发酵液预处理

3 等电点沉淀实例

从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，
可先于pH 3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许
多酸性蛋白质(pI=3.0)。

工业生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至8.0除去碱
性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入
一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。
4）高聚物沉淀
絮凝
固液分离
凝聚和絮凝

凝聚与絮凝处理过程就是将化学药剂预先投加到悬浮液中， 改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳 定性，使其聚集起来,增大体积以便固液分离。
絮凝：指在高分子絮凝剂作用下，基于架桥作用，使胶粒形 成粗大的絮凝团的过程。


凝聚：指在中性盐作用下，双电层排斥电位降低，使胶体体 系不稳定的现象。
高聚物絮凝剂
1）人工合成的高聚物絮凝剂 丙烯酰胺类衍生物 聚苯乙烯类衍生物
2）天然高聚物絮凝剂
壳聚糖絮凝剂
高分子聚合物絮凝剂根据活性基团在水中解离情况不同的分类
聚丙烯酰胺类絮凝剂
优点

缺点
用量少，一般为10-6g/L； 有毒性， 絮凝体粗大，分离效果好； 谨慎使用 絮凝速度快； 种类多，适用范围广。
目前主要用于杂质为蛋白质或菌丝体的发酵液
天然高聚物絮凝剂
人工合成有机高分子絮凝剂：存在残留单体有毒， 生物降解难等问题 天然有机高分子絮凝剂：具有无毒，易生物降解， 原料来源广等优点 天然有机高分子改性絮凝剂根据其原料来源不同可 分为淀粉类、纤维素类、植物胶类和聚多糖类。
无机盐类絮凝剂
铝盐系：硫酸铝、氯化铝、聚合硫酸铝
有机溶剂沉淀的特点



分辨率比盐析法高—有机溶剂浓度范围较窄即 可 沉淀不用脱盐，溶剂易除去（透析法）并可回 收 容易引起生物大分子变性 需低温
有机溶剂沉淀条件 1）低温
T ，蛋白质结构松散，有机溶剂分子进入疏水区-变性
2）低离子强度
中性盐会增加蛋白质在有机溶液中的溶解度
3） pH – 接近等电点
铁盐系：硫酸铁、氯化铁、聚合硫酸铁
氯化钙、氯化钠、磷酸钠等
有机溶剂类絮凝剂
有机溶剂： 乙醇、丙酮、甲醛
微生物絮凝剂

由微生物在代谢过程中分泌的高分子代谢产物
沉降固体颗粒、菌体细胞


主要成分是糖蛋白、多糖、蛋白质及核酸等
生物大分子、安全、无毒和不污染环境
絮凝剂的应用

制糖工业：1960’ 高聚物絮凝剂——甘蔗汁 的澄清和脱色 纯净水制备：降低水的浊度，沉降病毒
酸） ；
2.Mg2+——草酸、三聚磷酸钠，→三聚磷酸钠镁可溶 性络合物； 3.Fe3+——黄血盐，→普鲁士兰沉淀 3K4Fe(CN)6 + 4Fe3+ = Fe4[Fe(CN)6]3 + 12K+
（二）可溶性杂蛋白的去除方法
盐析法
沉淀
有机溶剂沉淀法
等电点沉淀法
高聚物沉淀法
选择性变性沉淀法
吸附
1. 沉淀 1）盐析
高聚物沉淀法原理
（1）亲水性高分子（羟基）+， 结合自由水分子 水化层 ；
,疏水区域结合 ； 凝聚沉淀
百度文库
（2）高聚物从溶剂中空间排斥蛋 白质
高聚物：聚乙二醇（PEG） 聚丙烯酰胺 聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）
PEG
环氧乙烷和水缩聚而成的混合物
高聚物沉淀的特点
高聚物分子量越高，沉淀效果越好，所需高聚物浓度越低 浓度：PEG4000<PEG20000
（二）絮 凝
絮凝机理：
胶体理论 双电层理论 高聚物架桥理论
flocculation
高分子絮凝剂的吸附架桥作用
细胞絮凝的分类
自身絮凝：通过保温，调节pH值实现
细胞表面分泌微生物絮凝剂，e.g. 糖蛋白， 多糖，纤维素，核酸
絮凝剂絮凝
工业上使用的絮凝剂
高聚物
无机盐 有机溶剂及表面活性剂
水溶性蛋白质：
亲水胶体体系
盐析原理
电解质+， 离子强度 ， 双电层厚度 水化层 ，静电排斥 ；
,疏水区域结合 ； 凝聚沉淀
Cohn 公式
lgS =ß – KsI
S -蛋白质溶解度， mol/L I –盐离子强度， I=1/2 ∑ci Zi2， ci -离子浓度，Zi –离子价态 Ks 、ß –盐析常数

