SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝胶电泳详解
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量
02 实验材料
所需的试剂和溶液
丙烯酰胺（AA）：用于制备凝胶，是聚合反应 的单体。
甲叉双丙烯酰胺（MBA）：交联剂，增加凝胶 的交联度。
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）：催化剂， 加速交联聚合反应。
所需的试剂和溶液
过硫酸铵（APS）
引发剂，产生自由基，引发聚合反应。
SDS
十二烷基硫酸钠，用于变性蛋白质并促使其 带负电荷。
发展新型分离技术
随着生物技术的不断发展，可以发展新型的蛋白质分离技术， 如二维电泳、毛细管电泳等，以提高蛋白质分离的分辨率和准
确性。
应用多维度分析
在后续实验中，可以将SDS-PAGE与其他蛋白质分析技术相结 合，如质谱技术、免疫学检测等，进行多维度分析，更全面地
了解蛋白质的性质和功能。
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白质带负电荷，从而在电场中向正极移动。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，能够根据蛋白质分子量的不同
03
对其进行分离。
蛋白质的分子量测定
通过比较标准蛋白的迁移率和已知分 子量的标准蛋白，可以大致测定出待 测蛋白质的分子量。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数成 反比，因此可以通过计算待测蛋白与 标准蛋白的相对迁移率来推算其分子 量。
甘氨酸
作为分子量标准品。
Tris-HCl缓冲液
维持电泳过程中的pH值稳定。
所需的仪器和设备
电源
为电泳提供电力。
凝胶板
放置凝胶的框架。
垂直电泳槽
提供电泳所需的基 本结构。
移液器
精确添加试剂和溶 液。
紫外透射仪
检测蛋白质条带。
实验前的准备事项
清洗电泳槽和相关器具，确保无残留物。 准备好所需的试剂和溶液，并确保其在有效期内。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）CHANG X C[实验目的]（1）掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
（2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。
[实验原理]电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。
许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。
电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
电泳过程必须在一种支持介质中进行。
最初的支持介质是滤纸、醋酸纤维素膜和硅胶，这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。
但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。
凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。
最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）分为“连续系统”和“不连续系统”两种电泳系统，在本实验中选用不连续系统。
“不连续系统”最大的优点在于大大提高了样品分离的分辨率。
这种电泳的主要特点是：①使用两种不同浓度的凝胶系统；②配制两种凝胶的缓冲溶液成分及pH不同，并且与电泳槽中电泳缓冲液的成分、pH也不相同。
在本实验中，电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度的大孔胶，称为浓缩胶或成层胶，配制此层胶的缓冲液是Tris-HCl，pH6.7；下层胶则是高浓度的小孔胶，称为分离胶或电泳胶，成胶的缓冲液是Tris-HCl，pH8.9；电泳槽中的电极缓冲液则是Tris-甘氨酸，pH8.3。
可见，凝胶浓度、成胶成分、pH与电泳缓冲系统各不相同，形成了一个不连续系统。
SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)原理
N.N-亚甲基双丙烯酰胺（甲叉）（N,N’-methylene bis acrylamide）
N.N-亚甲基双丙烯酰胺，别名MBA，双叫N.N-甲叉双丙烯酰胺，次甲基双丙烯酰胺， N.N-甲撑双丙烯酰胺。是一种白色晶体粉末，无味，吸湿性极小。遇高温或强光则 自交联，微溶于水、乙醇。
丙烯酰胺单体和交联剂N1 N′-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成含有酰胺 基侧链的脂肪族长链。相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来就形成三维网状结构的 聚丙烯酰胺凝胶。
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TEMED (N,N,N',N'-四甲基二乙胺 )
产品简介：
Ø TEMED即N,N,N‘,N’-Tetramethylethylenediamine，中文名为 N,N,N‘,N’-四甲基二乙胺。分子式为(CH3)2NCH2CH2N(CH3)2， 分子量为 116.20。
Ø 进口分装，用于配制PAGE胶等。TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基 而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。
过硫酸铵属于非易燃品，但由于能释放氧而有助燃作用，因此必须在一定条件下 储存。首先必须存放在干燥、密闭的容器中，其次应避免阳光直射、热源、潮湿等不 利因素。另外，一些杂质如脏物、铁锈、少量金属以及还原剂可能引起过硫酸铵的分 解，在存放和使用过程中也必须注意。由于潮湿的过硫酸铵粉末及其水溶液有漂白和 轻微的腐蚀作用，因此使用过程中应避免眼睛、皮肤和衣物直接与其接触。
N, N -亚甲基双丙烯酰胺又名甲撑双丙烯酰胺 , 英文缩写名 MBA, 为白色或浅黄色 粉末状结晶 , 毒性低 , 对皮肤无刺激 , 无神经毒性 , 溶于水及乙醇、丙酮等有机溶剂。 在它的结构中具有两个相同且非常活泼的反应性官能团 , 可作为交联剂 ,能将线性高 分子迅速转变为体型高分子 , 制备吸水性聚合物 , 还可与各种离子型单体发生聚合 反应 ,使其在石油开采以及医药、水处理等行业具有广泛用途。
实验二聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE鉴定免疫球蛋白
