小鼠(BALBc)未分化型免疫球蛋白重链可变区(VH)基因的克隆 1,2)

产品。 －－－Ｃ Ｐ（ ＂ ａｄＴ 英国进口， Ｐ 由中科院生物
物理所与微生物所支援） Ｔ 。 Ｂ与 Ｌ Ｂ培 养基 ， 杂交缓冲液等均照文献所述。 （ 二） 方法 １小鼠胎儿基因文库的保存、扩增等照文 ．
ｔ ｍ ｅ ｗ ｒ Ｍｏｓ Ｇ ｎ Ｌｂａ （ Ａ Ｂｃ ｒ ｔ Ｎ Ｂ ｎ ｕ ｅｅ ｒｒ Ｂ Ｌ ｝） ｏ ｈ ｅ ｏ ｅ ｉ ｙ
（ 上接第２页） ０ 克隆到 ８ 个免疫球蛋白重链可变区 Ｖ 基因。 Ｈ 我
不 同亚组的 Ｖ Ｈ基因作探针， 还会克隆到不同 的亚组的 Ｖ Ｈ基因。 可见研究免疫球蛋 白重链 Ｖ 基因的克隆和基因的数量对揭示免 疫 球 蛋 Ｈ 白的多样性和特异性有重要帮助。
参 考 文 献
们参照 Ｈ ｎ 和 Ｃａ ｏｊ ｏ ｌｋ等的“ ｒ 基因文库 中包括
２０
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来自百度文库３
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异。但是在等电点聚焦电泳的带谱中，它们之 间的差异是很明显的， 肾脏比肝脏多第 ３，１， ＇１＇ １＇ １， １‘ ３， 和 ５五条带 ， ４ 比肝脏少第 ９ 和 １‘ ’ １两 参
认 为， Ｅ ｏ 在 ｃ Ｒ Ｉ酶 切时形成的不完全 酶切所形
图 ｔ 免疫球蛋白 重链 Ｖ 基因克隆复筛结果
黑 点表 示阳性 克 陇
成少量的很大的 ＤＮＡ片段 ， 也含有 Ｖ Ｈ基因。 （ 二） 从相当小鼠一个基因组的重组子中
（厂 第３ 页 ） 转 １
为了进一步地研究， 将克隆 Ｄ Ａ经 Ｅｏｌ Ｎ ｃＲ
受体菌 Ｅ ｃｌＬ ３ ２混合 ， ３ ℃ 吸附 １ 分 ． ｉ ９ ｏ Ｂ ７ ０ 图２ 所示。凝胶电泳照片和自显影结果使我们
钟， 加人软琼脂后倒人平皿中， ７ 过夜培养， 发现有两条含有 Ｖ 基因片段的自显影带。５ ３℃ ． ０
再吸印、 杂交和 自显影， 其结果如图 １ 所示。从 ｋ 的明显一条带为 Ｖ， ｂ ，基因片段，显然是无疑 图１ 中可见所获得的噬斑几 乎 １０ 为 阳 性， 的。但是在 Ｃ ａｏ ４ 的左、 ０拓 ｈｒｎ Ａ 右臂 Ｄ ＮＡ 带间 证明了我们得到克隆确系免疫 球蛋 白 Ｖ ｙ基因 的一条不太明显的自显影带 ，它恰好相当琼脂 克隆。 糖电泳上的相应的一条很浅的带。 我们认为： 由于小鼠胎儿基因文库系由小鼠胎儿总 Ｄ ＮＡ， 经 Ｅｏ Ｉ不完全酶切的 ７ ０ ｃＲ －２ ｋ ｂ片段包装在 Ｃ ａｏ ４ 的左、 ｈｒｎ Ａ 右臂之间构成的， 因为插人的 小鼠 Ｄ ＮＡ 是 Ｅｏ ｃＲ Ｉ不完全酶切， 所以尚会 保留一定的 Ｅｏ ｃＲ Ｉ切点， 因此再用 Ｅｏ ｃＲ Ｉ酶 切时依酶切程度不同也会出现较多的带，如图 ２的 （） １ 中所见。 除 Ｃ ａｏ ４ 的左、右臂 ｈｒｎ Ａ Ｄ Ａ片段之外， Ｎ 尚可发现有 ５ 条带。此外，从 图 ２的 （）中所看到的在 ２．ｋ ２ １ ｂ下部的浅的 ８ 自显影带， 也含有 Ｖ 基因片段。 我们初步分析