ζ （zeta）电位是控制胶粒间电排斥作用的电位，用来 表征双电层的特征，并作为研究凝聚机理的重要参数。

常用的凝聚剂电解质有：
硫酸铝 Al2(SO4)3•18H2O（明矾）； 氯化铝 AlCl3•6H2O; 三氯化铁 FeCl3; 硫酸亚铁 FeSO4· 7H2O ； 石灰；ZnSO4；MgCO3
枯草芽孢杆菌发酵液：
吸附蛋白
氯化钙
磷酸氢二钠
凝胶
（三）色素的去除方法
色素的来源？——培养基、微生物代谢
色素分类：卟啉类衍生物（叶绿素）
异戊二烯类衍生物（类胡萝卜素）
多酚类衍生物（花青素）
酮类衍生物（姜黄素）
醌类衍生物（胭脂虫红）
（三）色素的去除方法
色素化学结构复杂，性质多样
常用的脱色方法：吸附法
为何要对发酵液进行预处理？


固液分离方法:过滤、离心、膜分离
对于细菌及某些放线菌，菌体细小，液体粘度 大，不能直接过滤，若用高速离心，能耗很大， 设备昂贵。若用膜分离技术（如微滤）易产生 膜污染，通量降低。

发酵液中由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它 有机粘性物质的存在也会影响固液分离。
因而寻找一种经济有效的方法来提高固液分离 速度显得十分必要。
在采用离子交换法提纯时，会影响树脂对生化物质的交换容量
采用有机溶剂或双水相萃取时，会产生乳化现象，两相难分离
采用常规过滤或膜过滤时，会污染滤膜，使滤速下降
3）色素
降低产物质量
因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。
（一）高价无机离子的去除方法
1.Ca2+ ——草酸、草酸钠，→草酸钙沉淀（回收草
（一） 凝 聚 Coagulation
凝聚机理 中 和 粒 子 表 面 电 荷 消 除 双 电 层 结 构 破 坏 水 化 膜 胶体双电层结构：
排斥电位的计算
ζ=4πqδ/ D
D — 水的介电常数；
q — 胶体的电动电荷密度，即滑移面上的电荷密度；
δ— 扩散层的有效厚度，即为吸附层和扩散层界面处电位 φd降低到其值为1/e处的距离，不能直接测定.
血浆： 20-30% 硫酸铵饱和度，纤维蛋白原沉淀
50% 饱和 球蛋白沉淀 清蛋白沉淀
固体硫酸铵加入法：搅拌——少量多次缓慢加入 ——低温静置直到沉淀完全——离心/过滤
无机盐的浓度：与目的蛋白的种类、发酵液 中杂质的数量和性质有关 温度：以不降低目的蛋白的活力为原则
高离子强度溶液中，温度升高， ß变小——溶解度降低

