酵母菌高密度发酵

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 是发酵工业最常用的菌种之一 在发酵中如果单方面提高发酵 液中的碳源含量，酵母菌就会 生成乙醇或乙酸，但其生物量 则有所下降；如果将碳源保持 在最低水平，就会限制酵母的 生长。而利用分批补料发酵的 方式，既可以满足高密度 发酵 时酵母细胞对营养源的大量需 求，又能减少生长抑制物质的 产生。
我们用的培养基类型
种子培养基：蔗糖25g/L，尿素3g/L，KH2PO4 10g/L,MgSO4 2.5g/L,微量元素10 ml/L，维生素液 15ml/L，pH 5.0（供发酵前菌体大量生长繁殖） 发酵培养基：（NH4）2SO4 15g/L，KH2PO4 8.0g/L， MgSO4 3.0g/L,微量元素液 10 ml/L，消泡剂 0.3ml/L， ZnSO4 0.4g/L. 流加培养基：KH2PO4 9.0g/L,MgSO4 2.5g/L,K2SO4 3.5g/L,NaSO4 0.28g/L,蔗糖500g/L（流加补料，用于 维持高比生长速率或者高产物生产速率）
影响酵母高细胞密度发酵的因素
• • • • • • • • • 培养基的营养物质 溶解氧（DO） 压力 CO2 温度 pH值 发酵液的流变学 接种量 生长抑制性物质
培养基的营养物质的影响
所需营养物质：水分、碳源物质、 氮源物质、无机元素、生长因子
培养基中的基质的种类和浓度直接影响到细胞的代 谢变化和产物的合成。在发酵前期，碳源和氮源的 浓度迅速下降，在中后期主要用于合成产物，其浓 度下降趋于平稳。碳源和氮源的比例偏小，会导致 细胞生长旺盛，提前衰老自溶；而其比例偏大，则 细胞繁殖数量少，代谢不平衡，不利于产物积累。
生产条件总汇
• • • • • • • • • • 接种量：10% 温度：30℃ PH：5.0 DO溶解度：40%~60% 罐压：0.05Mpa CO2溶解度：1%~3% 转速：300rpm~600rpm 调节PH：氨水或者硫酸铵 补料时间：有待观察（2~4h左右） 通气量：50~100L/h
培养基汇总
过程控制途径：培养基设计、反应器的 设计和选择、发酵控制策略等
Байду номын сангаас
酵母菌的高细胞密度发酵
酵母的高密度发酵是一个相对的概念，一 般指发酵液中的酵母细胞浓度在100g/L以 上。 酵母属大约包括40种，每个种都能通过出芽产 生球状或椭圆状的细胞。 酵母菌是一种兼性厌氧菌，当酵母在低浓度的 葡萄糖中进行好氧生长时，它能把葡萄糖分解 成二氧化碳和水。当酵母在厌氧条件下生长时， 葡萄糖主要生成乙醇和二氧化碳。
压力的影响
在发酵工程中必须保持罐压为正压，如果 罐压为0或者负压，则会造成细胞的染菌， 甚至造成整罐发酵液的废气。罐压增高能 适度增加氧在发酵液中的溶解度，但二氧 化碳在水中的溶解度要比氧大30倍，溶解 过多的二氧化碳会造成细胞染菌，所以罐 压也不能太高。 我们选取的罐压为0.05Mpa.
CO2的影响
种子培养基：蔗糖25g/L，尿素3g/L，KH2PO4 10g/L,MgSO4 2.5g/L,微量元素10 ml/L，维生素液 15ml/L，pH 5.0 发酵培养基：（NH4）2SO4 15g/L，KH2PO4 8.0g/L， MgSO4 3.0g/L,微量元素液 10 ml/L，消泡剂 0.3ml/L， ZnSO4 0.4g/L.