将制备好的凝胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液， 拨除梳子。用微量移液器点样。 5、电泳
样品在浓缩胶时，低电压（60~80V，起始电流不超过10~15mA）， 进入分离胶后，提高电压（100~200V，电流不超过30mA），当 指示剂溴酚蓝前沿距离胶1~2mm，终止电泳。最好在低温下进行。
6、染色与脱色
2、在一塑料盒里加入少量转膜液，将滤纸与胶浸泡 于其中5-10min；PVDF膜浸入甲醇中2min
3、制备“夹心饼”：（膜可比滤纸稍大，防止短路） 提起滤纸平放在盒盖上，用洁净15ml离心管压走多 余的buffer，以不滴水为宜，平铺在半干转印槽上， 再将湿润的膜（实验室统一剪角标记）放在该层滤纸 上；接下来将已切角的胶平铺在膜上，在最上层再铺 上滤纸并压走多余液体。
四肽链结构
所有Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构。两条重 链（H）和两条轻链（L）。
三、试剂与器材
1、30%的丙烯酰胺
2、10%SDS 3、TEMED 4、10%过硫酸铵
5、5xSDS-PAGE电泳缓冲液
6、浓缩胶缓冲液（PH6.8）
6.0 g Tris , 48mL 1mol/L HCl,加水至100ml.
4、转膜：（半干转）（PVDF膜0.22UM） 半干转移中，一般恒流（1-1.5mA/cm2，60-90min），
恒压的话15v 60分钟就可以了。 5、关闭电源，用镊子夹取PVDF膜，转移到塑料盒中，加入
5%脱脂奶粉4℃封闭过夜。 6、弃去封闭液，用TBST洗膜3次，每次5min 7、加入一抗，室温平缓摇动2h； 8、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min； 9、加入二抗，室温下孵育1h； 10、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min； 11、显色 在DAB中显色约10-30min，待蛋白质带的颜色
SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝胶电泳详解
SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE
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一、什么是SDS？
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在。
蛋白带迁移距离 Rf= ————————
溴酚蓝迁移距离
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蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度
Rf= ————————— X ————————— 干燥后的凝胶长度 溴酚蓝迁移距离
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2、作图 以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐
标，Rf为横坐标绘图
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3、通过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标 准曲线上读出他的分子量
还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳
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（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
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2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系
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3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度（>1mmol/L) 大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1： 1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度（不>0.26) 低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较 高的平衡浓度。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳知识讲解
S D S-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳该技术首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。
一、原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。
SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。
因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。
这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。
由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。
SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。
本实验采用垂直板状不连续系统。
所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。
1．样品的浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。
在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。
SDS-PAGE原理、方法详解
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）一、材料准备（1）丙烯酰胺单体（Arc）：在交联剂作用下形成聚丙烯酰胺（2）N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）：交联剂（3）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