预处理的目的
改变发酵液的物理性质，提高固液分离的效率。
预处理的过程
发酵液杂质的去除 蛋白质 无机离子 色素
培养液处理性能的改善 降低黏度 调节pH值和温度 絮凝与凝聚
一.发酵液杂质的去除
发酵液中杂质的影响
1）高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe3+）
2）杂蛋白
采用离子交换法和吸附法提纯时，会降低树脂吸附能力
溶液温度，pH值
ß值 蛋白质性质 Ks值
盐的种类 盐析法分离蛋白质
“Ks”分级盐析法：pH值、温度不变，盐的浓度改变
——蛋白质粗提
“ß” 分级盐析法：盐的浓度不变， pH值、温度改变
——蛋白质进一步分离纯化
影响盐析的主要因素
无机盐的种类：
阴离子﹥阳离子，多价盐﹥单价盐 阴离子： SO42- ﹥ IO3- ﹥ Cl- ﹥ Br- ﹥ SCN阳离子： Al3+ ﹥ Ca2+ ﹥ Mg2+ ﹥ NH4+ ﹥ K+ ﹥ Na+ 使用最普遍的盐：硫酸铵——溶解度受温度影响小，价格低廉 硫酸钠 氯化钠
有机溶剂用量的公式
V－需加入的有机溶剂的体积；
V0－原溶液的体积； S1－原溶液中有机溶剂的浓度； S2－要求达到的有机溶剂浓度； 100－指加入的有机溶剂浓度为100％。 如所加入的有机溶剂的浓度为95％， 上式(100一S2)项应改为(95一S2)。
有机溶剂沉淀实例
3）等电点沉淀
等电点沉淀法原理 R NH2 COONH2 COOH
选择性热变性沉淀实例
酵母干粉中加入0.066 mol/L磷酸氢二钠溶液， 37℃水浴保温2 h，室温搅拌3 h，离心收集 上清液，升温至55℃，保温20 min后迅速冷 却离心去除热变性蛋白，上清液中多为热稳 定性较高的乙醇脱氢酶。
2. 吸附
吸附剂或沉淀剂吸附除去杂蛋白 ——活性炭、硅胶、氧化铝 四环素类抗生素生产： 黄血盐 + 硫酸锌 亚铁氰化锌钾 胶状沉淀
pH： 以不降低目的蛋白的活力为原则
接近PI， ß变小——溶解度降低
2）有机溶剂沉淀
有机溶剂沉淀法原理
有机溶剂+，
介电常数 ，带电粒子间作用力 ；
F =q1q2/(εγ2) 水化层 ,疏水区域结合 ； 凝聚沉淀
有机溶剂的选择 介电常数小，沉淀作用强 对生物分子变性作用小 毒性小，挥发性适中 常用的有机溶剂：乙醇、丙酮
——活性炭吸附、树脂吸附
“脱色树脂”：多孔性 、表面积大、吸附能
力强
发酵工业：脱色 食品工业：糖浆脱色
二.培养液处理性能的改善（过滤特性）
（一）降低发酵液的黏度
降低发酵液的黏度 提高过滤速率
加热法--注意加热温度和时间，避免 a. 目标产物变性 b. 细胞溶解，胞内物质外溢 加水稀释法 体积增大，加大后续过程的处理量
PEG后面数字表示平均分子量
工艺简单，高聚物加入量低，一般没有变性作用 高聚物成本较高，难于回收
5）选择性变性沉淀
破坏蛋白质空间结构 热变性沉淀
蛋白质具有热敏性
多数蛋白质：70-80℃ 不可逆变性析出
操作简单，成本低 容易导致目标产物的变性
pH变性沉淀
破坏蛋白质本身的离子键
+ + + + + +
H+ R
+
H+
- - - - -
R
NH3+ COOH
酸性蛋白质
碱性蛋白质
某一pH值 静电荷为零 吸引聚集
等电点沉淀条件
在低离子强度、pH约为等电点条件下进行
大多蛋白质的等电点偏酸性，加入盐酸、磷酸、
硫酸等调节pH
多用于疏水性较强的蛋白质，亲水性强的蛋白
质不易产生沉淀
第一章 第二讲 发酵液预处理
生化产品分离纯化的一般步骤
发酵液/培养液
菌体
胞外产物
预处理 固液分离（离心/过滤） 后续分离纯化
胞内产物
为何要对发酵液进行预处理？
发酵液的基本特性

液相粘度大，多为非牛顿型流体，不易过滤； 目标产物浓度较低，大多为1-10%， 成分复杂,菌丝体、代谢产物、培养基影响提取
（二）调节pH值
调节pH值，改变某些物质的电离度和电荷性质
提高过滤速率
氨基酸、蛋白质，pH值调至等电点—沉淀
膜过滤中——减少膜堵塞和污染
胶体物质絮凝
（三）絮凝和凝聚


细菌、放线菌
菌体自溶
菌体细小，液体粘度大，
核酸、蛋白质及其它有机粘性物质
直接过滤，离心，膜分离
细胞絮凝技术：
固体粒子大小， 沉降速率
污水处理：微生物絮凝剂， COD,BOD降低 乙醇连续发酵：絮凝剂从发酵液中回收细菌/ 酵母


絮凝的影响因素

发酵液的性质（细胞浓度，表面电荷）； 絮凝剂的浓度 絮凝剂的分子量； pH值控制 ； 搅拌速度、时间
微涡流絮凝器