常用试剂培养基 毕赤酵母实验技术
毕赤酵母感受态制作及转化
毕赤酵母感受态细胞制作1、GS115活化：100ml三角瓶中装入20ml YPD培养基，接种100ul菌保，过夜活化。
2、转接：500ml三角瓶中装入100ml YPD培养基，取1ml活化菌液接种到100ml YPD培养基中，培养至OD约为1.3-1.5。
3、收菌：将菌放置冰上15min，或者放于4°冰箱冷却。
一般100ml菌液可以制备4份感受态细胞。
将无菌水和过滤除菌的山梨醇（1M）提前置于4°冰箱冷却。
4、用100ml离心管收集菌体，4000rpm/min离心5min去除YPD培养基。
5、用20ml预冷的无菌水洗菌体，4000rpm/min离心5min，重复一次。
6、用20ml预冷的山梨醇洗菌体，4000rpm/min离心5min。
7、每个离心管中加入3ml预冷的山梨醇，重悬菌体。
7、将菌体分装至1.5ml灭菌离心管中，分装4管，4000rpm/min离心5min，弃上清。
8、每管加入80ul预冷山梨醇，重悬菌体，置于冰上待用或加入10%DMSO保存于-80冰箱。
毕赤酵母电击法转化1、将感受态细胞在冰上融化，电转杯和山梨醇在冰上预冷。
2、将80ul感受态细胞与5-10ug线性化质粒混合，转移至0.2cm电转杯中，置于冰上5min。
3、根据电转仪选择合适的程序，进行电击。
4、电击后立即加入500ul预冷的山梨醇，将电击杯中液体全部转移至无菌的1.5ml离心管中，30℃水浴2h。
5、将菌体低转速离心5min，吸出多余上清，留100ul涂板即可。
6、将菌液均匀涂布于His缺陷型培养基，30℃培养1-2天。
要准备灭菌的有：水，1M山梨醇，滤器，大离心管，1.5ml离心管，大小枪头，所有的离心都是低温离心。
毕赤酵母发酵培养基配方
毕赤酵母发酵培养基配方
哎呀，说到毕赤酵母发酵培养基配方，这可真是个技术活儿。
我得说，这玩意儿可不简单，得精确到毫克，还得考虑各种营养成分的比例。
不过，别担心，我这就给你细细道来。
首先，咱们得准备一些基本的原料。
毕赤酵母这家伙，它喜欢糖，所以葡萄糖是必不可少的。
咱们得准备个100克，这可是它的主食。
然后，酵母提取物也不能少，这玩意儿能提供酵母生长所需的维生素和氨基酸，大概需要5克。
还有，别忘了添加一些无机盐，比如磷酸二氢钾和硫酸镁，这些对酵母的生长也很重要，各准备1克。
接下来，咱们得聊聊碳源和氮源。
毕赤酵母对碳源的要求比较高，除了葡萄糖，还可以加点甘油或者乳糖，这取决于你想要培养的酵母的特性。
氮源的话，除了酵母提取物，还可以加点蛋白胨，大概2克左右。
哦，对了，还有pH值。
毕赤酵母喜欢偏酸性的环境，所以咱们得把培养基的pH 值调到5.0-6.0之间。
这可是个技术活儿，得用pH试纸或者pH计来精确测量。
最后，别忘了消毒。
咱们得把培养基煮沸个15-20分钟，确保没有杂菌污染。
然后，等培养基冷却到室温，就可以分装到培养瓶里了。
这就是毕赤酵母发酵培养基的基本配方了。
当然，具体的配方可能还得根据你的实验目的和酵母的特性进行调整。
不过，掌握了这些基本步骤，你就已经迈出了成功的第一步。
记得，做实验的时候要有耐心，观察酵母的生长情况，及时调整配方。
毕竟，每个实验室的条件都不一样，有时候还得靠自己摸索。
祝你实验顺利，酵母长得壮壮的！。
毕赤酵母实验操作手册
毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。
然而，许多蛋白质在翻译的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。
大肠杆菌缺少适合用于表达结构复杂的蛋白质。
另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。
大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过其主要优点是成本低、产量高、易于操作。
但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。
近年程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵间题［1］。
与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的量下降。
同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时，往往导致产量的酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。
酵母表达过程中用到的培养基
酵母表达过程中用到的培养基毕赤酵母表达的培养基配制［5］2.1 LB（Luria－Bertani）培养基：Trypton l％Yeast Extract 0.5％NaCl l％PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存。
