人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆

人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆吕勇刚1,窦科峰1,吴昱彤2,赵爱志1,刘　杰4,陈　刚5,陶开山1,药立波3(1.第四军医大学西京医院肝胆外科,陕西西安　710033;2.唐都医院信息科,陕西西安　710038;3.基础部生物化学教研室;4.基础部药理学教研室,陕西西安　710032;5.西安交通大学第一医院血液科,陕西西安　710061)摘要:目的　扩增人乳腺癌抗体全套可变区基因,将其克隆到T 载体来构建T 载体文库。

方法　收集乳腺癌患者外周转移淋巴结30例,TRIzol 法提取总RNA 、纯化mRNA ,行RT 2PCR 扩增,制备T 载体,用于PCR 产物的克隆。

结果　总RNA 纯度高,完整性好,mRNA 获得率为1%。

经RT 2PCR ,V H 、V λ、V κ的每一条5’端引物均与其相应的3’端引物成功地扩增出了可变区基因片段,轻、重链T 载体库分别为1.7×108和3.5×108。

结论　所采用的引物能够100%扩增目的片段,T 载体过渡能显著提高克隆效率,为噬菌体抗体库的构建和筛选奠定了基础。

关键词:聚合酶链式反应;乳腺癌;抗体基因;T 载体中图分类号:R737.9 文献标识码:A 文章编号:167128259(2004)0620558204Amplif ication of all human V genes of breast carcinomafrom peripheral lymphadensL üY onggang ,Dou Kefeng ,Wu Yutong ,Zhao Aizhi ,Liu Jie ,Chen G ang ,Tao Kaishan ,Yao Libo(Department of Hepatobiliary Surgery ,Xijing Hospital ,Fourth Military Medical University ,Xi πan 710033,China )ABSTRACT :Objective To amplif y all human V genes of breast carcinoma by R T 2PC R.The p roducts of PC R were cloned int o T 2vect or t o const ruct clone library.Methods Perip heral lymp hadens of 30p atients wit h breastcarcinoma were collected ,f rom w hich t otal RNA was ext racted by TRIzol Reagent ,and m RNA was p urified wit h Oligotex m RNA kit.Then cDNA was derived t hrough reverse t ranscrip tion.PC R p roducts were amplified and cloned int o T 2vect or t o const ruct clone libraries.Re sults Total RNA was ext racted p urely and intactly ,so wasm RNA w hich accounts f or 1%of t he f or mer.By R T 2PC R ,every p air of p rimers amplified t he V gene efficiently.Rep ert oires of V H and VL were 3.5×108and 1.7×108resp ectively.Conclusion The set of p rimers adop ted areable t o recognize 100%of f unctional V genes wit h high efficiency.T 2vect or will f acilitate t he digestion ,w hich laysa f oundation f or const ruction and selection of p hage library.KE Y WOR DS :p olymerase chain reaction ;breast carcinoma ;antibody gene ;T 2vect or收稿日期:2004204214 修回日期:2004205211基金项目:国家自然科学基金资助(No.30371399)通讯作者:药立波,T el :83374547211;E 2mail :bioyao @ 作者简介:吕勇刚(19742),男(汉族),医师,在读博士. 噬菌体抗体库技术是90年代抗体工程领域的重大进展,能够绕开免疫途径,直接制备全人源化的抗体片段。

它将选择能力和扩增能力偶联起来,较好地模拟了体内B 细胞产生特异性抗体的过程。

传统的单克隆杂交瘤技术与之相比,已经显得“迟缓和笨拙”,有被逐渐取代的趋势1。

PCR 技术的发展,使得人们可以用一组引物扩增全套抗体的可变区基因,是抗体库技术出现的先决条件之一2。

我们采用一组高效引物,以乳腺癌患者的外周淋巴结为原料,扩增抗体的全套可变区基因,并将其首先克隆入T 载体,构建各自的T 载体文库,有助于提高PCR 产物的酶切和高效克隆,为抗体库的构建打下基础,并在方法学上进行了探讨。

1　材料与方法1.1　酶和化学试剂　TRIzol 提取液购自Invitrogen公司;DEPC 为Sigma 产品;r Taq DNA 聚合酶、dN TP 购自大连宝生物制品公司;mRNA 纯化试剂盒为Q IA GEN 产品;反转录试剂盒为Promega 产品;DNA 凝胶纯化试剂盒、大提质粒试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。

