毕赤酵母实验操作技巧介绍材料
毕赤酵母实验操作技巧介绍材料
颍上新城质差室分分析案例摘要：随着VOLTE百日大会战的开启，我部对阜阳质差室分进行摸排分析，目前质差室分原因主要为馈线问题、室分泄漏、宏站与室分切换等，针对不同原因，采用工程维护、RF及工参优化等手段进行改善。
关键字：馈线问题、室分泄漏、工程维护、RF及工参优化【故障现象】：3月上旬，发现该XY-FY-颍上-颍上新城-HFTA-436961-3小区室分MR 覆盖率仅为90.1%，该室分覆盖东西两栋30层高层，其中1-4F为商场部分，未做室分覆盖，采样点较少。
【原因分析】：此类室分质差主要从以下几点分析原因：（1）是否存在告警及馈线驻波告警；（2）室分泄漏；（3）室内外切换重选参数是否合理；（4）馈线故障。
1.原因排查：（1）对该小区进行告警排查及驻波测试，无异常，驻波均值正常值范围内,如下图所示：（2）针对是否存在室内泄漏，对该小区周边楼宇进行测试，周边楼宇主要占用的信号为1.8G宏站FY-颍上-鑫都华庭-HFTA-437970-61、FY-颍上-颍上荣禾绿园-HFMA-436418-55。
XY-FY-颍上-颍上新城-HFTA-436961-3主要为平层覆盖，为发现室分泄漏。
（3）对颍上新城进行室内摸排，测试过程中，主要占用为室分信号，切换无异常，该楼宇室分覆盖如下所示：根据设计图纸及网管资料，该室分系统主要覆盖东西两单元30F及地下车库，现场摸排中发现，RSRP均值为 -75dbm，SINR均值为28dbm，室分整体覆盖良好，其中东西单元1-4F电梯室分覆盖效果较差，平均RSRP均值为-108dbm，SINR均值为2dbm，西单元的10-11F主要为宏站信号，该层怀疑为室分馈线故障导致，如下所示：并且根据设计图纸，该楼宇存在地下停车场，对该区域进行测试，发现，由于纠纷问题，原覆盖新城1-4F的商场部分的XY-FY-颍上-御水兰庭-HFTA-437017-2室分，未能覆盖该区域，该设备位于负一层电梯口附近的弱电井，设备AB口为临时接的蘑菇头，该设备只能覆盖电梯口至地下停车场之间走廊的部分区域，剩余区域则为弱覆盖区域，主要占用信号为为地下停车XY-FY-颍上-颍上新城-HFTA-436961-3室分覆盖，平均RSRP均值为-105dbm，SINR均值为6dbm。
毕赤酵母实验操作手册
毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵间题［1］。
与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的量下降。
同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时，往往导致产量的酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。
毕赤酵母发酵工艺手册
毕赤酵母发酵工艺手册1. 引言欢迎使用毕赤酵母发酵工艺手册。
本手册旨在介绍毕赤酵母发酵的基本原理、工艺步骤以及相关注意事项。
通过遵循本手册，您可以更好地理解和掌握毕赤酵母的发酵过程，从而在生产中取得更好的效果。
2. 毕赤酵母发酵基本原理- 毕赤酵母是一种常见的酵母菌，其发酵能力强，适用于多种发酵产品的生产。
- 发酵是指通过酵母菌对底物中的糖类进行代谢，产生酒精和二氧化碳的过程。
- 毕赤酵母在发酵过程中需要适宜的温度、pH值和营养物质等条件。
3. 毕赤酵母发酵工艺步骤1. 发酵前准备：- 准备好所需的发酵基质，包括糖类、氮源和维生素等。
- 对基质进行消毒处理，确保无害菌的存在。
2. 接种毕赤酵母：- 选择合适的毕赤酵母培养液进行接种，注意接种量的控制。
- 将毕赤酵母培养液均匀加入发酵基质中。
3. 发酵条件控制：- 控制发酵温度在合适的范围内，一般为25-30摄氏度。
- 监测发酵基质的pH值，保持在适宜的范围内。
- 提供足够的氧气供给，促进酵母的生长和代谢。
4. 发酵过程监测：- 定期对发酵过程中的温度、pH值和酵母数量等进行监测和记录。
- 根据监测结果及时调整发酵条件，确保发酵过程稳定进行。
5. 发酵结束：- 当发酵基质中的糖类被完全代谢，产物达到预期时，发酵过程结束。
- 将发酵产物经过处理和提取，得到最终的产品。
4. 注意事项- 在发酵过程中，应注意卫生和消毒，以防止杂菌的污染。
- 严格控制发酵条件，避免过高或过低的温度、pH值对发酵效果产生不利影响。
- 根据不同的发酵产品，可能需要调整发酵步骤和条件，建议根据具体要求进行调整。
- 在使用本工艺手册时，请参考其他文献和专业意见，确保准确性和可靠性。
以上是关于毕赤酵母发酵工艺手册的简要介绍。
希望本手册能对您在毕赤酵母的发酵工艺中提供帮助和指导。
如有任何问题，请随时与我们联系。
谢谢！。
毕赤酵母表达经验总结
毕赤酵母表达经验总结甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。
虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。
不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。
其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。
甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。
+++=4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。
=+5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低+++++ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。
毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。
毕赤酵母转化方法
毕赤酵母转化方法
实验概要
本实验介绍了毕赤酵母电转化方法。
该方法无需产生去壁细胞，是产生毕赤酵母重组子的简便方法。
与去壁细胞效率相似。
实验步骤
1. 细胞准备：
1) 在含5mlYPD 的50ml 离心管中，培养毕赤酵母，30 度过夜。
2) 取0.1-0.5ml 过夜培养物，接种含500ml 新鲜培养基的2L 摇瓶，过夜生长至OD600＝1.3-1.5。
3) 在4 度，1500g离心5min收集细胞，用500ml预冷的灭菌水悬浮细胞。
4) 如上离心，用250 ml预冷的灭菌水悬浮细胞。
5) 如上离心，用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞。
6) 如上离心，用1 ml 预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml。
注意：可冻存80ul 等量的电感受态细胞，但转化效率会下降很多。
2. 转化：
1) 取80ul上述细胞与5-20ug线性化DNA(溶于5-10ulTE)混合，转入预冷的0.2cm 电转杯中。
2) 在冰上放置5min。
3) 根据所使用装置推荐的酿酒酵母参数进行电击。
4) 立即加入1ml 预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中。
5) 分成200-600ul等份，涂于MD 或RDB平板上。
6) 在30 度孵育平板至克隆产生，筛选Mut /Muts表型。
毕赤酵母表达(pichia pastoris expression )实验手册(3)
毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册（3）液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。
加入Ze ocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。
2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medi um）：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol 1 M+agar 2%+ Zeocin 100 μg/ml不管是液体 YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。
2.5 MGYMinimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。
将800ml灭菌水、100ml的 10* YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。
2.6 MGYHMinimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培养基 + 0.004%组氨酸）在1000ml的MGY培养基中加入 10ml的100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。
2.7 RDRegeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基）（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0. 005%氨基酸）1. 将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌；2. 冷却后于45℃水浴；3. 将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤2 的山梨醇溶液混合。
4℃保存。
2.8 RDHRegeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培养基 + 0.004%组氨酸）在RD培养基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同时无菌水的体积减少至78ml即可，其余配制方法与RD相同。
毕赤酵母转化方案
毕赤酵母转化方案引言毕赤酵母（Baker’s Yeast）是一种常见的酵母菌，广泛用于食品加工和发酵过程中。
毕赤酵母可以将碳源转化为二氧化碳和乙醇，从而实现食品发酵和面团膨胀。
本文将介绍毕赤酵母的转化方案，包括酵母培养、酵母转化条件以及转化效果的评价。
酵母培养在进行毕赤酵母的转化实验之前，首先需要进行酵母的培养。
以下是酵母培养的步骤：1.将酵母菌存活液取出适量转移到含有酵母培养基的培养皿中。
2.用无菌棉签在培养皿上划线，以便观察酵母生长情况。
3.将培养皿封闭并置于恒温摇床中，在适当的温度下培养酵母。
酵母转化条件酵母的转化条件对于转化效果具有重要影响。
以下是常见的酵母转化条件：温度酵母转化的温度是一个重要的参数，常用的温度范围为25-40摄氏度。
不同温度下酵母的代谢和生长速率不同，因此选择合适的转化温度可以提高转化效率。
pH值pH值是影响酵母生长和代谢的另一个重要参数。
酵母转化的pH范围通常为4-7，在这个范围内酵母的生长和代谢能力较强。
溶氧量溶氧量是影响酵母转化效果的另一个因素。
较高的溶氧量可以促进酵母的生长和代谢，提高转化效率。
因此，在实验过程中应保证适当的氧气供应，通过搅拌或通气的方式提高溶氧量。
传质条件传质条件（如搅拌速度、传质面积等）也会对酵母转化效果产生影响。
适当的搅拌可以保证培养液中养分的均匀分布，提高转化效率。