由于SDS带有大量负电荷，当与蛋白质形成复合物后好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖，即消除了蛋白质分子之间电荷差异。
配制方法：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至100ml，室温保存。
（4）10%过硫酸铵（Ap）：引发剂。
配制方法：0.1 g过硫酸铵溶解于1ml双蒸水中。
过硫酸铵会缓慢分解，应新鲜配制。
（5）N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED）：其碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。
配制方法：原液使用。
应使用电泳级TEMED。
（6）30%丙烯酰胺凝胶贮液（Arc-Bis贮液）配制方法（50mL体系）：14.55 g丙烯酰胺＋0.45 g N，N-甲叉双丙烯酰胺，先用40ml双蒸水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀释至50 ml，0.45μm滤膜过滤。
用棕色瓶储存于4℃（丙烯酰胺单体贮液在储存过程中因光和碱催化发生脱氨反应，会缓慢转化成丙烯酸和双丙烯酸，储存液应测定pH值不超过7.0。
丙烯酰胺单体贮液应在暗色瓶中保存，每隔数月须重新配制。
丙烯酰胺具有很强的神经毒性和致癌性，并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。
称量时必须戴手套和面具。
）（7）分离胶缓冲液（pH8.8的Tris-HCl缓冲液）：1.5M Tris-HCl，pH8.8。
配制方法：9.08 g Tris溶解在40ml 双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值8.8，再用双蒸水加至50ml。
4℃保存。
（8）浓缩胶缓冲液（pH6.7的Tris-HCl缓冲液）：1.0M Tris-HCl，pH6.8。
配制方法：6.06 g Tris溶解在40 ml双蒸水中，用4 mol/L盐酸调节pH值6.8，再用双蒸水加至50 ml。
SDSPAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳详解
3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度（>1mmol/L) 大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1： 1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度（不>0.26) 低离子强度的溶液中，SDS单体才具有 较高的平衡浓度。
（3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分
子才能被解聚，SDS才能定量地结合到 亚基上而给出相对迁移率和分子量对 数的线性关系。
还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳
（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 平板电泳
垂直电泳 水平电泳
2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
分离胶聚合之后
（3） 加样品
样品的处理 在蛋白溶液中加入过量的SDS后，可引起以
下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形
①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，
蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。
②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保
护SH基团，而得到窄的电泳带。
三、去污剂的选择 无离子去污剂：Lubro W；Brij35， Tween Triton 阳离子去污剂：cetyltrimethyl ammonium bromide （CTAB） cetylpyyridinium （CPC） 阴离子去污剂：SDS deoxycholate
四、方法 1、分类 （1）根据对样品的处理方式的不同
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE
(新)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)
凝胶的制备：
凝胶由分离胶和浓缩胶组成： 其pH为6.8，由于快慢离子所形成的高电压梯度， 使得变性蛋白质分子在泳动中被压缩为很薄的一层， 大大提高了分辨率。 下层为分离胶，凝胶孔径较小，有分子筛效应，pH 为8.8，变性蛋白质分子所带负电荷基本一致，泳动 速度主要决定于分子量。
凝胶的制备凝胶由分离胶和浓缩胶组成上层为浓缩胶凝胶孔径较大没有分子筛效应其ph为68由于快慢离子所形成的高电压梯度使得变性蛋白质分子在泳动中被压缩为很薄的一层大大提高了分辨率
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS－PAGE）
原理：蛋白质或多肽与SDS结合，经热变性和二 硫键的还原，形成所带负电荷相对一致的非折叠 衍生物，其泳动速度主要由分子量决定。
3. 上述溶液混匀后，用滴管迅速加入两玻璃板间， 灌注高度为红色背景下沿线。然后滴上少量水饱 和异丁醇，静置约15分钟。 4. 待凝胶与异丁醇出现分层时，倒去异丁醇，用洗 瓶冲洗凝胶顶部，然后拿一烧杯，按下表加入各 试剂： （4％浓缩胶） 单体溶液 0.4ml 浓缩胶缓冲液（pH6.8） 0.38ml 超纯水 2.15ml 10％SDS 30ul 10％TEMED 15ul 10%过硫酸铵 30ul
5. 上述溶液混匀后，用滴管迅速加入已制好分离 胶的玻璃板间，灌满后，小心插入梳子，静置 30分钟。 6. 待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子。小心取出玻 璃板，取掉垫条后，缺口朝内放入电泳槽主体， 插入斜楔板。 两组用一个电泳槽主体，两组玻璃板间即为上 槽。 7. 装好的电泳槽主体放入下槽，往上下槽加入 Tris－甘氨酸电极缓冲液。用滴管冲洗凝胶顶 部，并赶走底层的气泡。
样品制备：
蛋白质样品需变性并结合SDS，形成所带负电荷相 对一致的非折叠衍生物。 四人一组，取一1.5离心管，加入30ul鼠IgG样品 和30ul样品缓冲液，混匀后沸水浴5分钟， 3000rpm离心数秒，每人取10ul加样。
实验十 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质
