相、最好用真空或氦气脱气。实际上，按照不同的精确度，有时候并不需要做得那么严格。这里首先申明，虽然许多做法是我的经验，但请读到这篇文章的朋友自己做个判断，如果按我说的做，造成任何损失，我深表遗憾，但我不承担任何责任。这篇文章仅供交流和讨论。

关于HPLC纯。我想这里关键是两点：纯度高、紫外吸收小。纯度高一方面，没有杂质干扰测定；另一方面不会有金属离子损害纯度为99.99%以上的高纯度硅胶基质。但如果你的HPLC分析的是直接用分析纯试剂制备而没有其他色谱纯溶剂稀释步骤而且是中药之类的dirty sample（脏样品）；那么用自己重蒸的分析纯溶剂也可以了，当然还有一点是紫外吸收也要同时符合要求。这对于黄芩苷一类含量高、紫外吸收大的样品足够了。如果懒得自己重蒸，也可以用些便宜的色谱纯试剂。事实上，据我所知，许多

所谓的色谱纯也是国内制备灌国外品牌的瓶子卖的。水嘛，用去离子水就行了，也就是市售的纯水。水的紫外吸收与甲醇、乙腈相比，小得很，主要考虑不要有金属离子和细菌。不过，千万别买了假的纯水。保险做法，找家大的纯水供应点，买水回来，做一下紫外扫描、做下菌检、再来个水硬度检查，行的话就固定用他的。

滤膜过滤，除非是无机盐，否则我均不过滤，定期把前置的过滤头取下，放稀硝酸里清洗，再用纯水洗至中性就行了。能过过滤头的东西就让它过吧，懒得理它，有人可能会考虑堵塞的问题，没等它堵，我的柱子都会坏了，把柱子前面一点挖了，添上新的，就行了，当然这里操作要小心。至于长菌，能在甲醇里长，我也没办法了。

如果是高压二元梯度泵，用超声脱气就行了。把溶剂瓶放到59kz的超声清洗机超至没有白白的气泡上来就行了。四元的是混合后脱气，比较重要，一般都会配脱气机，我也没用过，不说了。如果是要求检测限很小的分析，有几点建议，首先，如果是等度洗脱，一定要改成单元等度，即流动相混合到一个瓶子里；第二，尽量用乙腈/水系统洗脱，乙腈紫外吸收小，相同条件下，噪音小很多；在前两样都解决不了，那只好通氦脱气了。梯度洗脱，如果像人参皂苷之类的，尽量用乙腈/水系统洗脱，不行就通氦啰。

做了那么久液相，堵塞流路的事情碰过几回，都是无机盐配的缓冲液惹祸，都不关过滤的事。缓冲液换有机相冲柱时，有人一不注意没冲干净无机盐就冲甲醇，结果就塞了。千万要用90%左右的水先冲干净盐。不锈钢管路堵了好办，烘箱烘之，再冲开。柱子堵了，我还没试过。

其实，做HPLC通常担心的是做不出理想的结果和坏柱子。理想的结果，主要的就靠流速精确的和检测限。流速精确才能保证保留时间精确，这与机器性能有关，不谈了。检测限越低就等于色谱峰可以的误差可以越小。根据我的经验，二元等度会使噪音峰高大大增加，所以做等度不要用二元，除非，你的样品峰高远远高于噪音（20倍以上吧）。可以的话，使用乙腈自然比甲醇好。空气的存在也会影响噪音，甚至是出鬼峰，还是那句，不行就通氦啰。additives（添加剂）也要注意，看看添加的三乙胺、乙酸之类的截止波长是多少，低于她的截止波长就是不透过，会极大的增大噪音。

噪音是怎样造成的呢，就是往复泵的脉冲和流动相的基础吸收，用单元泵是为了降低脉冲；用乙腈就是降低基础吸收。物质的紫外吸收系数一般是固定的，降低噪音提高检测限的出发点就是以上两方面了。但是物质在不同的溶剂里，紫外吸收系数是不一样的，有时候添加剂也会影响，特别是酸，乙酸、磷酸、盐酸有时候值得选择一下。保护柱子，就是不要堵了，不要污染。我一般不用保护柱，得不偿失，国内的不能用，国外得太贵。我就两招：用3%乙酸溶液和甲醇二元梯度100%甲醇到10%甲醇，一小时做个来回，柱子耐不了pH10的就用1%乙酸，这东西，降柱压有奇效，目前为止我是百试百灵；另一招就是挖柱填柱了。