同时，增加传质面积（如使用气泡或转子发酵罐）可以增加酵母与培养基之间的接触面积，促进转化反应进行。
转化效果评价转化效果通常通过酵母的生长情况、代谢产物的生成以及发酵过程的监测来进行评价。
1.酵母的生长情况可以通过观察培养液中的酵母颗粒的数量和大小以及液体的浑浊度来判断。
较好的转化效果应该能够促使酵母迅速生长和繁殖。
2.代谢产物的生成是评价转化效果的重要指标之一。
对于毕赤酵母来说，主要的代谢产物是二氧化碳和乙醇。
可以通过气体检测仪或化学分析方法来测定其生成量，以评估转化的效果。
常用试剂培养基 毕赤酵母实验技术
10×YNB（13.4%酵母氮源，含硫酸铵不含氨基酸）：溶解13.4gYNB于100mL水中，过滤除菌，加热至YNB完全溶解，存于4℃。
500×B（0.02%生物素）：溶解20mg生物素于100mL水中，过滤除菌，放于4℃。
100×AA（0.5%各种氨基酸）：溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL水中，过滤除菌，存于4℃。
10×D（20%葡萄糖）：溶解200g D-葡萄糖于1 000mL水中，高压灭菌15min或过滤除菌，可放1 年。
500×生物素(0.02%)：溶解20mg生物素于100mL水中，过滤除菌，放于4℃，可放1年。
100×H（0.4%组氨酸）：溶解400mg L-组氨酸于100mL水中，低于50度加热以促溶解，过滤除菌，可放1年。
10×M（5%甲醇）：混合5mL甲醇与95mL水，过滤除菌存于4℃，可放2个月。
10×GY（10%甘油）：混合100mL甘油与900mL水，过滤或高压灭菌，室温放置，可存放1年以上。
100×AA（0.5%各种氨基酸）：溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL水中，过滤除菌，存于4℃，可放1年。
1mol/L磷酸钾缓冲液pH6.0：32mL 1mol/L K2HPO4，868mL 1mol/L KH2PO4，调整pH值为6.0±0.1（如果需调pH值，用磷酸或KOH）。
过滤或高压灭菌，室温下可放1年以上。
100mg/mL遗传霉素：用无菌水制备30mL100mg/mL遗传霉素贮存液，过滤除菌，存于-20℃。
用来制备含不同终浓度遗传霉素平板：0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0，4.0。
5%酵母提取物，10%胰蛋白陈，10%NaCI，pH7.0；高压灭菌后4℃保存。
毕赤酵母实验操作手册
精心整理毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。
与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，人们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外源基因表达的酵母宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。
虽然干扰素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的维特，因此引起产量下降。
同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养母（一。
⑷毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。
Pichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。
利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜子扩大为工业规模［4］。
目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA批准，所以该系统被认为是安全的．Pichia.pastoris表达系统在生物工程领域将发挥越有中，需带有信号肽序列。
毕赤酵母表达操作手册(精译版)
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。
AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。
AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。
表达：AOX1基因的表达在转录水平受调控。
毕赤酵母发酵手册
毕赤酵母发酵手册毕赤酵母发酵手册总览简介：毕赤酵母和酿酒酵母非常相似，都非常适合发酵生长。
毕赤酵母在可能提高总体蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度。
我们建议只有那些有过发酵经验或能得到有经验的人的指导的人参与发酵。
因为发酵的类型很多，所以我们很难为您的个人案例提供详细的过程。
下面所给出的指导是基于Mut+和Muts两种基因型的毕赤酵母菌株在15L的台式玻璃发酵罐中发酵而成。
请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。
下面所给出的表是整个指导的概况。
步骤标题页码1 发酵参数 12 设备推荐和培养基的制备 23 培养中溶氧的测量和使用 34 种子液的培养 45 在分批和分批补料培养中生物量对应于4-5甘油的生成6 Mut+和Muts基因型重组子在甲醇分批补料状态下表达的介绍 6-77 细胞的成熟与衰退 88 参考文献 9-109 配方 11发酵参数：在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。
下面的表格描述了这些参数和监测这些参数的原因。