实验十聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质【实验目的】1. 了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理；2. 掌握用此法分离蛋白质组分的操作方法。
【实验原理】在生物化学、分子生物学和基因（遗传）工程实验中，常常要进行蛋白质和核酸的分离工作。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白质或核酸分离的一种电泳方法。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（acrylamide，简称ACR）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（N,N-methylene bisacrylsmide 简称BIS）在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。
通过改变单体浓度与交联剂的比例，可以得到不同孔径的凝胶，用于分离分子量大小不同的物质。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：催化剂采用过硫酸铵，加速剂为N,N,N,N－四甲基乙二胺（简称TEMED）。
通常控制这二种溶液的用量，使聚合在1小时内完成。
（2）光聚合：通常用核黄素为催化剂，通过控制光照时间、强度控制聚合时间，也可加入TEMED 加速反应。
聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类：第一类为连续的凝胶（仅有分离胶）电泳；第二类为不连续的凝胶（浓缩胶和分离胶）电泳。
一般地，不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应：①电荷效应（电泳物所带电荷的差异性）；②凝胶的分子筛效应（凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致）。
③浓缩效应（浓缩胶与分离胶中聚丙烯酰胺的浓度及pH的不同，即不连续性所致）。
因此，样品分离效果好，分辨率高。
SDS即十二烷基硫酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate，简称SDS）是阴离子表面活性剂，它能以一定比例和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物。
这时，蛋白质即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低仍至消除。
SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝胶电泳详解
（3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分
子才能被解聚，SDS才能定量地结合到 亚基上而给出相对迁移率和分子量对 数的线性关系。
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（二）缓冲系统的选择 一般情况下，在被分析的蛋白质
稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互作 用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的 选择对蛋白质的分离和电泳的速度是 非常关键的。
还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳
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（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 平板电泳
垂直电泳 水平电泳
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2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
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（4） 电泳 （5） 固定
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（6） 染色 考马斯亮蓝（coomassie brilliant blue） ①R-250 三苯基甲烷，红蓝色，每个分子含 有两个SO3H基团，偏酸性，和氨基黑 一样也是结合在蛋白质的碱性基团上。
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②G-250 二甲花青亮蓝，蓝绿色。
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①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，
蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。
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②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保
护SH基团，而得到窄的电泳带。
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③非还原的SDS处理 许多样品，如生理体液、血清或尿素，
一般只需用1%SDS在100℃煮沸3分钟，并不需 要加还原剂，此时二硫键不能被断裂，蛋白 并没有完全被去折叠。
SDS—PAGE凝胶电泳(细致分析)
SDS-PAGE电泳的基础原理和实验步骤1.名称：SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳2.原理：此项技术的原理，是根据样品中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。
不同的蛋白质在不同的pH值下表现出不同的电荷，同时蛋白质具有不同的大小和形状。
为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理。
上样缓冲液由Tris-HCl （pH6.8）、甘油，10％SDS、β-巯基乙醇、0.1％溴酚蓝以及蒸馏水组成。
其各自的作用如下述：SDS 即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。
由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或者单个肽链，因此测定结果只是亚基或者单个肽链的分子量。