1. 涡流扩散（Eddy diffusion）+ q. k5 T' z; k) f% B1 i! R0 A

原因和解决方法：流动相碰到较大的固体颗粒，就像流水碰到石头一样产生涡流。如果柱装填得不均匀，有的部分松散或有细沟，则流动相的速度就快；有的部位结块或装直紧密则流就慢，多条流路有快有慢，就使区带变宽。因此，固相载体的颗粒要小而均匀，装柱要松紧均一，这样涡流扩散小，柱效率高。

2. 分子扩散（Molecular diffusion）

原因和解决方法：分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动，也称纵向分子扩散。要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱。同时在操作时，如果流速太慢，被分离物质停留时间长，则扩散严重。4 V6 J4 t% 3. 质量转移（Mass transfer）* b& |- V. U) c7 A( P

原因和解决方法：被分离物质要在流动相与固定相中平衡，这样才能形成较窄的区带。在液相色谱中，溶质分子要在两个液相之间进行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的时间。当流速快时，转移速度慢，来不及达到平衡动相就向前移，这各物质的非平衡移动，使区带变宽。

4. 动相流速

原因和解决方法：当流速太低时，分子扩散严重，特别是在气相色谱中尤为突出。如将理论塔板高度对流速作图，理论塔板高度随流速增加而急速下降，当达到最低值时，流速再加大则质量转移起主要作用，理论塔板高度又加大。在高效液相色谱中，流速稍快影响不大，但在凝胶过滤色谱中，因为物质要渗透到凝胶内部，所以质量转移影响大，流速加大会降低柱效率。

5. 固定相颗粒太小

原因和解决方法：固定相颗粒越小柱效率越高，对流动相流动的阻力越大，需要加大压力才能使它流动。# y& A, `! L- h3 U4 W: w

6. 峰拖尾) O* h4 K7 t) z9 g' V2 A

原因和解决方法：1 I$ P/ C4 j' q+ b3 T' ~

（1）筛板阻塞，反冲色谱柱，更换进口筛板，更换色谱柱；

（2）色谱柱塌陷，填充色谱柱；

（3）干扰峰，使用更长的色谱柱，改变流动相或更换色谱柱；

（4）流动相PH选择错误调整PH值。对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰；3 {

（5）样品与填料表面的溶化点发生反应，加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂，更改色谱柱。

7. 峰分叉

原因和解决方法：" k9 y# Q' b1 r6 Z% L2 G, z

（1）保护柱或分析柱污染，取下保护柱再进行分析，如果必要更换保护柱，如果分析柱阻塞，拆下来清洗，如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施，如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱，

（2）样品溶剂不溶于流动相，改变样品溶剂，如果可能采取流动相作为样品溶剂。8. 早出的峰变形 1 O5 y& q0 M _! `/ m

原因和解决方法：7 d; N: S1 P' P. P1 v3 L

样品溶剂选择不恰当，减少进样体积，运用低极性样品溶剂。

9. 早出的峰拖尾程度大于晚出的峰

原因和解决方法：

柱外效应，调整系统连接（使用更短、内径更小的管路），使用小体积的流通池。0 j( e$ {+ L! [# V

10. K增加时，脱尾更严重

原因和解决方法：7 }2 B# S: m, S) k1 |5 d( r

（1）二级保留效应，反相模式，加入三乙胺（或碱性样品），加入乙酸（或酸性样品），加入盐或缓冲剂（或离子化样品），更换一支柱子；9 k8 o4 @- `3 d

（2）二级保留效应，正相模式，加入三乙胺（或碱性样品），加入乙酸（或酸性样品），加入水（或多官能团化合物），试用另一种方法；

（3）二级保留效应，离子对，加入三乙胺（或碱性样品）。C- L; }2 m6 Y

11. 酸性或碱性化合物的峰拖尾 * L+ b9 e! l& J0 W+ v* ^/ Q

原因和解决方法：6 n- f- A3 E( i5 Y( p, g. Q; V! ~

缓冲不合适，使用浓度50-100mM的缓冲液，使用Pka等于流动相PH值的缓冲液。$ Z0 \* T; N% a% S/ P! ~

12. 额外的峰

原因和解决方法：" r6 p) b$ W' O

（1）样品中有其他组份，正常；

（2）前一次进样的洗脱峰，增加运行时间或梯度斜率，提高流速；

（3）空位或鬼峰，检查流动相是否纯净，使用流动相作为样品溶剂，减少进样体积。

13. 保留时间波动 % m: q! f6 Q" S" @) k% V

原因和解决方法

（1）温控不当，调好柱温；8 }0 F0 `2 B$ U* G/ w

（2）流动相组分变化，防止变化（蒸发、反应等）；% L' O7 V8 P1 @4 p/ A

（3）色谱柱没有平衡，在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱。

4. 保留时间不断变化

原因和解决方法：

（1）流速变化，重新设定流速；" }8 j: z1 W% ~4 q% @, Z

（2）泵中有气泡，从泵中除去气泡；

（3）流动相选择不恰当，更换合适的流动相，选择合适的混合流动相。

15. 基线漂移

原因和解决方法：; A$ w8 i# i* d' b4 b& t, i

（1）柱温波动，（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动，通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器），控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器图；