参数原因温度（30℃）在32℃以上的温度下生长不利于蛋白质的表达溶氧（＞20％）毕赤酵母利用甘油和甲醇需要氧气pH（5.0-6.0和3.0）对于外源蛋白分泌到培养基中和最适生长非常重要转度（500-1500rpm）通气（玻璃发酵罐中为0.1-1.0vvm※）使培养基中的氧浓度达到最大值消泡剂（消除泡沫的最小量）碳源（变化率）每分钟1体积发酵液（L）中氧气的体积（L）使培养基中的氧浓度达到最大值取决于设备推荐：下面是所推荐设备的清单：发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温，尤其是在甲醇流加过程中。
你需要一个固定的来源来提供冷却水（5-10℃）。
这可能意味着你需要一个冷冻装置来保持水的冷却。
一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。
一个氧气的来源——空气（不锈钢的发酵罐需要1-2vvm）或者纯氧（玻璃发酵罐需要0.1-0.3vvm）。
添加甘油和甲醇的补料泵。
pH的自动控制。
毕赤酵母高密度发酵实验流程
毕赤酵母高密度发酵实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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毕赤酵母菌种培养手册
毕赤酵母菌种培养手册1. 引言本手册旨在提供毕赤酵母菌种培养的详细步骤和注意事项。
毕赤酵母（Saccharomyces cerevisiae）被广泛应用于食品工业、酿酒业和生物学研究等领域。
通过正确的菌种培养技术，可以确保毕赤酵母的活力和纯度，从而保证实验和应用的可靠性和准确性。
2. 材料和方法2.1 培养基选择适合的培养基是培养毕赤酵母的关键。
常用的培养基包括YPD培养基、SD培养基和SC培养基等。
根据具体实验需求选择合适的培养基配方，并按照相应操作说明制备。
2.2 菌种的制备和传代1. 从冰冻保存的毕赤酵母菌种中取出适量菌种转移到无菌培养基中。
2. 在适当的温度（通常为30°C）下培养菌种至对数生长期。
3. 取适量无菌培养基转移菌种，传代培养。
2.3 菌种培养1. 取适量菌种转移到含有适量无菌培养基的培养瓶中。
2. 控制培养瓶中的菌液浓度，通常为OD600=0.5。
3. 在适当的温度（通常为30°C）下培养菌种至对数生长期或其他实验所需生长期。
2.4 菌种保存菌种的保存有助于长期维持活力和纯度。
常用的保存方法包括冷冻保存和制备冻干菌种等。
3. 结果和讨论通过本手册提供的方法，可以成功培养并维持毕赤酵母菌种的活力和纯度。
在培养过程中，应注意操作的无菌性和培养条件的合适性。
此外，根据具体实验需求，可适当调整菌液的浓度和培养温度等参数。
4. 总结本手册详细介绍了毕赤酵母菌种培养的步骤和注意事项。
正确的菌种培养技术对于保证实验和应用的可靠性和准确性至关重要。
通过遵循本手册的指南和方法，可以有效地培养毕赤酵母菌种，并取得可靠的实验结果。
请注意，本手册仅提供参考，并且在使用过程中应遵守相关的实验室安全操作和法律法规要求。
毕赤酵母全基因提取方法
毕赤酵母全基因提取方法
1.用EP管收集1.5 mL菌液，12000 rpm 离心1 min，去上清。
用无菌水洗一
遍，重复离心操作，去上清。
2.加入200 μL裂解液，涡旋悬浮。
3.加入200 μL苯酚：氯仿：异丙醇（25:24:1），加入0.3 g 酸洗玻璃珠，涡旋
震荡3 min。
（注：涡旋时，注意管内压强会升高，记住开盖放气，以免管内液体迸出。
）
4.加入200 μL 1×TE，12000 rpm 离心5 min。
离心时在一EP管中加入1 mL
乙醇，并加入20 μL 3 M pH5.2醋酸钠。
置于冰上放置预冷。
5.将离心上清转入预冷的无水乙醇（注意不要碰到中间层），上下翻转6-10次，
使DNA沉淀。
6.12000 rpm 离心2 min，去上清。
7.用1mL 70%乙醇洗涤，12000 rpm 离心2 min，去上清。
静置15 min，挥干
乙醇。
加入50 μL灭菌双蒸水，溶解。
（若用作PCR模板，一般稀释20倍，加入1μL即可）
裂解液(10 mL)：8.48 mL ddH2O+20 μL TritonX-100+1 mL 10% SDS+200 μL 5 M NaCl+100 μL 1 M Tris-HCl（pH 8.0）+20 μL 0.5 M EDTA。
毕赤酵母产木聚糖酶实验方案
重组毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶培养实验毕赤酵母简介甲醇营养型毕赤酵母(Pichia pastoris) 表达系统是80年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。
40年前，Ogata等人首次发现有些酵母能够利用甲醇作为唯一的碳源和能源进行生长。
随后，甲醇营养酵母作为潜在的单细胞蛋白(single cell protein, SCP) 来源立即引起广泛关注，最初将其作为高蛋白的动物饲料在市场上销售。
在20世纪70年代，Phillips Petroleum公司开发出毕赤酵母利用甲醇生长的培养基、发酵操作手册和高密度连续培养生产工艺。
70年代的石油危机导致了甲烷价格的急剧上升，与此同时，动物饲料蛋白的主要替代源——大豆价格的下降，导致利用甲醇生产SCP在经济上已不再合适。
在以后的10年中，PhiLLips PetroLeum公司与SIBIA公司合作开发利用毕赤酵母作为生物体表达外源蛋白的研究，研究人员分离了醇氧化酶(alcohol oxidase, AOX) 的基因和启动子，构建了表达载体和菌株，开发了毕赤酵母基因操作相关技术。
成熟的SCP发酵方法的开发，加上醇氧化酶强启动子的可调控表达特性，极大地影响着外源蛋白在毕赤酵母中的高水平表达。
