9蛋白质的化学修饰全解
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内容提要
化学修饰的原理 化学修饰的方法学 蛋白质侧链的修饰 蛋白质肽链的交联 亲和标记
蛋白质化学修饰的应用
（第九讲）
三、羧基的修饰
用水溶性碳二亚胺作催化剂，通过胺专一地修饰蛋白质中的羧 基。
O ENZ C O
NR
+
C
+
O
+ H+
ENZ C O C
N R
NHR NHR
+
H
碳二亚胺
O ENZ C O C NHR NHR
+
ICH2COO-
pH=8.5
ห้องสมุดไป่ตู้
ENZ NH CH2COO- + I- + H+
（二）2类试剂能与巯基形成对酸稳定的衍生物，而与其它基团 H 形成的产物则对酸不稳定。 O
O
H C C
ENZ SH + 半胱氨酸
NCH2CH3 O
pH ﹥5
副反应：
ENZ NH2
马来酸酐
O NCH2CH3 O
ENZ S C C O H
N ENZ
O N C OCH2CH3
焦碳酸二乙酯
CH3CH2OH +CO2
+
焦碳酸二乙酯能使咪唑环上的一个氮原子羧乙基化.
应注意 的问题
该试剂在水介质、高pH下不稳定，迅速水解为CO2和乙醇。 试剂大大过量时可与咪唑环上的两个氮都作用，形成双取代 衍生物。
羟胺可使反应可逆进行，回收组氨酸。
N ENZ
用碘乙酸烷化组氨酸 残基可得单取代或双 取代衍生物。
H N C O
+
N
+
ICH2COO碘乙酸
+ ICH2COO
N
N
CH2COO-
1-羧乙基组氨酸
H N C O
N CH2COO-
1，3-二羧乙基组氨酸
N CH2COO-
3-羧乙基组氨酸
H N ENZ N
O
+
O O
C O CH2CH3 pH 4～7 C O CH2CH3
+ O2N
-OOC
S
S
NO2 COO-
pH ﹥6.5
DTNB
ENZ S
甲酸阴离子在412nm处有 吸收，可用光谱法测定其 含量。
S NO2 + H+ COO-
S
NO2 COO-
+
2-硝基-5-硫代苯甲酸
五、组氨酸咪唑基的修饰
常用试剂是焦碳酸二乙酯和碘乙酸。
H N C O N H
H N N C O N CH2COO-
O ENZ C
+
O
+ HX
ENZ C
X
+
O C
NHR NHR
+
+ H+
形成相应酰胺
O ENZ C O C NHR NHR
+
O C NHR
重排
NR
+ H+
四、巯基的修饰
由于半胱氨酸时蛋白质中反应性最强的残基，所以很多试剂可用 来修饰巯基侧链。 1.碘乙酸、碘乙酰胺或环乙烯亚胺 常用的有三类： 2.马来酰亚胺或马来酸酐 3.有机汞试剂 （一）1类试剂是烷化剂，此类试剂还能与甲硫氨酸、赖氨酸或 组氨酸反应。
+ NH2OH pH =7 N C OCH2CH3 羟胺
O
N ENZ NH
+
O O H N C OCH2CH3 H
羟胺不能使双取代物发生可逆反应，而是清除咪唑环。
六、色氨酸吲哚基的修饰
它氧化吲哚基成为羟吲哚衍生物。酪氨酸也能与NBS作用。
（一）N-溴琥珀酰亚胺（NBS）常用来修饰色氨酸。
（二）各种苄基卤化物能使吲哚环烷基化
ENZ CH
3-硝基酪氨酸
OH NO2
+ -C(NO2)3 + H+
八、甲硫氨酸甲硫基的修饰
用H2O2和过甲酸可将甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亚砜，用碘乙酸 烷化甲硫氨酸残基，能形成正甲硫盐。
九、丝氨酸羟基的修饰
甲苯磺酰氟（PMSF)可与丝氨酸残基作用。
常用重要修饰剂的专一性
试剂
醋酸酐 酰基酸酐
醛 N-溴琥珀酰亚胺 碳二亚胺 苯异硫氰 四硝基甲烷 三硝基苯磺酸 焦碳酸二乙酯 碘乙酸 环乙烯亚胺 甲苯磺酰氟 马来酰胺 × × × × × × × × × × × × × × × × × 修饰的侧链 Lys Glu Cys Arg Ser His Tyr Trp Met × × × × × × × × × × × × × × ×