（2）流动相不均匀，（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移），使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气；（3）流通池被污染或有气体，用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池，如有需要，可以用1N的硝酸不要用盐酸）；

（4）检测器出口阻塞，（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线），取出阻塞物或更换管子，参考检测器手册更换流通池窗；7 k. [9 y: S+ l& e- M+ M) z

（5）流动相配比不当或流速变化，更改配比或流速，为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速；2 q R' x& x1 S# ~

（6）柱平衡慢，特别是流动相发生变化时，用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗；. y% D6 F7 \" （7）流动相污染、变质或由低品质溶剂配成，检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及HPLC 级的溶剂；

（8）样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线，使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子；7 c/ B% Z' E! T/ ]2 W5 _- d

（9）使用循环溶剂，但检测器未调整，重新设定基线，当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相；

（10）检测器没有设定在最大吸收波长处，将波长调整至最大吸收波长处。5 j) J916. 基线噪音（规则的） % L# z3 {: }* T1 G$ B

原因和解决方法：

（1）在流动相、检测器或泵中有空气，流动相脱气，冲洗系统以除去检测器或泵中的空气；

（2）漏液，检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音，如有必要，更换泵密封；

（3）流动相混合不完全，用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂；9 M- d, r5（4）温度影响（柱温过高，检测器未加热），减少差异或加上热交换器；' O! （5）在同一条线上有其他电子设备断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正；

（6）泵振动，在系统中加入脉冲阻尼器。

17. 基线噪音（不规则的）& W( ]8 K7 {7 Q$ x

原因和解决方法：

（1）漏液，检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音，如有必要，更换密封，检查流通池是否漏液；

（2）流动相污染、变质或由低质溶剂配成，检查流动相的组成；2 ^+ u8 |! F: （3）流动相各溶剂不相溶，选择互溶的流动相；, O; Z& j: R+ p, @- x

（4）检测器/记录仪电子元件的问题，断开检测器和记录仪的电源，检查并更正；（5）系统内有气泡，用强极性溶液清洗系统；

（6）检测器内有气泡，清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器；% p6 （7）流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音），用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池；

（8）检测器灯能量不足，更换灯；9 K1 d5 {4 j$ \; M7 M- ?

（9）色谱柱填料流失或阻塞，更换色谱柱；

（10）流动相混合不均匀或混合器工作不正常，维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置。 * v4 B+ `* E" g; ~9 w S% f

18. 宽峰9 p+ u( C, z6 n r5 V! d

原因和解决方法：" h3 m* w( m, _

（1）流动相组成变化，重新制备新的流动相；

（2）流动相流速太低，调节流速；7 [& u p+ _5 Y

（3）漏液（特别是在柱子和检测器之间），检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音，如果必要更换密封；, Q# F/ K6 f) d* j4 x, （4）检测器设定不正确，调整设定；! r# R* v& @: g/ L

（5）柱外效应影响，柱子过载，检测器对反应时间或池体积响应过大，柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大，记录仪响应时间太长，小体积进样（例如：10ul而不是100ul）以1：10或1：100的比例稀释样品，减少响应时间或使用更小的流通池，使用内径为0.007-0.01的短管路，减少响应时间；

（6）缓冲液浓度太低，增加浓度；

（7）保护柱污染或失效，更换保护柱；

（8）色谱柱污染或失效，塔板数较低，更换同样类型的色谱柱，如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子；

（9）柱入口塌陷，打开柱入口，填补塌陷或更换柱子；

（10）呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰，选择其它类型的色谱柱以改善分离效果；- |$ P! S$ q; Y3 z

（11）柱温过低，提高柱温，除非特殊情况，温度不宜超过75℃12、检测器时间常数太大，使用较小的时间常数；

19. 分离度降低

原因和解决方法：

（1）流动相污染或变质（引起保留时间变化），重新配置流动相；

（2）保护柱或分析柱阻塞图，去掉保护柱进行分析，如果必要则更换保护柱，如果分析柱阻塞，可进行反冲，如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序，如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。