用于培养pPICZαA 原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。
2.2 LLB（Low Salt LB）培养基：Trypton l％Yeast Extract 0.5％NaCl 0.5％PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存数月。
用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周。
2.3 YPD （又称YEPD）Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）Trypton 2%dextrose (glucose) 2%+agar 2%+Zeocin 100 μg/ml液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。
加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。
2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol （山梨醇）1 M+agar 2%+ Zeocin 100 μg/ml不管是液体YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。
2.5 MGYMinimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。
毕赤酵母表达操作手册(精译版)
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。
AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。
AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。
表达：AOX1基因的表达在转录水平受调控。
毕赤酵母诱导表达实验流程
毕赤酵母诱导表达实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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毕赤酵母培养基配方
毕赤酵母培养基配方哎呀，说到毕赤酵母培养基配方，这可真是个技术活儿。
我得说，这玩意儿可不简单，得精确到克，还得注意各种成分的比例。
不过，别担心，我这就给你细细道来。
首先，咱们得准备一些基本的原料。
毕赤酵母这家伙，对环境要求挺高的，所以咱们得给它准备个舒适的“家”。
这个“家”就是培养基，得有营养，还得适合它生长。
咱们先从碳源说起，毕赤酵母喜欢葡萄糖，所以咱们得准备100克。
这葡萄糖啊，得是纯的，不能有杂质，不然会影响酵母的生长。
接下来是氮源，毕赤酵母需要氨基酸和氨来合成蛋白质。
咱们可以用酵母提取物，大概20克，这玩意儿富含氨基酸，对酵母来说是个好东西。
别忘了，还得加点硫酸铵，大概5克，这能给酵母提供氨。
然后是无机盐，毕赤酵母需要一些矿物质来维持正常的生理功能。
咱们得加点磷酸二氢钾，大概3克，还有硫酸镁，大概0.5克。
这些矿物质对酵母的生长至关重要。
别忘了维生素，毕赤酵母需要维生素B1，大概0.01克。
这玩意儿对酵母的代谢活动很重要。
最后，咱们得加点琼脂，大概15克，这能让培养基凝固，方便咱们观察酵母的生长情况。
好了，原料都准备好了，接下来就是配制了。
首先，把水烧开，然后把葡萄糖、酵母提取物、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁和维生素B1都加进去，搅拌均匀。
等这些都溶解了，再把琼脂加进去，继续加热，直到琼脂完全溶解。
然后，把培养基倒进培养皿里，等它冷却凝固。
这时候，培养基就准备好了，可以接种毕赤酵母了。
记得，每次配制培养基的时候，都要严格按照比例来，不然会影响酵母的生长。
还有，培养基做好后，要尽快使用，不然时间长了，营养成分会流失。
这就是毕赤酵母培养基的配方和配制方法，希望对你有所帮助。
如果你还有什么问题，随时问我，我随时为你解答。
毕赤酵母的摇瓶发酵方法[指南]
![毕赤酵母的摇瓶发酵方法[指南]](https://img.taocdn.com/s3/m/3ffac097d5d8d15abe23482fb4daa58da1111c5e.png)
毕赤酵母的摇瓶发酵方法：一、摇瓶发酵方法:毕赤酵母摇瓶发酵方法分为两个阶段，1、酵母菌株生长阶段；2、脂肪酶诱导表达阶段。
1、酵母生长阶段。
准备试剂：1000ml BMGY培养基，1000ml BMMY培养基，10X的甲醇，摇瓶1L（灭菌），温控摇床，50ml离心管（灭菌）。
紫外分光光度计，石英比色皿。
以下所有操作均在超净台内或者无菌条件下完成。
（1）往灭好菌的IL摇瓶中加入100mlBMGY培养基，然后加入约1ml脂肪酶菌株（培养基：菌液=100：1），用透气膜封口（透气，但是细菌不能透过）。
