第二章发酵液预处理.复习课程
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《生物分离工程》复习内容提要
2009级《生物分离工程》复习内容提要
第一章绪论：重点节：第二节、第三节
1、生物分离工程的一般流程Page4
2、生物分离纯化工艺过程的选择依据Page5
3、生物分离过程的特点Page6
第二章发酵液的预处理：重点节：第一节
1、发酵液的一般特性Page9
2、发酵液预处理的要求Page10-11
3、发酵液预处理的方法Page11-16
4、凝集&絮凝Page11-12
5、转筒真空过滤机的结构和工作原理Page27-28
第三章细胞分离技术：重点节：第二节
1、差速离心&密度梯度离心Page31
2、比较不同细胞破碎方法（机械法、化学法、物理法和酶溶法）的原理和优缺点Page34-39
3、比较珠磨法、高压匀浆法和超声波细胞破碎法的优缺点Page34-36
4、细胞破碎的方法主要有哪些？选择破碎方法时应考虑哪些因素？（自己总结）
5、蛋白质复性及其主要复性方法（稀释与透析、色谱、反胶束）Page41-45
第四章沉淀技术：重点节：第三节
1、盐析的原理Page51
2、K s和β分级盐析法Page52
3、什么是饱和度？盐析沉淀操作曲线的制作实验步骤Page54
4、盐析操作计算Page53-54
5、主要的沉淀方法（盐析、有机溶剂、等电点、变性沉淀等）及其优缺点比较Page27-28
第五章萃取技术：重点节：第二节（二）、第三节（二、三）、第四节（一、二、四）、第六节（一、二）、第八节（一、二、三、四）
1、萃取分配系数、相比、萃取分离系数Page65
2、单级萃取、多级逆流萃取、多级错流萃取理论收率和萃余率的计算Page67-70
分离工程复习资料
第一章绪论
1、生物工程学的概念：生物工程学亦称生物技术，是指通过技术手段，利用生物体或生物过程生产有经济价值产品的学科，生物工程是根底科学和应用科学相结合的产物。
生物工程学的研究领域：基因工程、细胞工程、微生物工程、酶工程。
2、生物别离工程的概念：是生物化学工程的一个重要组成局部，指从发酵液、酶反响液或动植物细胞培养液中别离、纯化生物产品的过程，因它处于整个生物产品生产过程的后端，又称为生物工程下游技术。它描述了生物产品别离、纯化过程的原理、方法和设备。
3、生物别离加工过程按工艺流程顺序可分为四个主要阶段：发酵液的预处理、提取、精制和成品加工。
第二章发酵液的预处理
1、发酵液的一般特征有哪些？发酵液预处理的目的和要求有哪些？
〔1〕组分大局部是水；
〔2〕产物浓度低；
〔3〕固形物主要是菌体和蛋白的胶状物；
〔4〕含有培养基残留成分；
〔5〕含有代谢副产物；
〔6〕含有色素、毒性物质、热原质等有机杂质。
〔一〕发酵液预处理的目的
1〕改变发酵液中固体粒子的物理性质，提高固液别离的效率；
2〕使产物转入便于后处理的某一相中；
3〕去除发酵液中局部杂质，以利于后续各步操作。
总之，改变发酵液的性质，以利于固液别离。
〔二〕、发酵液预处理的要求
1、菌体的别离(正确控制发酵终点);
2、固体悬浮物的去除；
3、蛋白质的去除；
4、重金属离子的去除；
5、色素、热原质、毒性物质等有机杂质的去除；
6、改变发酵液的性质，以利于提取和精制后续工序的操作顺利进展；
7、调节适宜的pH值。
2、发酵液预处理的方法有哪些？并简述各种方法的原理和特点？
发酵液的预处理
8
预处理的方法
凝聚和絮凝 Coagulation and flocculation 加热法 Heating 调节悬浮液的pH值 Regulation of pH 杂蛋白的去处 Removal of useless protein 高价无机离子的去处 Removal of inorganic ion 助滤剂Filter aids和反应剂 Reactant
34
a.絮凝剂浓度
浓度增加有助于架桥充分，但是过多的加量会引起吸附
饱和，在胶粒上形成覆盖层而产生再次稳定现象。
最佳用量为粒子表面积约有一半被聚合物覆盖；
35
b.高分子絮凝剂分子量
分子量提高、链增长，可使架桥效果明显； 但分子量不能超过一定的限度，因为随分子量提高，高分 子絮凝剂的水溶性降低，因此，分子量的选择应适当。
28
目前最常见：聚丙烯酰胺类絮凝剂
聚丙烯酰胺类絮凝剂的优点
用量少，一般以mg/L计量； 絮凝体粗大，分离效果好； 絮凝速度快； 种类多，适用范围广。
聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点：
存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用 于食品和医药工业时应谨慎。
29
2）天然有机高分子絮凝剂
人工合成有机高分子絮凝剂虽然发展很快，但还存在 着残留单体有毒，生物降解难等问题，所以其应用受 到了限制。天然有机高分子絮凝剂具有无毒，易生物 降解，原料来源广等优点。
生物分离工程复习重点
第二章发酵液的预处理和固液分离的方法
一、名词
1、凝聚：凝聚作用就是向胶体悬浮液中加入某种电解质，在电解质中异电离子作用下，胶粒的双电层电位降低，使胶体体系不稳定，胶体粒子间因相互碰撞而产生凝集（1mm左右）的现象。
2、絮凝：是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联接时，形成粗大的絮凝团（10mm）的过程。絮凝是一种以物理的集合为主的过程。
3、混凝：对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂通常会与无机电解质凝聚剂搭配使用。在发酵液中首先加入无机电解质凝聚剂，使得悬浮粒子间的相互排斥能降低，脱稳而凝聚成微粒，然后再加入絮凝剂，通过分子间引力和氢键作用产生吸附架桥形成絮凝团的过程。这种包括凝聚和絮凝机理的过程称为混凝。