H
NCH2CH3
+
pH ﹥7
ENZ
O NCH2CH3
H C C N C C O H H
（三）3类试剂对巯基专一性最强。常用的是对氯汞苯甲酸，S-汞 -N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸是对氯汞苯甲酸的衍生物，也可与 巯基反应。
COOENZ CH2 S H+ Cl Hg 对氯汞苯甲酸
CH2SHg+ SO2NHCHCOOH
对氯硫硝基苯
带硝基苯取代基的硫基卤化物的专一性与锍盐类似，但能产生单 一产物，避免了锍盐修饰产物的不均一性，而且产物的光谱性质 可用来定量测定色氨酸。
七、酪氨酸酚基的修饰
四硝基甲烷在温和条件下可高度专一地硝化酪氨酸残基，产生可 电离的发色基团3-硝基酪氨酸。
ENZ CH
OH + C(NO2)4 四硝基甲烷
（三）可裂解性
研制可裂解交联剂有助于分离和表征交联片断。
（四）反应活性部分
可以在某种程度上控制交联剂的反应部位，可以通过交联剂反应 活性部位的疏水性、亲水性或电荷来控制反应。
ENZ CH2 S Hg
CH2SHg S SO2NHCHCOOH
COO+Cl + H+
ENZ
ENZ S H
+
N（CH3）2
N（CH3）2
S-汞-N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸
（四）5，5′-二硫双硝基苯甲酸（DTNB）也常用于修饰巯基， 它与半胱氨酸形成混合二硫化物。 释放出的2-硝基-5-硫代苯
ENZ S H
×
第四节 蛋白质肽链的交联
双功能试剂：具有两个反应活性部位，可以在相隔较近的两个氨 基酸残基间搭桥、形成多肽链内、多肽链间或者蛋白质分子之间 的交联，而不引起蛋白质构象的重大改变的试剂。
一、设计或选择交联剂要考虑的因素 （一）反应的专一性
交联剂 分为 同型双功能试剂 异型双功能试剂
（二）交联距离
随着交联剂两个功能基之间距离跨度的增加，形成交联的可能性 也随之增加。
ENZ S + ICH2COO半胱氨酸 碘乙酸
pH﹥7
ENZ S CH2COO- + I-
副反应：
ENZ N N H
+
ICH2COO-
pH﹥5.5
ENZ
N CH2COON
+ I- + H+
组氨酸
ENZ
S CH3
+
ICH2COO-
pH=2～8.5
ENZ
S+
CH2COOCH3
+ I-
甲硫氨酸
ENZ NH2
最常用的是2-羟基-5-硝基苄基溴，由于溶解度的问题，常用 它的类似物二甲基（2-羟基-5-硝基苄基）锍盐。
NO2 CH2Br OH
pH ﹤7.5
+
ENZ NO2 CH 2 O N HH
ENZ
+ HBr
2-羟基-5-硝基苄基溴
ENZ NH
色氨酸 醋酸
S ENZ NH
N H
NO2
+
ClS
NO2
+ H+ + Cl-
化学修饰的原理 化学修饰的方法学 蛋白质侧链的修饰 蛋白质肽链的交联 亲和标记
蛋白质化学修饰的应用
（第九讲）
三、羧基的修饰
用水溶性碳二亚胺作催化剂，通过胺专一地修饰蛋白质中的羧 基。
O ENZ C O
NR
+
C
+
O
+ H+
ENZ C O C
N R
NHR NHR
+
H
碳二亚胺
O ENZ C O C NHR NHR
+
ICH2COO-
pH=8.5
ห้องสมุดไป่ตู้
ENZ NH CH2COO- + I- + H+
（二）2类试剂能与巯基形成对酸稳定的衍生物，而与其它基团 H 形成的产物则对酸不稳定。 O
O
H C C
ENZ SH + 半胱氨酸
NCH2CH3 O
pH ﹥5
副反应：
ENZ NH2
马来酸酐
O NCH2CH3 O
ENZ S C C O H
N ENZ
O N C OCH2CH3
焦碳酸二乙酯
CH3CH2OH +CO2
+
焦碳酸二乙酯能使咪唑环上的一个氮原子羧乙基化.