1.2　组织总RNA 的提取　术中剥离乳腺癌患者外周淋巴结30例(标本均经病理证实),迅速冻于液氮,第25卷第6期2004年12月西安交通大学学报(医学版)J our nal of Xi πan J iaot ong U niversity (Medical Sciences )V ol.25N o.6Dec.2004置研磨器研成粉末,移入匀浆器加入TRIzol研至透亮,按照说明书(Invitrogen)操作得到总RNA,紫外分光光度仪定量并检测其完整性,质量较差者弃用,重新提取,最后30例所得总RNA各取等量混合, -80℃冻存备用。

1.3　mRNA纯化　按照试剂盒(Qiagen)进行,部分改良。

按说明加入OEB(第8步)后,仔细吹打完毕, 70℃保温5min,迅速于26℃、16000×g离心2min,取小份定量,测定A260nm/A280nm值。

1.4　反转录　按照试剂盒说明书进行(Promega),部分改良。

取mRNA约0.5μg,70℃保温20min打开二级结构,迅速置冰上。

按说明书依次加入各成分,置室温20min,42℃3min后再加入抑制剂和AMV反转录酶,总体系20μL。

42℃90min,95℃5min。

1.5　引物设计与合成　引物设计参见文献3,适当改动和取舍,由赛百盛公司合成,PAGE纯化。

我们在所有引物的5’端延长一段保护序列:①VH Back primers:TT A TCA TCG AG C CCG CTC G AG—;②VH Forward primers:G AT TGG TTT G CC CT A G CT AG C—;③Vλand VκBack primers:AG C AAG CGG CG C TTG G CG CG C—;④Vλand VκForward primers: GTT ATG GTC G AA CG C GTC G AC—。

下划线依次引入XhoⅠ、N heⅠ、Bss HⅡ、S alⅠ酶切位点,第二轮PCR的引物同保护序列。

1.6　PCR反应　共进行两轮。

第一轮以0.5～1μL 反转录产物cDNA作为模板,3′端引物等摩尔混合,分别与5′端各引物反应。

反应条件为:94℃5min 热启动,94℃1min变性,55℃1min退火,72℃1min延伸,共30循环。

最后进一步延伸7min,反应体系为25μL,将得到的PCR产物按比例混合(V H 混合,VL和V K以1∶2混合),胶回收纯化后100倍稀释,作为第二轮PCR的模板。

反应体系同上。

最后每管加入0.3μL dA TP继续延伸30min,目的是下一步连入T载体。

经胶回收纯化后得到可变区抗体基因。

1.7　T载体的制备　T载体的前身是pSP73,我们实验组赵爱志博士去除相应的酶切位点后命名为pSP732T,转入大肠杆菌TG1,用于制备T载体。

挑取TG1菌落转接于500mL培养液,摇过夜后大提质粒,平端酶Eco RⅤ使pSP732T线性化,酚/氯仿、氯仿抽提纯化后在r2Taq酶,d TTP作用下于72℃加温2h,琼脂糖电泳纯化后定量备用。

1.8　轻、重链T载体库的构建　V H、VL经胶回收定量后各取1.5μg和2μg T载体连接,体系20μL。

16h后70℃30min灭活T4DNA连接酶。

取1μL 连接产物与50～100μL感受态细胞进行规模电转化(TG1感受态的制备见文献4,电转参数:0.1mm～1.8kV;0.2mm～2.5kV;电阻、电容均分别为200Ω;25μV),每次电转后用1mL37℃预热的SOC洗出并快摇1h复苏,取小份倍比稀释,铺抗生素琼脂板计算菌量,随机挑克隆双酶切验证阳性率。

其余铺氨苄琼脂板,过夜后收获细菌提质粒,即为V H、VL 的T载体库。

2　结 果2.1　总RNA及mRNA的提取和纯化　总RNA经1 g・L-1甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,90V4h,0.1 mol・L-1NH4AC浸泡凝胶20min后,在含有0.4 mg・L-1E B的0.1mol・L-1NH4AC中染色30min,紫外透射读胶仪上观察RNA电泳条带并照像。

28S带的亮度为18S带的两倍,说明总RNA完整性好,未被降解(图1)。

总RNA的量为1mg,mRNA的量为10μg,获得率为:10μg/1000μg=1%,A260nm/A280nm= 2.0。

表明mRNA纯度高,没有污染。

图1　淋巴结总RNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳Fig.1Total RNA from human lymphadens analyzed by formalde2 hyde denaturing agarose electrophoresis2.2　cDNA的同位素示踪　反转录后取少量行碱性琼脂糖凝胶电泳,经放射自显影,结果表明,cDNA合成为连续拖影,片段大小相似,分布范围较宽,从0.3kb到9.4kb,主要集中在2kb左右,结果证实了模板mRNA的完整性(图2)。