文献 【 ］进行。 ２ ６ 克隆的 Ｖｙ基 因片段 的 Ｅ ｏ ｌ酶 切与杂 ． ｃＲ
Ｌ Ｒ
一 ２。 一 １８
一 —
夕６ ． ５５ ．
・ ４． 一 ８ — 一 ３４ １８ ．
交
照文献 〔， 进行。 ３ １］ ０
结果 与讨 论
（ 一） 获得了小鼠未分化型免疫球蛋白靛
链 可变区 ＶＨ基因克隆 ， 并用 Ｅ ｏ Ｉ酶 切从 中 ｃＲ
到大小相当的塑料袋中，加入 ２ ｌ ｍ 预杂交液及
热变性处理的 Ｅ ｃｌ Ｌ ３ ２总 Ｄ ． ｉ ９ ｏ Ｂ ＮＡ，密封
后，４ 土１ 保温两小时， ２ ℃ 弃去预杂交液， 加人 杂交液 １ ｍ ，及热变性处理的 Ｆ ｃｉ ３２ ． ｌ ５ ， ｏ Ｌ ９ ． Ｂ ｌ
Ｙ ｎ Ｚ ｉｉｇ ａ． Ｃｏ ｉｇ ｔｅ ｎｌｔｒｎｉｔ ａｇ ｈｘｎ ｅ ｌ ｌｎｎ ｏ ｈ Ｕ （ｆｅｅｔ ｅ ｔ ： ｆ ｉ ａｄ ｌ ｎ ｎ ｇｏ ｕｉ Ｈｅｖ Ｃ ａｎ ａｉｂｅ ｇｏ Ｇｒｅ ｍｉｕ ｏｌｂ ｌ ｎ ａｙ ｉ Ｖ ｒ ｌ Ｒ ｉｎ ｎ ｈ ａ ｅ
意 汇， 义‘。 ， ‘
个重组子中， 克隆到 ８个 Ｖ Ｈ基因， 并从其 中之
每馏份 ５１， ０１ 共收集 ４ 个馏份， ｚ ０ 测定各馏份的
Ｖ Ｄ Ｈ ＮＡ 探针。比度约为 ７５ ＩＳＰ ． Ｘ Ｃ Ｍ。 实 Ｏ 验表明， Ｓｐａｅ Ｇ－５柱层析分离纯化 Ｖ 用 ｅｈｄｘ ７ Ｈ
收集合拼 ７ １ －１ 个馏份， 为标记的 我们从相当于一个小鼠基因组的１ Ｘ ０ 放射性强度， ． １ ２ ０
一分离到５ ｋ 的含免疫球蛋白重链可变区 Ｖ ．ｂ Ｏ Ｈ
基因的 Ｄ ＮＡ片段。
Ｄ Ａ探针， Ｎ 较之用酚提取法杂交与自 显影效果
为佳 。
材料与方法
（ 一） 材料
４预杂交和杂交 ．
照文献 ［， １］ ３ ５ ０进 ，
行 ，但有所改进。预杂交是将吸印的滤膜放人
受 体 菌 Ｆ ｃｌ Ｌ ３２ ＿ ｏ Ｂ ９ ，小 鼠 （Ａ Ｂｃ ． ｉ Ｂ Ｌ ／） 胎儿基因文库 （． Ｘ ＇ｆ； ） １ ２ ｌ Ｐｕ ０１ ，表 达 型 Ｏ ． ｍｌ 免疫球蛋白重链 ＩＥ 的可变区基因 片 段 等 由 ｇ Ｔ Ｈｎ ． ｊ ｏ 。所赠。 Ｅ ｔｌ Ｌ ３２总 ＤＮ 和 ． ｌ ９ ｏ Ｂ ＇ Ａ Ｃ ａ ｎ 总 Ｄ ｈｒ ４ ｏ Ａ ＮＡ为自己制备ｏ Ｎａ Ｉ Ｄ ｓ 和 ｅ Ｄ ＮＡ 聚合酶 Ｉ Ｓ ｍａ产品。 Ｅｏ Ｉ酶国 系 ｉ ｇ ｃＲ
２０ ４
考
文
献
［ ］ 吴鹤龄、林抓湖、李美琴： １８０ 遗传，４２； １ ｝ ９２ （） ２－ ２ ［ Ｉ 李士鹏、吴鹤龄：１８０遗传学报 ，１（）０ ５ ２ ９６ ３１６－６０
〔 ３］ Ｆｎ ｅ， ．． ａ． １６． ｏｈｍ ｓ ｙ ３ ２ ． ｏｄｙ Ｔ ｅ ｌ ９４ Ｂ ｃｅ ｉｒ． ：５ ２ Ｐ ｔ ： ｉ ｔ ， ［ ４】 Ｏ ｉ ， １ ｅ ａ． １７． ａｙ ｃｌ ｏｈｉ，９ ： ｇｔ Ｚ ． ｌ ９９ Ａ ｌｔａ Ｂ ｃｅ ａ ．－ ｔ ： ｎ ｉ ｉ ｎ ９