20. 所有的峰面积都太小

原因和解决方法：

（1）检测器衰减设定过高，减少衰减的设定；1 ^; q: ~" l( Z% B: U

（2）检测器时间常数设定太大，设定较小的时间常数；

（3）进样量太少，增大进样量；q6 i) ~( o8 W

（4）记录仪连接不当，使用正确的连接。) a' A/ w; F( {/ [5 Z; U9 d9 ~# h21. 所有的峰面积都太大+ \( T6 N$ j$ f. I# B

原因和解决方法：

（1）检测器衰减设定过低，采取较大的衰减；" E, Y8 s- G+ q( Z; @! [* w

（2）进样过多，减少进样量；

（3）记录仪连接不正确，正确连接记录仪。

问:用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在？如何解决？

答:关于漂移问题：

1．温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定

2．流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等

3．柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡

关于快速变化问题

1．流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定

2．泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。

3．流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合

问:液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？

答: 1．筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。2．存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子问：HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法

答: 1．样品量不足，解决办法为增加样品量

2．样品未从柱子中流出。可根据样品的化学性质改变流动相或柱子

3．样品与检测器不匹配。根据样品化学性质调整波长或改换检测器

4．检测器衰减太多。调整衰减即可。

5．检测器时间常数太大。解决办法为降低时间参数

6．检测器池窗污染。解决办法为清洗池窗。

7．检测池中有气泡。解决办法为排气。

8．记录仪测压范围不当。调整电压范围即可。

9．流动相流量不合适。调整流速即可。

10．检测器与记录仪超出校正曲线。解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。问：做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？如何解决？

答：原因可能有：

1．泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；

2．比例阀失效，更换比例阀即可；

3．泵密封垫损坏，更换密封垫即可；

4．溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；

5．系统检漏，找出漏点，密封即可；

6．梯度洗脱，这时压力波动是正常的。

问：我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？

答：柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。

1．拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；2．把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；

3．将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。这时，如果柱压仍不下降，再检查；4．更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。

一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE 提供的Rheodyne

7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。

色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外），可能的原因有如下几点：

（1）、色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；

（2）、色谱柱头的填料被样品污染；

（3）、色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出；

（4）、流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。

解决办法如下：

（1）、如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在10％的稀硝酸内超声清洗10分钟，后再用纯水超声10分钟，重新装入色谱柱。

（2）、如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。

（3）、如确定定是盐结晶，用10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换

高浓度甲醇。

（4）、如果因PH值使用不当，很难恢复。

问：用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在?如何

解决?

答：关于漂移问题：?

1温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定

2流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等

3柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡

关于快速变化问题?

1流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定

2泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。

3流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合

问：液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?

答：1筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。

2存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子

问：液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么?

答：1筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。

2存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子

问：从那些方面可以简单判别毛细管柱子的热稳定性好坏?

答：1分配容量(或容量因子)K，好的柱子在高温运行后，分配容量K不应有明显的下降，否则，说明柱子的热稳定性不好。

2理论塔板数n，热稳定性好的柱子经受高温后，理论塔板数应基本保持恒定

3柱子的极性。热稳定性好的柱子，高温前后极性变化不大，具体表现为保留指数I值没有大的变化。

4噪声。热稳定性好的柱子在高温下使用后，噪声不能增加.

5柱子的去活层，毛细管柱子涂固定液前内部一般要用去活性试剂去活以增加惰性。质量好的毛细管柱子高温后，去活层不应该变化，表现在对强极性样品或酸碱性样品的吸附性不能增加。

问：HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法

答：1样品量不足：解决办法为增加样品量

2样品未从柱子中流出：可根据样品的化学性质改变流动相或柱子

3样品与检测器不匹配：根据样品化学性质调整波长或改换检测器

4检测器衰减太多：调整衰减即可。

5检测器时间常数太大：解决办法为降低时间参数

6检测器池窗污染：解决办法为清洗池窗。

7测池中有气泡：解决办法为排气。

8记录仪测压范围不当：调整电压范围即可。

9流动相流量不合适：调整流速即可。

10检测器与记录仪超出校正曲线：解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。问：做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在?如何解决?

答：原因可能有：?

1泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；

2比例阀失效，更换比例阀即可。

3泵密封垫损坏，更换密封垫即可。

4溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；

5系统检漏，找出漏点，密封即可。

6梯度洗脱，这时压力波动是正常的。

问：我购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么?

答：柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。

1拆去保护柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；2把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查。3将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，(此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动性)。这时，如果柱压仍不下降，再检查；

4更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明你的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进样器与保护

柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的Rheodyne 7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。

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