置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母生长，OD600=2.0-6.0，时间约为15-24小时。
（2）将发酵液转入50ml离心管，1500g-3000g离心5min。
去掉上清，用BMMY 培养基将菌体浓度稀释至OD600=1.0，约有500ml左右。
将稀释后的发酵液分别加入到1L的药瓶中，每个摇瓶150ml发酵液（绝不能超过200ml）。
（3）将摇瓶置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母表达脂肪酶，每24小时加入一次5%的甲醇，使甲醇的终浓度为0.5%。
连续诱导表达48小时。
（4）将发酵液进行12000rpm/min离心5min，取上清（若上清仍混浊，可反复离心）；进行酶活分析和蛋白含量分析。
BMGY培养基的配制（1000ml）：20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物（Yeast Extract）,加水至700ml；1210C高温灭菌20min。
然后分别在无菌条件下加入10X YNB 100ml，10X 磷酸钾缓冲液（PH6.0）100ml，10X甘油 100ml。
BMMY培养基的配制方法（1000ml）：20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物,加水至700ml；1210C高温灭菌20min。
然后分别在无菌条件下加入10X YNB 100ml，10X 磷酸钾缓冲液（PH6.0）100ml，10X甲醇 100ml。
毕赤酵母转化方法
毕赤酵母转化方法
实验概要
本实验介绍了毕赤酵母电转化方法。
该方法无需产生去壁细胞，是产生毕赤酵母重组子的简便方法。
与去壁细胞效率相似。
实验步骤
1. 细胞准备：
1) 在含5mlYPD 的50ml 离心管中，培养毕赤酵母，30 度过夜。
2) 取0.1-0.5ml 过夜培养物，接种含500ml 新鲜培养基的2L 摇瓶，过夜生长至OD600＝1.3-1.5。
3) 在4 度，1500g离心5min收集细胞，用500ml预冷的灭菌水悬浮细胞。
4) 如上离心，用250 ml预冷的灭菌水悬浮细胞。
5) 如上离心，用20ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞。
6) 如上离心，用1 ml 预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5ml。
注意：可冻存80ul 等量的电感受态细胞，但转化效率会下降很多。
2. 转化：
1) 取80ul上述细胞与5-20ug线性化DNA(溶于5-10ulTE)混合，转入预冷的0.2cm 电转杯中。
2) 在冰上放置5min。
3) 根据所使用装置推荐的酿酒酵母参数进行电击。
4) 立即加入1ml 预冷的1M山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中。
5) 分成200-600ul等份，涂于MD 或RDB平板上。
6) 在30 度孵育平板至克隆产生，筛选Mut /Muts表型。
毕赤酵母常用培养基与载体
毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
毕赤酵母表达操作手册(精译版)
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。
AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。
AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。
表达：AOX1基因的表达在转录水平受调控。
毕赤酵母电转化方案
毕赤酵母电转化方案一、培养基1.BMMY培养基：酵母粉l0g，蛋白胨20g，溶于700mL去离子水，湿热灭菌30min，冷却后加入100mL 1M pH6.0磷酸钾缓冲液，100mL 10×YNB，2mL 500×B，100mL 10×M，4℃保存。
2.BMGY培养基：酵母粉l0g，蛋白胨20g，溶于700mL去离子水，湿热灭菌20min，冷却后加入100mL 1M，pH6.0，磷酸钾缓冲液，100mL 10×YNB，2mL 500×B，100mL 10×GY，4℃保存。
3.YPD培养基：酵母粉l0g，蛋白胨20g，溶于900mL去离子水，湿热灭菌30min，冷却后加入100mL 10×D，4℃保存。
4.MD培养基：800mL灭菌水中加入100mL l0×YNB，2mL 500×B，100mL 10×D，4℃保存。
5.1M，pH6.0的磷酸钾缓冲液：132mL 1M K2HPO4，868mL 1M KH2PO4，pH6.0，湿热灭菌，4℃保存。