翻译溶液 Ｉ １ ，然后取 Ｉ ２ 和Ｉ液 和１５１ １０ ， １ 液 Ｏｌ Ｉ ， ｕ
ＩＦ， Ｄ Ｏｃ ＶＦ ＮＡ探针 ２ ｇ ３ Ｐａ ｄ Ｔ ２ｌ ｉ ｌ ， ｚ ２ １ ， － －Ｃ Ｐ ｚ ， ０Ｃ 加无菌水至 １０ ０川，在 １１１ 的水浴上 反 应 ５ ℃ １ ． ５小时后， 终止反应， 通过 Ｓｐａｅ Ｇ ７（ Ｘ ｅｈｄｘ ５ － １ ５ｍ床体积）柱分离纯化标 记 的 ＤＮＡ探 针。 ｃ
Ｍ ｏｕｓ＾
１ ）此项研究为中国科学院科学基金资助， 部分工作得到
日本 大 阪大 学 Ｔ． ｎｏ 教 授的 指导。 Ｈｏ ｊ
２ ）本所杨建清、 甲 王润芝、 董 有、 齐云祥参加部分工作， 周
武林 同志照 像 ， 此 致 谢。 特 木 文于 １８ 年 １ ９５ ０月 ２ Ａ收 到。 ４
１ ９
总 Ｄ Ａ 和 Ｃ ａ ｎ 总 Ｄ Ａ 以及标记 的 Ｎ ｈｒ ４ ｏ Ａ Ｎ
中克隆出未分化型免疫球蛋白重链可变 区 Ｖ Ｈ
基因。并对其进行了初步的研究。免疫球蛋白 的重链和轻链可变区的空间叠折形成 了 抗 原－ 抗体结合位点，这对于结合特异抗原具有重要 作用［７ １ 。因此克隆与研究免疫球蛋白可变区基 ， ２ 因对于认识抗体的特异性 、多样性都有一定的
３ 杂交探针的制备 ．
以把这些有同源性的 ＩＥ作为一个亚组 ，以这 ｇ
ｔ ］ 杨志兴，杨学成：１８０国外医学， １ ９３ 分子生物学分册， ５４； ４－２０ （） ２ －２０ １ ［ 〕 杨志兴等：１８ ２ ９３ ０遗传，５４； －４０ （） ４ － １ ０－
ｔ 〕 杨 建清等 ： １８ ．遗 传学 报 ，１（ ） ６ １ ３ ９４ １１ ； 一１ｏ ［ ４］ Ｈ ｎｏ Ｔ ｅ ａ ： １８． ｌ Ｓ ｒ ｇ ａｂｒ ｍ ． ｏｊ， ｔ ． ｌ ． ９０ Ｃ ｄ ｉ Ｈ ｒｏ Ｓ ｐ ｏ ｐｎ ｙ ，
了８ 个免疫球蛋白 Ｖ ＊基因克隆。 从其中之一 进行复筛。复筛方法是用干热灭菌的牙签挑取
带，Ｌ Ｒ分Ｖ表示 Ｃ ａ ｎ 的左、 ． ｊ ｈｒ ４ ｏ Ａ 右臂 Ｄ Ａ 带二 Ｎ
任意一个阳性噬斑， 悬浮在 １０１ Ｍ Ｓ４ 酶切， 。 汤琼脂糖上电泳，电泳后使 Ｄ Ａ ０１ １Ｍ Ｍ ０ ４ ０ ｇ 在 ． ７ Ｎ 溶液中， 轻轻地摇动， 使之均匀分布， 再与１０ ０月 转移到滤膜上， 再进行杂交和自显影， 其结果如
Ｖ ｆ探针 ＤＮＡ，密封 后在 ４ 士１ 过夜 ，取 出 ， ２ ℃
ｋｂ
后用 ２ ＳＣ ０１ ＤＳ溶液洗 ４次（ Ｘ －．％Ｓ Ｓ 室温下） ， 每次 ５ 分钟， 然后换 ０１ Ｓ －．０Ｓ 液洗， ．多ＳＣ ０１ ＤＳ Ｊ ａ ５－６ ℃洗 ３ 间隔 １ ０ ０ － 次， ５分钟， 出置 ８℃ 干 取 ０ 燥， 做放射自显影。 ５由阳性克隆中提取纯化 总 Ｄ ． ＮＡ 照
遗传
Ｉ Ｅ） Ａ （ ｅｉ ） （ ） １－ ２ １ ８ Ｉ ＩＴ Ｓ Ｂ ｉ ｇ ８ ； Ｅ Ｉ Ｒ ｊ ｎ ６ ９ ０ ６ ９