1993年，Phillips Petroleum公司委托Invitrogen公司代理毕赤酵母表达系统产品。
毕赤酵母能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX ——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30％。
而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。
AOX的合成是在转录水平调控的。
其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。
此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导机制控制的。
外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。
巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。
毕赤酵母诱导表达实验步骤（1）
毕赤酵母诱导表达实验步骤（1）
BMGY的配制（每200 mL）
Yeast extract 2 g
Peptone 4 g
K3PO4(pH 6.0) 20 mL
丙三醇 2 mL
定容至180 mL，121，灭20 min。
使用前再加入
10*YNB 20 mL（10%）（过滤除菌）
生物素0.4 mL（0.02%）（过滤除菌）
加入后，用紫外照射10 min左右再接菌。
BMMY的配制（每200 mL）
Yeast extract 2 g
Peptone 4 g
K3PO4(pH 6.0) 20 mL
定容至180 mL，121，灭20 min。
使用前再加入
10*YNB 20 mL（10%）（过滤除菌）
生物素0.4 mL（0.02%）（过滤除菌）
甲醇0.5%
加入后，用紫外照射10 min左右再接菌。
10*YNB的配制
酵母基础氮源培养基 3.4 g
硫酸铵10 g
双蒸水80 mL
定容至100 mL，过滤除菌（用0.22 μm滤膜过滤）。
毕赤酵母诱导表达
1.配BMGY和BMMY灭菌
2.使用前向BMGY按比例加入生物素、10*YNB，紫外照10 min。
3.接菌于BMGY，250 rpm，28℃摇24 h
4.向BMMY中按比例加入生物素、10*YNB、甲醇，紫外照10
min。
5.将含有菌液的BMGY转移至50 mL离心管，4℃5000 rpm 离心5 min，弃上
清。
6.用BMMY将沉淀菌体重悬，倒回瓶中，250 rpm，28℃，摇3 d。
每24 h补
一次甲醇。
毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选
毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选菌体的准备：1. 挑取酵母单菌落，接种至含有5m l YPD 培养基的50ml 三角瓶中，30℃、250-300r/min培养过夜；2. 取100-500µl（≤1:100）的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min培养过夜(约20h)，至OD600达到1.3~1.5；3. 将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用50ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4. 按步骤3 离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬5. 按步骤3 离心，用2-5ml，1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6. 按步骤3 离心，用160µl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul；备注：可将其分装为80 µl 一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。
比如常见的p P IC9K的载体转G S115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的Y P D平板上筛选高拷贝。
对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMG Y摇瓶发酵。
一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMM Y的功能了。
✓KM71比G S115生长的要慢。
毕赤酵母都应该是白色菌落的✓对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入Cu2+ 离子，提高表达量和蛋白活性?菌种保存：挑单克隆到Y P D中培养18-24h,然后取菌液以1:1加入30%灭菌甘油， -80o C ul/管冻存（一般用10u g以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ulddH2O重溶。
毕赤酵母的摇瓶发酵方法
毕赤酵母的摇瓶发酵方法：一、摇瓶发酵方法:毕赤酵母摇瓶发酵方法分为两个阶段，1、酵母菌株生长阶段；2、脂肪酶诱导表达阶段。
1、酵母生长阶段。
准备试剂：1000ml BMGY培养基，1000ml BMMY培养基，10X的甲醇，摇瓶1L（灭菌），温控摇床，50ml离心管（灭菌）。
紫外分光光度计，石英比色皿。
以下所有操作均在超净台内或者无菌条件下完成。