6.10×YNB：YNB 134g(含硫酸铵)溶于1000mL去离子水，过滤除菌，4℃保存7.500×B：20mg Biotin溶于100mL去离子水，过滤除菌，4℃保存。
8.10×M：5mL甲醇与95mL去离子水混合，过滤除菌，4℃保存。
9.10×GY：100mL甘油与900mL去离子水混合，湿热灭菌，4℃保存。
10.10×D：100g葡萄糖溶于1000mL去离子水，过滤除菌，4℃保存。
11.1M 山梨醇：18.2g D-山梨醇溶于100mL去离子水，过滤除菌，4℃保存。
二、转化步骤1．接种毕赤酵母的单菌落到含有5mLYPD液体培养基的三角瓶中，30℃过夜培养。
2．转接含有50mL YPD液体培养基的大三角瓶，接种量1%，30℃培养过夜，直到OD600=1.3～1.5；3．1500g，4℃条件下离心培养液5min，再用50mL冰浴的双蒸水重悬细胞；4．重复第三步的离心操作，然后用25mL冰浴的双蒸水重悬细胞；5．重复第三步的离心操作，然后用2mL冰浴的1M的山梨醇溶液重悬细胞；6．重复第三步的离心操作，然后用100μL冰浴的1M的山梨醇溶液重悬细胞，使菌悬液体积大约为150μL；7．将80μL处理好的感受态细胞和5～20μg经过线性化了的DNA（溶解在双蒸水中，体积为5～10μL）加入一个1.5mL预冷离心管中，混匀。
毕赤酵母表达操作手册(精译版)
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。
不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。
它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。
同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。
这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。
与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。
例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。
毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。
为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。
由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。
而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。
两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。
细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。
甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。
AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。
AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。
表达：AOX1基因的表达在转录水平受调控。
毕赤酵母感受态细胞制备
毕赤酵母感受态细胞制备
1.毕赤氏酵母GS115感受态细胞制备
(1)从YPD平板上挑取单菌落2~3个于含25mL YPD的250mL 三角瓶中，220r/min，30o C过夜（下午5点接，到第二天9点转接）;
(2)取1mL 过夜培养物，接种含50mL 新鲜培养基（YPD）的250mL 摇瓶（接种两瓶，共100mL培养液），生长至OD600~1.3-1.5(4h左右）；
(3)将100mL培养液分装于3个50mL离心管中，4o C，5000g 离心5min，用少许预冷的灭菌水悬浮细胞后并于1管中，加预冷的灭菌水至20mL；
(4)如上离心，用10mL 预冷的灭菌水悬浮细胞；
(5)如上离心，用10mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液悬浮细胞；
(6)如上离心，用0.5mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液悬浮细胞。
2.转化（电击转化）
(1)取80μL上述细胞与10μL 线性化DNA混合，转入预冷的0.2cm电转杯中；
(2)在冰上放置5min；
(3)根据所使用电转仪制造商推荐的酿酒酵母参数进行电击细胞（1.5KV，6ms）；
(4)立即加入0.9 mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中；
(5) 5000g离心5min，剩余200μL菌液吹吸重悬细胞，涂布1块MD平板；
(6)在30o C孵育平板至菌落明显形成（大约3~4天）。
