人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆

人乳腺癌全套抗体可变区基因的扩增与克隆

吕勇刚1,窦科峰1,吴昱彤2,赵爱志1,刘　杰4,陈　刚5,陶开山1,药立波3

(1.第四军医大学西京医院肝胆外科,陕西西安　710033;2.唐都医院信息科,陕西西安　710038;

3.基础部生物化学教研室;

4.基础部药理学教研室,陕西西安　710032;

5.西安交通大学第一医院血液科,陕西西安　710061)

摘要:目的　扩增人乳腺癌抗体全套可变区基因,将其克隆到T 载体来构建T 载体文库。方法　收集乳腺癌患者外周转移淋巴结30例,TRIzol 法提取总RNA 、纯化mRNA ,行RT 2PCR 扩增,制备T 载体,用于PCR 产物的克隆。结果　总RNA 纯度高,完整性好,mRNA 获得率为1%。经RT 2PCR ,V H 、V λ、V κ的每一条5’端引物均与其相应的3’端引物成功地扩增出了可变区基因片段,轻、重链T 载体库分别为1.7×108和3.5×108。结论　所采用的引物能够

100%扩增目的片段,T 载体过渡能显著提高克隆效率,为噬菌体抗体库的构建和筛选奠定了基础。

关键词:聚合酶链式反应;乳腺癌;抗体基因;T 载体

中图分类号:R737.9 文献标识码:A 文章编号:167128259(2004)0620558204

Amplif ication of all human V genes of breast carcinoma

from peripheral lymphadens

L üY onggang ,Dou Kefeng ,Wu Yutong ,Zhao Aizhi ,Liu Jie ,Chen G ang ,Tao Kaishan ,Yao Libo

(Department of Hepatobiliary Surgery ,Xijing Hospital ,Fourth Military Medical University ,Xi πan 710033,China )

ABSTRACT :Objective To amplif y all human V genes of breast carcinoma by R T 2PC R.The p roducts of PC R were cloned int o T 2vect or t o const ruct clone library.Methods Perip heral lymp hadens of 30p atients wit h breast

carcinoma were collected ,f rom w hich t otal RNA was ext racted by TRIzol Reagent ,and m RNA was p urified wit h Oligotex m RNA kit.Then cDNA was derived t hrough reverse t ranscrip tion.PC R p roducts were amplified and cloned int o T 2vect or t o const ruct clone libraries.

Re sults Total RNA was ext racted p urely and intactly ,so was

m RNA w hich accounts f or 1%of t he f or mer.By R T 2PC R ,every p air of p rimers amplified t he V gene efficiently.Rep ert oires of V H and VL were 3.5×108

and 1.7×108

resp ectively.Conclusion The set of p rimers adop ted are

able t o recognize 100%of f unctional V genes wit h high efficiency.T 2vect or will f acilitate t he digestion ,w hich lays

a f oundation f or const ruction and selection of p hage library.

KE Y WOR DS :p olymerase chain reaction ;breast carcinoma ;antibody gene ;T 2vect or

收稿日期:2004204214 修回日期:2004205211基金项目:国家自然科学基金资助(No.30371399)通讯作者:药立波,T el :83374547211;E 2mail :bioyao @ 作者简介:吕勇刚(19742),男(汉族),医师,在读博士.

噬菌体抗体库技术是90年代抗体工程领域的重大进展,能够绕开免疫途径,直接制备全人源化的抗体片段。它将选择能力和扩增能力偶联起来,较好地模拟了体内B 细胞产生特异性抗体的过程。传统的单克隆杂交瘤技术与之相比,已经显得“迟缓和笨拙”,有被逐渐取代的趋势1。PCR 技术的发展,使得人们可以用一组引物扩增全套抗体的可变区基因,是抗体库技术出现的先决条件之一2。我们采用一组高效引物,以乳腺癌患者的外周淋巴结为原料,扩增抗体的全套可变区基因,并将其首先克隆入T 载

体,构建各自的T 载体文库,有助于提高PCR 产物的酶切和高效克隆,为抗体库的构建打下基础,并在方法学上进行了探讨。1　材料与方法

1.1　酶和化学试剂　TRIzol 提取液购自Invitrogen

公司;DEPC 为Sigma 产品;r Taq DNA 聚合酶、dN TP 购自大连宝生物制品公司;mRNA 纯化试剂盒

为Q IA GEN 产品;反转录试剂盒为Promega 产品;DNA 凝胶纯化试剂盒、大提质粒试剂盒购自上海华

舜生物工程有限公司。

1.2　组织总RNA 的提取　术中剥离乳腺癌患者外

周淋巴结30例(标本均经病理证实),迅速冻于液氮,

第25卷第6期2004年12月西安交通大学学报(医学版)

J our nal of Xi πan J iaot ong U niversity (Medical Sciences )V ol.25N o.6Dec.2004