同时，SDS与蛋白质结合引起蛋白质的构象改变，形成长椭圆棒状，不同蛋白质短轴长度都一样，长轴随蛋白分子量不同而不同，这样就消除了性状的影响。
另外，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
甘油用以增大样品液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。
样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
样品液和浓缩胶中Tris-HCl均为pH6.8,上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸（pH8.3）,分离胶含Tris-HCl(Ph8.8).电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8 的上层，pH8.8 的分离胶层在下层，上槽为负极，下槽为正极。
SDS-PAGE变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验六 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法—蛋白质的分子量测定【实验目的】1.掌握SDS—聚丙烯酰胺电泳法的原理。
2.学会用此种方法测定蛋白质的分子量。
【实验原理】SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。
该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。
SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。
SDS—蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。
由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。
SDS—PAGE因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。
SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
【实验材料】1.实验器材微型凝胶电泳装置；电源（电压200V，电流500mA）；100℃沸水浴；Eppendorf管；微量注射器（50μl或100μl）；干胶器、真空泵或水泵；带盖的玻璃或塑料小容器；摇床。
2.实验试剂⑴ 2mol/L Tris-HCl (pH8.8):取24.2g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH8.8（约加4ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。
⑵ 1mol/L Tris-HCl (pH8.8):取12.1g Tris, 加50ml蒸馏水，缓慢的加浓盐酸至pH6.8（约加8ml）；让溶液冷却至室温，pH将会升高，加蒸馏水至100ml。
SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)原理
保存条件： 4℃保存。
注意事项：
Ø 易燃，有腐蚀性，请注意防护。
Ø为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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过硫酸铵 分子式: (NH4)2S2O8 分子量: 228.20
性状：过硫酸铵是一种白色、无味晶体，常作强氧化剂使用，也可用作单体聚合引发 剂。它几乎不吸潮，由于能达到很高的纯度而具有特别好的稳定性，便于储存。另外， 它还具有使用方便、安全等优点。 储存及使用注意事项：
N, N -亚甲基双丙烯酰胺又名甲撑双丙烯酰胺 , 英文缩写名 MBA, 为白色或浅黄色 粉末状结晶 , 毒性低 , 对皮肤无刺激 , 无神经毒性 , 溶于水及乙醇、丙酮等有机溶剂。 在它的结构中具有两个相同且非常活泼的反应性官能团 , 可作为交联剂 ,能将线性高 分子迅速转变为体型高分子 , 制备吸水性聚合物 , 还可与各种离子型单体发生聚合 反应 ,使其在石油开采以及医药、水处理等行业具有广泛用途。
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Acr-Bis
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶 是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N'-甲叉双丙烯酰 胺（N,N'-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成 的。 Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时 应避免接触皮肤。但在具有自由基团体系时，它们聚合。引发产生自由基团的 方法有两种，即化学法和光化学法。
是阴离子型表面活性剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物， 再与PAGE技术结合，则谱带差异更加明显、清晰，并可测定蛋白质分子量。
SDS-PAGE(SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳)原理
[毒性] 丙烯酰胺属中等毒类，对眼睛和皮肤有一定的刺激作用，可经皮肤、呼吸道和消化道吸收，
在体内有蓄积作用，主要影响神经系统，急性中毒十分罕见。密切大量接触可出现亚急性中毒，
中毒者表现为嗜睡、小脑功能障碍以及感觉运动型多发性周围神经病。长期低浓度接触可引起慢
性中毒，中毒者出现头痛、头晕、疲劳、嗜睡、手指刺痛、麻木感，还可伴有两手掌发红、脱屑，
度；同时通过加强个人防护，如戴口罩、手套，穿防护服和鞋等，以防止或减少丙烯酰胺进入体
内。
⒉日常生活中尽量避免过度烹饪食品，如温度过高或加热时间太长。提倡平衡膳食，减少油炸和
高脂肪食品的摄入，多吃水果和蔬菜，不要吸烟。
⒊由于煎炸食品是我国居民常吃的食物，国家应加强膳食中丙烯酰胺的监测与控制，开展我国人
群丙烯酰胺的暴露评估，并研究探索减少加工食品中丙烯酰胺含量的方法
精品文档
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N.N-亚甲基双丙烯酰胺（甲叉）（N,N’-methylene bis acrylamide）
N.N-亚甲基双丙烯酰胺，别名MBA，双叫N.N-甲叉双丙烯酰胺，次甲基双丙烯酰胺， N.N-甲撑双丙烯酰胺。是一种白色晶体粉末，无味，吸湿性极小。遇高温或强光则 自交联，微溶于水、乙醇。
手掌、足心多汗，进一步发展可出现四肢无力、肌肉疼痛以及小脑功能障碍等。
丙烯酰胺慢性毒性作用最引人关注的是它的致癌性。丙烯酰胺具有致突变作用，可引起哺乳动物