（1）往灭好菌的IL摇瓶中加入100mlBMGY培养基，然后加入约1ml 脂肪酶菌株（培养基：菌液=100：1），用透气膜封口（透气，但是细菌不能透过）。
置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母生长，OD600=2.0-6.0，时间约为15-24小时。
（2）将发酵液转入50ml离心管，1500g-3000g离心5min。
去掉上清，用BMMY培养基将菌体浓度稀释至OD600=1.0，约有500ml左右。
将稀释后的发酵液分别加入到1L的药瓶中，每个摇瓶150ml 发酵液（绝不能超过200ml）。
（3）将摇瓶置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母表达脂肪酶，每24小时加入一次5%的甲醇，使甲醇的终浓度为0.5%。
连续诱导表达48小时。
（4）将发酵液进行12000rpm/min离心5min，取上清（若上清仍混浊，可反复离心）；进行酶活分析和蛋白含量分析。
BMGY培养基的配制（1000ml）：20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物（Yeast Extract）,加水至700ml；1210C高温灭菌20min。
然后分别在无菌条件下加入10X YNB 100ml，10X 磷酸钾缓冲液（PH6.0）100ml，10X甘油 100ml。
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毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。
与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。
与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，人们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外源基因表达的酵母宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达。
虽然干扰素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的维特，因此引起产量下降。
同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时，往往导致产量的下降。
为克服酿酒酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［2］。
甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。
毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点［1、2、3］；⑴具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。
⑵表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。
（即同源重组）⑶菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。
⑷毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。
Pichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。
利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜子扩大为工业规模［4］。
目前美国FDA 已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA批准，所以该系统被认为是安全的．Pichia.pastoris表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要的作用，促进更多外源基因在该系统的高效表达，提供更为广泛的基因工程产品［2、3］。
近年来，Invitrogon公司开发了毕赤酵母表达系统的系列产品，短短几年已经有300多种外源蛋自在该系统得到有效表达，被认为是目前最有效的酵母表达系统。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点被ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
Pichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达［5］．包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等。
表达载体都是穿梭质粒，先在大肠杆菌复制扩增，然后被导入宿主酵母细胞。
为使产物分泌胞外，表达载体还需带有信号肽序列。
毕赤酵母表达系统有多种分泌型表达质粒，有许多蛋白在毕赤酵母得到了高效分泌表达。
胞外表达需要在外源蛋白的N末端加上一段信号肽序列，引导重组蛋白进入分泌途径，可使蛋白蛋白质在分泌到胞外之后获得准确的构型。
毕赤酵母对外源蛋白自身的信号序列识别能力差，在本试验中所使用pPICZαA质粒，其信号肽来自酿酒酵母的α-交配因子（α-factor），能很好的达到以上的要求。
并且作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它还拥有一个特点是其具有Zeocin抗性标记基因，给我们筛选转化子的工作带来很大的便利［1、2］。