毕赤酵母培养基大全
毕赤酵母表达的培养基配制2.1 LB(Luria-Bertani)培养基：Trypton l%Yeast Extract 0.5%NaCl l%PH 7.0制作平板时加入2%琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存。
用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。
2.2 LLB(Low Salt LB)培养基：Trypton l%Yeast Extract 0.5%NaCl 0.5%PH 7.0制作平板时加入2%琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存数月。
用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周。
2.3 YPD (又称YEPD)Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基) Trypton 2%dextrose (glucose) 2%+agar 2%+Zeocin 100 μg/ml液体YPD培养基可常温保存;琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。
加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。
2.4 YPDS + Zeocin 培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol (山梨醇)1 M+agar 2%+ Zeocin 100 μg/ml不管是液体YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。
2.5 MGYMinimal Glycerol Medium (最小甘油培养基)(34%YNB;1%甘油;4*10-5%生物素)。
毕赤酵母表达实验手册
毕赤酵母表达实验手册（作参考）部分试剂中英文名称：小牛肠碱性磷酸酶（CIP）、AOX1（alcohol oxidase，醇氧化酶）10*YNB （含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基）500*B （0.02%生物素Biotin）、100*H （0.4%Histidine 组氨酸）10*D （20%Dextrose 葡萄糖）、10*M （5%Methanol 甲醇）10*GY （10%Glycerol 甘油）、100*AA （0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸）、1M 磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0）Sorbitol (山梨醇)、磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer）YEPDM（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）Minimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）YPD培养基的配制：每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度酵母提取物10g 250g 1%蛋白栋20g 500g 2%葡萄糖20g 500g 2%※注：配制YPD培养基时，20%（10×）葡萄糖溶液最好采用单独过滤除菌或高压灭菌（在灭菌后再加入到其他各种成分），以免在高压灭菌时培养基变黑并妨碍酵母菌的最佳生长。
※极限培养基{合成葡萄糖（SD）培养基}每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度YNB-AA/AS 1.7g 68g 0.17% （NH4）2SO4 5g 200g 0.5%葡萄糖20g 800g 2% 注：这种极限培养基可以培养没有特殊营养要求的酵母菌，但更多时候这种培养基是作为一种待添加其他成分的极限培养基（见下文提到的CM省却成分培养基）。
完全极限（CM）省却成分培养基（每L中含）：省却成分粉剂 1.3g(见表13.1.1)YNB-AA/AS 1.7g（NH4）2SO4 5g葡萄糖20g*(另外，后3种成分可用27g极限培养预混合物代替)CM省却成分粉剂（CM dropout powder）即所谓的减少成分粉剂（minus powder）或删除成分粉剂（omission powder），它们缺少了表13.1.1中某一种营养成分但含其他营养成分。
毕赤酵母菌种培养手册
毕赤酵母菌种培养手册1. 引言本手册旨在提供毕赤酵母菌种培养的详细步骤和注意事项。
毕赤酵母（Saccharomyces cerevisiae）被广泛应用于食品工业、酿酒业和生物学研究等领域。