体细胞和生殖细胞的基因突变和染色体异常。动物试验研究发现，丙烯酰胺可致大鼠多种器官肿
瘤，如乳腺、甲状腺、睾丸、肾上腺、中枢神经、口腔、子宫、脑下垂体肿瘤等。但目前还没有
丙烯酰胺单体和交联剂N1 N′-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成含有酰胺 基侧链的脂肪族长链。相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来就形成三维网状结构的 聚丙烯酰胺凝胶。
SDSPAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳详解演示文稿
溴酚蓝迁移距离
蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度 Rf= ————————— X —————————
干燥后的凝胶长度 溴酚蓝迁移距离
2、作图 以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐
标，Rf为横坐标绘图
3、通过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标 准曲线上读出他的分子量
（2）“皱眉”现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引起
的，特别是当凝胶和玻璃板组成的 “三明治”底部有气泡或靠近隔片的 凝胶聚合不完全。
（3）“拖尾”现象 样品溶解不佳引起。
（4）“纹理”现象 由于样品中的不溶颗粒引起的。
（5）偏斜现象 电极放置不平行引起或加样位置偏斜而引
起
（6）带太宽 加样量太多或加样孔泄漏引起
还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳
（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
分离胶聚合之后
（3） 加样品
样品的处理 在蛋白溶液中加入过量的SDS后，可引起以
蛋白质-SDS胶束的特点 （1）形状像一个长椭圆棒 （2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS 胶束基本上是相同的。 （3）长轴的长度则与亚基分子量的大 小成正比。
胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁 移率不再受蛋白质原有电荷的影响， 而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即 蛋白质或亚基分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系
下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶（SDS-PAGE）电泳
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶（SDS-PAGE）电泳每日生物评论资讯/技术/知识/智慧原理十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，简称SDS-PAGE）是聚丙烯酰胺凝胶电泳中最常用的一种蛋白表达分析技术。
此项技术的原理，是根据检体中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。
聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应，蛋白质在电场中支持物上的迁移率差异主要依赖于样品中各种分子携带的电荷，分子大小与形状的差别。
聚丙烯酰胺凝胶电泳系统加入阴离子去垢剂SDS，蛋白质在加热变性以后与SDS结合，带上负电荷，在电场的作用下，向正极移动，结果按分子量大小排列在胶板上，含量多的蛋白带纹粗，蛋白质的迁移率主要取决于分子量大小。
SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。
在大肠杆菌表达纯化外源蛋白的实验中，SDS-PAGE 更是必不可少的操作，其通常用于检测蛋白的表达情况（表达量，表达分布），以及分析目的蛋白的纯度等。
作用机理SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
当样品液和浓缩胶选Tris/HCl缓冲液，电极液选Tris/甘氨酸。
电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。
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（三）凝胶浓度的选择 由于SDS电泳分离并不取决于蛋白 质的电荷密度，只取决于分子解聚后 SDS-蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓 度的选择会直接影响分辨率。 不同分子量范围的蛋白质应选用 不同的凝胶浓度.
（四）分子量测定 1、相对迁移率（Rf） Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚 蓝前沿的迁移距离得到的。 测量位置应在蛋白带的中央。
Dalton is defined as 1/12 the mass of carbon 12. Most macromolecules are large enough to use the kiloDalton (kDa) to describe molecular mass. Molecular weight is not the same as molecular mass. It is also known as relative molecular mass (symbol Mr, where r is a subscript). Molecular weight is defined as the ratio of the mass of a macromolecule to 1/12 the mass of a carbon 12 atom. It is a dimensionless quantity. When the literature gives a mass in Da or kDa it refers to molecular mass. It is incorrect to express molecular weight (relative molecular mass) in Daltons. Nevertheless you will find the term molecular weight used with Daltons or kiloDaltons in some literature, often using the abbreviation MW for molecular weight.