pPICZαA质粒是作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它的主要特点简介如下：⑴具有强效可调控启动子AOX1（alcohol oxidase，醇氧化酶）；⑵具有Zeocin抗性筛选标记基因，重组转化子可直接用Zeocin进行筛选，即在YPDZ平板上生长的转化子中，100％都有外源基因的整合，大大简化了重组转化酵母的筛选过程［5］。
在操作过程中，Zeocin也可用来筛选含表达载体pPICZαA的大肠杆菌转化子，不必另外使用Amp，经济而又简便；。
⑶在表达载体A0X1 5’端启动子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位点，多克隆位点下游有A0X1 3’端终止序列；⑷分泌效率强的信号肽α-factor.Invitrogen公司开发的毕赤酵母表达系统的系列产品作为目前被应用为最为广泛的酵母表达系统，其主要的优点有：醇氧化酶可调控的强启动子，能高密度发酵，重组蛋白表达量高。
外源基因整合在酵母基因组上，可以稳定存在。
同时，高效分泌表达质粒能将外源蛋白表达后，进行翻译后加工处理，将外源蛋白分泌到细胞外，不但提高表达蛋白的活性，而且，有利于产物的纯化。
一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制1．1 各种母液的配制10*YNB （含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基）4℃保存。
34g 酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌。
500*B （0.02%生物素Biotin）4℃保存保存期为1年。
20mg的生物素溶于100ml水中，过滤除菌。
100*H （0.4%Histidine 组氨酸）4℃保存保存期为1年。
400mg的L-组氨酸溶于100ml水中，（加热至50℃以促进溶解），过滤除菌。
10*D （20%Dextrose 葡萄糖）保存期为1年。
200g葡萄糖溶于1000ml 水中，灭菌15min或过滤除菌。
10*M （5%Methanol 甲醇）保存期为2个月。
将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌。
10*GY （10%Glycerol 甘油）保存期为1年以上。
将100ml甘油和900ml 水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。
100*AA （0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸）4℃保存保存期为1年。
分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中，过滤除菌。
1M 磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0），将1mol/L的K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀，其pH为6.0，如需调节pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。
1.2 常用溶液及缓冲夜1.2.1 碱裂解法抽提质粒DNA所用溶液：溶液Ⅰ：50mmol / L glucose，100mmol / L EDTA，25mmol / L Tris－HCI (pH 8.0)溶液Ⅱ：0.2mol／L NaOH，1％SDS（临用时配制）溶液Ⅲ：29.44g KAc，11.5ml Acetic acid，加ddH2O至100 ml。
4℃保存。
1.2.2 10% 甘油（Glycerol）：将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。
保存期为1年以上。
1.2.3 Rnase-H2O：1ul Rnase 加入1ml 灭菌dd H2O。
4℃保存。
1.2.4 TE缓冲液：10mmol / Tris-CI（pH 8．0），lmmol / L EDTA（pH 8.0）1.2.5 STE缓冲液：0.1mol / L, 10mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 1mmol / L EDTA (pH 8.0)1.2.6 SCE缓冲液：1mol / L Sorbitol (山梨醇), 10mmol / L 柠檬酸钠，10mmol / L EDTA 1.2.7 1M potassium phosphate buffer （pH 6.0）：132 ml 1M K2HPO4868 ml 1M KH2PO41.2.8 50X TAE 琼脂糖凝胶电泳缓冲液，pH 8.0（1L）：242 g Tris57.1 ml Acetic Acid37.2 g EDTA二．毕赤酵母表达的培养基配制［5］2.1 LB（Luria－Bertani）培养基：Trypton l％Yeast Extract 0.5％NaCl l％PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存。
用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。
2.2 LLB（Low Salt LB）培养基：Trypton l％Yeast Extract 0.5％NaCl 0.5％PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存数月。
用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周。