应注意 的问题
该试剂在水介质、高pH下不稳定，迅速水解为CO2和乙醇。 试剂大大过量时可与咪唑环上的两个氮都作用，形成双取代 衍生物。
羟胺可使反应可逆进行，回收组氨酸。
N ENZ
用碘乙酸烷化组氨酸 残基可得单取代或双 取代衍生物。
H N C O
+
N
+
ICH2COO碘乙酸
+ ICH2COO
N
N
CH2COO-
1-羧乙基组氨酸
H N C O
N CH2COO-
1，3-二羧乙基组氨酸
N CH2COO-
3-羧乙基组氨酸
H N ENZ N
O
+
O O
C O CH2CH3 pH 4～7 C O CH2CH3
+ O2N
-OOC
S
S
NO2 COO-
pH ﹥6.5
DTNB
ENZ S
甲酸阴离子在412nm处有 吸收，可用光谱法测定其 含量。
S NO2 + H+ COO-
S
NO2 COO-
+
2-硝基-5-硫代苯甲酸
五、组氨酸咪唑基的修饰
常用试剂是焦碳酸二乙酯和碘乙酸。
H N C O N H
H N N C O N CH2COO-
O ENZ C
+
O
+ HX
ENZ C
X
+
O C
NHR NHR
+
+ H+
形成相应酰胺
O ENZ C O C NHR NHR
+
O C NHR
重排
NR
+ H+
四、巯基的修饰
由于半胱氨酸时蛋白质中反应性最强的残基，所以很多试剂可用 来修饰巯基侧链。 1.碘乙酸、碘乙酰胺或环乙烯亚胺 常用的有三类： 2.马来酰亚胺或马来酸酐 3.有机汞试剂 （一）1类试剂是烷化剂，此类试剂还能与甲硫氨酸、赖氨酸或 组氨酸反应。
+ NH2OH pH =7 N C OCH2CH3 羟胺
O
N ENZ NH
+
O O H N C OCH2CH3 H
羟胺不能使双取代物发生可逆反应，而是清除咪唑环。
六、色氨酸吲哚基的修饰
它氧化吲哚基成为羟吲哚衍生物。酪氨酸也能与NBS作用。
（一）N-溴琥珀酰亚胺（NBS）常用来修饰色氨酸。
（二）各种苄基卤化物能使吲哚环烷基化
ENZ CH
3-硝基酪氨酸
OH NO2
+ -C(NO2)3 + H+
八、甲硫氨酸甲硫基的修饰
用H2O2和过甲酸可将甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亚砜，用碘乙酸 烷化甲硫氨酸残基，能形成正甲硫盐。
九、丝氨酸羟基的修饰
甲苯磺酰氟（PMSF)可与丝氨酸残基作用。
常用重要修饰剂的专一性
试剂
醋酸酐 酰基酸酐
醛 N-溴琥珀酰亚胺 碳二亚胺 苯异硫氰 四硝基甲烷 三硝基苯磺酸 焦碳酸二乙酯 碘乙酸 环乙烯亚胺 甲苯磺酰氟 马来酰胺 × × × × × × × × × × × × × × × × × 修饰的侧链 Lys Glu Cys Arg Ser His Tyr Trp Met × × × × × × × × × × × × × × ×
H
NCH2CH3
+
pH ﹥7
ENZ
O NCH2CH3
H C C N C C O H H
（三）3类试剂对巯基专一性最强。常用的是对氯汞苯甲酸，S-汞 -N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸是对氯汞苯甲酸的衍生物，也可与 巯基反应。
COOENZ CH2 S H+ Cl Hg 对氯汞苯甲酸
CH2SHg+ SO2NHCHCOOH
对氯硫硝基苯
带硝基苯取代基的硫基卤化物的专一性与锍盐类似，但能产生单 一产物，避免了锍盐修饰产物的不均一性，而且产物的光谱性质 可用来定量测定色氨酸。
七、酪氨酸酚基的修饰
四硝基甲烷在温和条件下可高度专一地硝化酪氨酸残基，产生可 电离的发色基团3-硝基酪氨酸。
ENZ CH
OH + C(NO2)4 四硝基甲烷
（三）可裂解性
研制可裂解交联剂有助于分离和表征交联片断。
（四）反应活性部分
可以在某种程度上控制交联剂的反应部位，可以通过交联剂反应 活性部位的疏水性、亲水性或电荷来控制反应。
ENZ CH2 S Hg
CH2SHg S SO2NHCHCOOH
COO+Cl + H+
ENZ
ENZ S H
+
N（CH3）2
N（CH3）2
S-汞-N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸
（四）5，5′-二硫双硝基苯甲酸（DTNB）也常用于修饰巯基， 它与半胱氨酸形成混合二硫化物。 释放出的2-硝基-5-硫代苯
ENZ S H
×
第四节 蛋白质肽链的交联
双功能试剂：具有两个反应活性部位，可以在相隔较近的两个氨 基酸残基间搭桥、形成多肽链内、多肽链间或者蛋白质分子之间 的交联，而不引起蛋白质构象的重大改变的试剂。
一、设计或选择交联剂要考虑的因素 （一）反应的专一性
交联剂 分为 同型双功能试剂 异型双功能试剂
（二）交联距离
随着交联剂两个功能基之间距离跨度的增加，形成交联的可能性 也随之增加。
ENZ S + ICH2COO半胱氨酸 碘乙酸
pH﹥7
ENZ S CH2COO- + I-
副反应：
ENZ N N H
+
ICH2COO-
pH﹥5.5
ENZ
N CH2COON
+ I- + H+
组氨酸
ENZ
S CH3
+
ICH2COO-
pH=2～8.5
ENZ
S+
CH2COOCH3
+ I-
甲硫氨酸
ENZ NH2
最常用的是2-羟基-5-硝基苄基溴，由于溶解度的问题，常用 它的类似物二甲基（2-羟基-5-硝基苄基）锍盐。
NO2 CH2Br OH
pH ﹤7.5
+
ENZ NO2 CH 2 O N HH
ENZ
+ HBr
2-羟基-5-硝基苄基溴
ENZ NH
色氨酸 醋酸
S ENZ NH
N H
NO2
+
ClS
NO2
+ H+ + Cl-