蛋白质-SDS胶束的特点 （1）形状像一个长椭圆棒 （2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶 束基本上是相同的。 （3）长轴的长度则与亚基分子量的大 小成正比。
胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁 移率不再受蛋白质原有电荷的影响， 而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即 蛋白质或亚基分子量的大小。 当蛋白质的分子量在15KD—200KD 之间时，电泳迁移率与分子量的对数 呈线性关系
蛋白带迁移距离 ———————— 溴酚蓝迁移距离
Rf=
蛋白带迁移距离 Rf= ————————— X 干燥后的凝胶长度
固定前的凝胶长度 ————————— 溴酚蓝迁移距离
2、作图 以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐 标，Rf为横坐标绘图
3、通过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标 准曲线上读出他的分子量
（3）“拖尾”现象 样品溶解不佳引起。
（4）“纹理”现象 由于样品中的不溶颗粒引起的。
（5）偏斜现象 电极放置不平行引起或加样位置偏斜而 引起
（6）带太宽 加样量太多或加样孔泄漏引起
Molecular mass versus molecular weight Molecular mass (symbol m) is expressed in Daltons (Da). One
（7） 照相，凝胶干燥 （8） 定量测定
3、电泳过程中的不正常现象 （1）“微笑”现象 指示剂前沿呈现两边向上的曲线 形，说明凝胶的不均匀冷却，中间部 分冷却不好。
（2）“皱眉”现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引 起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的 “三明治”底部有气泡或靠近隔片的 凝胶聚合不完全。
三、去污剂的选择 无离子去污剂：Lubro W；Brij35， Tween Triton 阳离子去污剂：cetyltrimethyl ammonium bromide （CTAB） cetylpyyridinium （CPC） 阴离子去污剂：SDS deoxycholate
四、方法 1、分类 （1）根据对样品的处理方式的不同 还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳
（4） 电泳 （5） 固定
（6） 染色 考马斯亮蓝（coomassie brilliant blue） ①R-250 三苯基甲烷，红蓝色，每个分子含 有两个SO3H基团，偏酸性，和氨基黑 一样也是结合在蛋白质的碱性基团上。
②G-250 二甲花青亮蓝，蓝绿色。
银染色 银染的机制是将蛋白带上的硝酸 银（银离子）还原成金属银，以使银 颗粒沉积在蛋白带上。
（二）缓冲系统的选择 一般情况下，在被分析的蛋白质 稳定的pH范围，凡不与SDS发生相互作 用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的 选择对蛋白质的分离和电泳的速度是 非常关键的。
电泳缓冲液的种类： 1、磷酸缓冲液 2、Tris-醋酸钠缓冲系统 3、咪唑缓冲液系统： 比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速 度要比后者快一倍。 4、尿素系统： 适用分子量低于15KD的蛋白样品。 5、Tris-甘氨酸系统： 使用最多的缓冲液 6、Tris-硼酸盐缓冲液： 测定糖蛋白的分子量
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE
一、什么是SDS？
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在。
①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后， 蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。
②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保 护SH基团，而得到窄的电泳带。
③非还原的SDS处理 许多样品，如生理体液、血清或尿素， 一般只需用1%SDS在100℃煮沸3分钟，并不需 要加还原剂，此时二硫键不能被断裂，蛋白 并没有完全被去折叠。
SDS的作用
破坏蛋白质分子之间以及其他物质分 子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变 原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结 合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
二、SDS-PAGE的基本原理
（一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离 子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基 的电泳迁移率主要取决于亚基分子量 的大小，而电荷因素可以被忽略。
1、SDS 阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂 断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构
2、强还原剂 巯基乙醇（β-meitol，DTT）
使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。
SDS和还原剂的作用：
（1）分子被解聚或组成它们的多肽键 （2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负 电荷的蛋白质-SDS胶束。 （3）蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超 过了蛋白质分子原有的电荷量，消除 了不同分子之间原有的电荷差异。
3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度（>1mmol/L) 大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1： 1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度（不>0.26) 低离子强度的溶液中，SDS单体才具有 较高的平衡浓度。
（3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分 子才能被解聚，SDS才能定量地结合到 亚基上而给出相对迁移率和分子量对 数的线性关系。
（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳 不连续电泳 （3）根据电泳的形式 圆盘电泳
垂直电泳
平板电泳 水平电泳
2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
分离胶聚合之后
（3） 加样品
样品的处理 在蛋白溶液中加入过量的SDS后，可引起以 下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形