小鼠 （Ａ Ｂｃ 分化 Ｂ Ｌ ／）未 型免疫 球蛋白 链 重 可变区 （ ｖ ）基因的克隆‘ ， ２ ）
杨 兴 曲 志 宝兰 杨 成 刘 民 学 伟 李 文贤 张云 王 伏 陈 虹 湖 军
的重组子数目达到 １６ ０个时就可代表整 个哺乳
动物基因组” 的认识Ｕ．， ，７刚好取 １ Ｘ Ｐｕ ８ ９ ． １６ｆ ２ ０ ／ Ｏ ｍ 即相当于小鼠的一个基因组， ．ｌ ｌ 并用一种免 疫球蛋白１Ｅ的可变区 （ Ｈ 基因作探针，由 ｇ Ｖ）
于该 Ｖ Ｈ基因的 Ｄ ＮＡ序列与不同骨髓 瘤 的一
组 ＩＥ ｇ Ｖ Ｈ基因序列有相当的同源性，所以可
４ ． ３ ９ ０． ５ ９１ － ２
个 Ｖ 基因作探针进行吸印杂交，所得到的 ８ Ｈ
个球蛋白 ＶＩ Ｉ基因克隆则代表了小鼠一个基 因 组中一个 Ｖ 、基因亚组包含有 ８ 个基因。 这一 结果是与 Ｌｄｒ和 Ｋｅ ｅｅ ｍｐ等所报道的免疫 球 蛋白重链 Ｖ 。基因包括 ５ １ － ０个亚组， 每个亚 组包含 ８ 基因， 一个小鼠基因组中有 ４ －８ 个 ０ ０ Ｖ Ｈ基因的推论基本一致［８１ 我们如若使用 Ｌ ，。 ７９ ，
（Ｉ） （２ ）
回收到 ５ ｋ ． ｂ的含 Ｖ ０ Ｎ基因的 ＤＮ Ａ片段。我
图 ２ ｃ Ｒ 酶切免没球蛋白重链 Ｖ Ｌｏ ７ Ｉ ｙ克隆 Ｄ Ａ Ｎ
电泳及 其放 射 自显影结 果 （ ） ｏ １ Ｅ Ｒ ｃ Ｉ酶切 后电泳 圈 ； （ ）放 射 自显影后 的阳性 ２
们从１ Ｘ ＇ｆ Ｑ ｍ 基因文库中初筛获得 ． １Ｐｕ ． ｌ ２ ０ ／ ｌ
［ 〕 Ｈｏｊ， ： ８ ． ｂｒｔ ｙ ｎ ａ １ ２． ５ ｎｏ Ｔ １ ０ Ｌ ｏａ ｒ Ｍａｕｌ － ０ ． ９ ａ ｏ ， ［ ］ Ｌ ｄｒ Ｐ： ８ ． ｉ ｔｉ Ａ ｅｉ ｎ ２６ ５ ３ ． ６ ｅｅ， １ ２ Ｓ ｃ ｉｃ ｍ ｒ ａ， ． ６ ． ９ ｃ ｎｊ ｃ ４ ． ｔ ］ Ｋｅ ， Ｊ ｅ ａ ：１７． ． ｉ Ｓｉ Ａ ａ． Ａ ７ ｍｐ Ｄ ． ｌ ９９ Ｐ ｏ Ｎａ ． ． ｄ Ｕ ， ． ｔ ｒ ｌ ｃ ｃ Ｓ
（ 黑龙 江省 科 学院 应用 微生 物研 究 所 ， 尔滨 ） 哈
我们曾报道 了由小鼠胎儿基因文库中克隆 未分化型免疫球蛋白重链恒定区 Ｃ Ｅ基 因 的 研究结果〔。 与此同时我们还从小鼠基因文库 ３ ，
献 〔， ］ ２３ 方法。
２ Ｄ Ａ的吸印转移 ． Ｎ
述。
照文献 ［， ３５所 ］
首先分别配制缺口
２ ３． ３
条带。总的看来从带谱来区分组织间 Ｌ Ｈ 同 Ｄ
工酶的差异性 ，等电点聚焦电泳的带谱比一般 电泳的带谱分辨能力要高得多。这样前一方法 能提高我们对各组织的 Ｌ Ｈ同工酶特异性 的 Ｄ 识别能力。
［ ］ Ｒ 、Ｒ Ｇ ｅ ａ． １６． ｉ ｃ．１３ ４ １ ５ ｏ。 ． ｔ ： ９６ Ｓ ｅ ｅ ５ ：１ １． ． ｌ ｃ ｎ ， 汇 」 Ｗｉｏ ， Ｃ ｅ ａ． １６． ｄ Ｐｏ． ２ ： １５． ６ ｌ ｎ Ａ． ｔ ： ９４ Ｆ ． ｃ ３ ２ ８ ｓ ． ｌ ｅ ｒ ，