通过正确的菌种培养技术，可以确保毕赤酵母的活力和纯度，从而保证实验和应用的可靠性和准确性。
2. 材料和方法2.1 培养基选择适合的培养基是培养毕赤酵母的关键。
常用的培养基包括YPD培养基、SD培养基和SC培养基等。
根据具体实验需求选择合适的培养基配方，并按照相应操作说明制备。
2.2 菌种的制备和传代1. 从冰冻保存的毕赤酵母菌种中取出适量菌种转移到无菌培养基中。
2. 在适当的温度（通常为30°C）下培养菌种至对数生长期。
3. 取适量无菌培养基转移菌种，传代培养。
2.3 菌种培养1. 取适量菌种转移到含有适量无菌培养基的培养瓶中。
2. 控制培养瓶中的菌液浓度，通常为OD600=0.5。
3. 在适当的温度（通常为30°C）下培养菌种至对数生长期或其他实验所需生长期。
2.4 菌种保存菌种的保存有助于长期维持活力和纯度。
常用的保存方法包括冷冻保存和制备冻干菌种等。
3. 结果和讨论通过本手册提供的方法，可以成功培养并维持毕赤酵母菌种的活力和纯度。
在培养过程中，应注意操作的无菌性和培养条件的合适性。
此外，根据具体实验需求，可适当调整菌液的浓度和培养温度等参数。
4. 总结本手册详细介绍了毕赤酵母菌种培养的步骤和注意事项。
正确的菌种培养技术对于保证实验和应用的可靠性和准确性至关重要。
通过遵循本手册的指南和方法，可以有效地培养毕赤酵母菌种，并取得可靠的实验结果。
请注意，本手册仅提供参考，并且在使用过程中应遵守相关的实验室安全操作和法律法规要求。
毕赤酵母培养基大全
毕赤酵母表达的培养基配制2.1 LB(Luria-Bertani)培养基：Trypton l%Yeast Extract 0.5%NaCl l%PH 7.0制作平板时加入2%琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存。
用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。
2.2 LLB(Low Salt LB)培养基：Trypton l%Yeast Extract 0.5%NaCl 0.5%PH 7.0制作平板时加入2%琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存数月。
用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周。
2.3 YPD (又称YEPD)Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基) Trypton 2%dextrose (glucose) 2%+agar 2%+Zeocin 100 μg/ml液体YPD培养基可常温保存;琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。
加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。
2.4 YPDS + Zeocin 培养基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol (山梨醇)1 M+agar 2%+ Zeocin 100 μg/ml不管是液体YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。
2.5 MGYMinimal Glycerol Medium (最小甘油培养基)(34%YNB;1%甘油;4*10-5%生物素)。
毕赤酵母表达实验手册--生物秀
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主要培养基：10×YNB（13.4%酵母氮源，含硫酸铵不含氨基酸）：溶解13.4gYNB于100mL水中，过滤除菌，加热至YNB完全溶解，存于4℃。
500×B（0.02%生物素）：溶解20mg生物素于100mL 水中，过滤除菌，放于4℃。
100×AA（0.5%各种氨基酸）：溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL 水中，过滤除菌，存于4℃。
10×D（20%葡萄糖）：溶解200g D-葡萄糖于1 000mL水中，高压灭菌15min或过滤除菌，可放1年。
500×生物素(0.02%)：溶解20mg生物素于100mL水中，过滤除菌，放于4℃，可放1年。
100×H（0.4%组氨酸）：溶解400mg L-组氨酸于100mL水中，低于50 度加热以促溶解，过滤除菌，可放1年。
10×M（5%甲醇）：混合5mL甲醇与95mL水，过滤除菌存于4℃，可放2个月。
10×GY（10%甘油）：混合100mL甘油与900mL 水，过滤或高压灭菌，室温放置，可存放1年以上。
100×AA（0.5%各种氨基酸）：溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL 水中，过滤除菌，存于4℃，可放1年。