啤酒酵母的高密度发酵
生物与食品工程学院 10级生物技术 发酵工程第六组
组员
• • • • • • • • • • 李向阳：201006040063 何启鹏：201006040062 李晓孟：201006040056 晋玉北：201006040057 韩文彦：201006040060 朱雪瑞：201006040061 尚玉攀：201006040059 崔文东：201006040066 王 迪：201006040067 彭云风：201006040058
流加培养基：KH2PO4 9.0g/L,MgSO4 2.5g/L,K2SO4 3.5g/L,NaSO4 0.28g/L,蔗糖500g/L
• 微量元素：在1L溶液中含有EDTA15g，
znso45.75g， Mncl20.32g,Cuso40.50g,Cocl20.47g,N a2MoO40.48g,Cacl22.9g,Feso42.8g,12 1℃湿热灭菌20min待用。
高细胞密度发酵 （high cell density fermentation,HCDF）
高细胞密度发酵是一个相对的概念，一般 指发酵液中细胞浓度在30g/L以上。但是对 于一些极端微生物或自养微生物，细胞浓 度如果达到1g/L也算比较高的细胞密度。
影响因素：培养基、接种量、生长抑制性物质、 溶解氧浓度、温度、pH等
增加发酵液中DO的方法
1.提高机械搅拌速率 适当提高搅拌转速，增加气液接触面积，有利于 氧的传递，但搅拌速率过大会使发酵泡沫过多， 反而会导致DO降低。 2. 增大空气流量 空气流量的增大减小了氧传质工程中的气膜阻力， 有利于氧的传递吸收。但过大的流量会形成“过 载”现象，使大量发酵液蒸发，引起浓缩和粘度 上升。
酵母生长过程中产生大量的CO2对细胞 具有直接的毒害作用，而且溶解于发酵 液中会导致pH值的下降。发酵液中的 CO2的溶解度达到7.04%就可抑制酵母 细胞的生长，高于4%则生长下降，一 般发酵液中的CO2的溶解度应控制在 1%~3%之间。
pH值的影响
在发酵过程中，pH值的变化取决于所用的菌种、 培养基和培养条件。如果pH值的波动导致其偏理 了细胞所需的最适范围，将会引起各种酶活力的 改变，影响细胞代谢。酵母细胞利用酵母细胞利 用葡萄糖产酸产气，发酵时产生的有机酸（主要 是乙酸）可导致发酵液的pH值降低。另外细胞释 放的CO2也会导致pH的降低。 啤酒酵母的最适PH4.5~5.0.我们发酵用PH=5.0 调节PH用氨水或者硫酸铵，可以视情况随同补料一 块添加
培养基配制注意事项
1.碳源与氮源分开灭菌，防止“美 拉德反应”产生有毒物质抑制菌体 生长； 2.蔗糖要单独灭菌后加入，尿素和 维生素液通过微孔滤膜过滤除菌后 加入； 3.为防止焦糖化反应，将碳水化合 物pH调至低于4.0灭菌
溶解氧（DO）的影响
DO是发酵工程中的一个关键限制因素，是高 细胞密度发酵过程中影响酵母生长的重要因 素之一。在高密度发酵的后期由于细胞密度 的扩增，耗氧量极大，发酵罐的各项物理参 数不能满足对氧的供给，造成DO下降，细胞 生长减慢。 溶解氧（DO）范围：40%<DO<60%.
在高细胞密度发酵过程中，如果葡萄糖浓度 超过其一阈值，碳源供给量高于酵母所能同 化的速率，即使是在供氧充足的条件下也会 发生克拉布特里（Crabtree）效应而产生乙 醇，而糖的有氧氧化受到抑制，这是对发酵 不利的。所以要对营养物的配比进行优化
解决途径：在实际发酵中，基质 浓度和碳源氮源比例主要依靠流 加补料来实现和维持。（碳氮比、 流加量、流加频率）
• 维生素：在1L溶液中含有维生素H0.05g， 泛酸钙1.0g，烟酸1.0g，肌醇25.0g,对氨基 苯甲酸0.2g，硫胺素1.0g，吡哆醇1.0g。
谢谢观赏 10-生技 第6组
接种量的影响
• 接种量是指移入的种子液和培养液体 积的比例，它的大小决定了菌种在发 酵罐中的生长速度。过多过少都不好， 在一定范围内增加接种量有利于菌体 的生长。因此，接种应根据实际情况 确定接种量。
在常见的小型发酵罐中接种量范围在 5%~10%。我们取最大接种量10%
后期补料量及参数
• 发酵开始是为分 批发酵，当作为 碳源的蔗糖耗尽 后，表现为DO的 突然升高和CO2 产生量、O2消耗 量的突然上升， 这时开始流加培 养。
微量元素配方和维生素配方
• 微量元素:在1L溶液中含有EDTA15g，
znso45.75g,Mncl20.32g,Cuso40.50g,C ocl20.47g,Na2MoO40.48g,Cacl22.9g,F eso42.8g,121℃湿热灭菌20min待用。
• 维生素：在1L溶液中含有维生素H0.05g， 泛酸钙1.0g，烟酸1.0g，肌醇25.0g,对氨基 苯甲酸0.2g，硫胺素1.0g，吡哆醇1.0g。