1mol/L磷酸钾缓冲液pH6.0：32mL 1mol/L K2HPO4，868mL 1mol/L KH2PO4，调整pH值为6.0±0.1（如果需调pH值，用磷酸或KOH）。
过滤或高压灭菌，室温下可放1年以上。
100mg/mL遗传霉素：用无菌水制备30mL 100mg/mL 遗传霉素贮存液，过滤除菌，存于-20℃。
用来制备含不同终浓度遗传霉素平板：0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0，4.0。
LB培养基：5%酵母提取物，10%胰蛋白陈，10%NaCI，pH7.0；高压灭菌后4℃保存。
LB平板培养基在LB液体培养基中加入琼脂粉15g，高压灭菌，冷却至45℃左右时倒平皿，4℃保存。
LA平板培养基待LB液体培养基冷却至45℃左右加入Amp (100μg/mL)，摇匀后倒平皿，4℃保存。
YPD培养基：1%酵母提取物，2%胰蛋白膝，2%葡萄糖；RDB转化固体培养基：(Regeneration Dextrose Medium+ Histidine)（lmol/L山梨醇，l%葡萄糖，1.34% Yeast Nitrogen Base with Ammonium Sulfate with amino acids(YNB)，0.00004%Biotin，0.005%谷氨酸，0.005%甲硫氨酸，0.005%赖氨酸，0.005%亮氨酸，0.005%异亮氨酸，1.5%琼脂；）100mL：超纯水80ml，山梨醇18g(186g/L)，琼脂糖2g（20g/L）121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 10ml, 10*D（20%葡萄糖）10ml, 500*B（0.02%生物素）0.2ml 100*AA（含每种氨基酸0.5%）1ml.混匀，倒平板。
YPD-遗传霉素平板：1%酵母浸出物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%不同量的遗传霉素4.0，250mL （8-10个遗传霉素平板）。
取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液或PBS中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。
具体方法如下：1g包装的G418瓶子中，加入10ml HEPES溶液，浓度为100 mg/ml完全溶解后，0.22 um过滤，－20度保存。
HEPES缓冲液配方如下：90 ml 水中，0.8 g NaCl, 0.037 g KCl,0.0135 g Na2HPO4.2H2O, 0.1 g 葡萄糖，0.5 g HEPES,溶解，NaOH调PH至7.05,定容至100ml。
0.50mg/ml，0.75mg/ml，1.0mg/ml，2.0mg/ml，4.0mg/ml五个梯度MD：选择培养基：(Minimal Dextrose Medium+ Histidine) （1.34%YNB，0.00004%Biotin，2%葡萄糖，1.5%琼脂；）100mL：向80 mL 超纯水中加入琼脂糖2g（20g/L），121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 10ml, 10*D（20%葡萄糖）10ml, 500*B（0.02%生物素）0.2ml，混匀，倒平板。
MM：选择培养基：(Minimal Methanol+ Histidine )（1.34%YNB，0.00004%Biotin，0.05%甲醇，1.5%琼脂；）100mL：向90 mL 超纯水中加入琼脂糖2g（20g/L），121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 10ml, , 500*B（0.02%生物素）0.2ml，5mL甲醇混匀，倒平板。
BMGY：诱导表达培养基(Buffer Glycerol-complex Medium)（1%酵母提取物，2%蛋白陈，100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，0.00004% Biotin，l%甘油(V/V)；）1L：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 3g/L，KH2PO4 11.8G/L，超纯水890Ml，121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 100ml, 500*B（0.02%生物素）1ml，甘油10mL。
BMMY：诱导表达培养基(Buffer Methanol-complex Medium) 除以0.5%甲醇代替甘油，其余成分与BMGY相同。
1L：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 3g/L，KH2PO411.8G/L，超纯水895Ml，121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 100ml，500*B（0.02%生物素）1ml，5mL甲醇。
主要溶液2*SDS样品缓冲液：25mL 4*Tris•HCl，PH6.8(0.lmol/L) 20mL甘油[20%(w/v)]4g SDS[4%(w/v)] 2mL2-巯基乙醇或3.1g DTT1mg溴酚兰[0.001%(w/v)]加蒸馏水至l00mL并混匀，等量分装成lmL于-70℃贮存。
5*SDS电泳缓冲液：15.lgTris碱(0.125mol/L) 72.0g甘氨酸(0.96mol/L) 5.0g SDS[0.5%(w/v)]使用前稀释至1XSDS电泳缓冲液，贮存液不必调教pH值，稀释后溶液pH8.3，使用前于0-4℃保存。
考马斯亮兰染色固定液：50%(v/v)甲醇10%(v/v)乙酸40%重蒸水染色液：50%(v/v)甲醇0.05%(v/v)考马斯亮兰R-25040%重蒸水10%(v/v)乙酸配制时先用甲醇溶解考马斯亮兰，再加入乙酸和水。
溶液可保存6个月，若出现沉淀，滤除即可。
脱色液：7%(v/v)乙酸5%(v/v)甲醇88%重蒸水一、大肠制备感受态细胞需灭菌的设备大离心管：小离心管：50ml大枪头5mlLB培养基：10%甘油1 挑单个大肠接入LB液体培养基，培养过夜37℃摇床，并做抗性对照。
2以1：100比例接菌，进行大摇（2ml接入200ml 培养基中37℃摇床）3OD达到0.5-0.7时，冰上放置20min。
4℃离心，4000g，15min.弃上清，不溜残余4加入等体积的10%甘油轻轻重悬。
4℃离心，4000g，15min.弃上清，不溜残余5加入1/2体积的10%甘油轻轻重悬。
4℃离心，4000g，15min.弃上清，不溜残余6加入1/4体积的10%甘油轻轻重悬。
4℃离心，4000g，15min.弃上清，不溜残余7加入适量灭菌10%甘油，一般500ml菌液加入2ml甘油，重悬，8分装，每管40ul，先冻与液氮，然后放入-80℃保存二、毕赤酵母GS115电转化感受态的制备1．在含5mLYPD的50mL 离心管中，培养P. pastoris，30℃过夜；2．取0.1-0.5mL过夜培养物，接种含50mL新鲜培养基的摇瓶，过夜生长至OD600＝1.3-1.5；3．在4 ℃，1 500 r/min离心5min收集细胞，用5mL预冷的灭菌水悬浮细胞；4．如上离心，用5 mL预冷的灭菌水悬浮细胞；5．如上离心，用2mL预冷的1mol/L山梨醇悬浮细胞；6．如上离心，用1 mL 预冷的1mol/L山梨醇悬浮细胞，至终体积约1.5mL（可冻存80μL等量的电感受态细胞，但转化效率会下降很多）。
三、毕赤酵母电转化1．取80μL上述细胞与5-10μL经S线性化DNA（约5-20ug）混合，转入预冷的0.2cm 电转杯中；2．在冰上放置5min；3．根据所使用装置推荐的S. cerivisiae参数进行电击(1 500V，5ms)；4．立即加入1mL 预冷的1mol/L山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中；5．分成200-600μL等份，涂于RDB平板上，进行His营养缺陷筛选；6．在30℃孵育平板3-5d，至His+克隆产生。
四．G418筛选多拷贝基因1）取出长有克隆的3块板，可考虑先挑10－20个菌落先表达；2）第一块加入2ml 灭菌的ddH2o，用涂布棒打匀，洗后，菌液吸入第二块；3）第二块加入1ml，洗之，吸入第三块；4）菌液吸入EP管，可适量补充ddH2o；5）混匀后取适量稀释约50倍，4ul×50＝200ul每块G418板，G418浓度从0.25－4.0mg/ml各一块；6）注意涂布均匀，可适量补充ddH2o，7）300C烘箱培养，2－5day，其余菌液可40C保存注：a）手册推荐方法：第4）步将菌液转入EP管中，振荡5－10秒，用分光光度计测菌体密度，1OD600＝5×107 cells/ml, 取一定体积稀释至200ul/每块G418板, 涂布～105 cells；注意agar的存在会干扰分光光度计的读数。
五．表达：1）从G418板挑单克隆入4ml/管MGY接种，300C，250rpm，2天左右至OD＝2－6，颜色乳白；2）取1ml菌液于EP管中保种，余3ml菌液离心，1500g，5min，菌体换3ml BMMY，加千分之五甲醇，300ul/管；3）每隔24小时加千分之五甲醇；4）至表达之日起2天后每天取样80ul，留作电泳分析；5）表达4天结束，1500g离心，5min，分别收集上清和沉淀；6）上清用作蛋白分析，跑SDS-PAGE电泳，Western Blotting分析，ELISA分析，样品浓缩，纯化分析等六．质粒提取（碱裂解）（1）溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),10 mmol/L EDTA (pH8.0), 配制200ml。