4、亲和絮凝：利用絮凝剂和细胞膜表面某种组分间具有的专一性亲和连接作用而产生吸附架桥。如硼酸盐（四硼酸纳）可与多羟基的糖类化合物（甘露糖醇、山梨糖醇）发生专一性亲和连接作用而产生吸附架桥。
5、凝聚价：电解质的凝聚能力可用凝聚价或凝聚值来表示，使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（毫摩尔／升）
6、过滤：过滤是借助过滤介质，将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程。
7、质量比阻：衡量过滤特性的主要指标是滤饼的质量比阻（r B），表示单位滤饼厚度的阻力系数，与滤饼结构特性有关。
8、离心技术：离心技术是借助离心机旋转所产生的离心力，对具有不同沉降系数或浮力密度的物质进行分离、浓缩和提纯的一项技术；其目的是达到固-液或液-液的分离。
第二章 发酵液的预处理
对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，则 主要通过分子间引力和氢键作用产生吸附桥架， 所以它们常与无机电解质凝聚剂搭配使用 。
2021/10/25
在β-半乳糖苷酶（胞内酶）发酵液中采用絮凝 技术除去细胞碎片的方法，利用脱乙酰壳多糖和 聚乙烯亚胺阳离子絮凝剂以及氯化钙无机电解质 ，分别在细胞破碎前后处理发酵液，有机絮凝剂 在破碎前预先加入640 ppm，氯化钙在破碎后加 入40mmol/L，并调节一定的pH，这样可将细微 的细胞碎片粒子聚集起来。
约有一半被聚合物覆盖时所用的絮凝剂量； （B）絮凝剂的相对分子量和类型； （C）溶液的pH值； （D）搅拌速度和时间。 在絮凝过程中，常需要加入一定的助滤剂
以增加絮凝效果。
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3、混凝 无机电解质和絮凝剂交叉使用，可以大大提
高絮凝的效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过程 ，称为混凝。
对带负电荷的菌体或蛋白质，阳离子型高分 子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸 附桥架的双重机理，所以可以单独使用。
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二、发酵液预处理的目的和要求 1、发酵液预处理的目的
（1）改变发酵液的物理性质，促进从悬 浮液中分离固形物的速度，提高固液分离 器的效率；
（2）尽可能使产物转入便于后续工序 处理的某一相中（多数是液相）；
（3）去除发酵液中部分杂质，以利于 后续各步操作。
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在β-半乳糖苷酶（胞内酶）发酵液中采用絮凝 技术除去细胞碎片的方法，利用脱乙酰壳多糖和 聚乙烯亚胺阳离子絮凝剂以及氯化钙无机电解质 ，分别在细胞破碎前后处理发酵液，有机絮凝剂 在破碎前预先加入640 ppm，氯化钙在破碎后加 入40mmol/L，并调节一定的pH，这样可将细微 的细胞碎片粒子聚集起来。
约有一半被聚合物覆盖时所用的絮凝剂量； （B）絮凝剂的相对分子量和类型； （C）溶液的pH值； （D）搅拌速度和时间。 在絮凝过程中，常需要加入一定的助滤剂
以增加絮凝效果。
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3、混凝 无机电解质和絮凝剂交叉使用，可以大大提
高絮凝的效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过程 ，称为混凝。
对带负电荷的菌体或蛋白质，阳离子型高分 子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸 附桥架的双重机理，所以可以单独使用。
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二、发酵液预处理的目的和要求 1、发酵液预处理的目的
（1）改变发酵液的物理性质，促进从悬 浮液中分离固形物的速度，提高固液分离 器的效率；
（2）尽可能使产物转入便于后续工序 处理的某一相中（多数是液相）；
（3）去除发酵液中部分杂质，以利于 后续各步操作。
生物分离工程 第2章过滤(发酵液预处理和固液分离)
叶 滤 机
（3） 板框压滤机
A 结构：
若干板、框交替排列，板、框都用支耳架在一对横梁上，用压紧装置压紧或拉开 。 B 滤板结构： 凹凸纹路作用支撑滤布，提供滤液或洗涤液的流道。分洗涤板和非洗涤板两种。 C 滤框结构： 有供料浆通过的暗孔，料浆在压差的推动下籍框两侧覆盖的滤布进行过滤分离。 D 过滤操作液体流动路径： 料浆沿1通道输入，通过滤框的暗孔进入滤框，框中的料浆在压差的推动下籍框 两侧覆盖的滤布进行过滤分离。滤饼在框内两侧生成并增长，滤液通过滤布流到 滤板板面的凹槽后,因板面凹槽有暗孔与2、4通道相连或与3通道相连，故滤液可 由三条通道流到过滤机外。 E 洗涤操作液体流动路径： 洗涤液由3通道进到洗涤板两侧，横贯滤框，穿过框内两层滤饼及两层滤布，到 达非洗涤板的两侧凹槽，然后由2、4通道流出。
变性法：
加热、调pH、有机溶剂、表面活性剂
吸附法：
加入吸附剂吸附杂蛋白
3.色素的去除
色素来源：
**
微生物代谢分泌；培养基带
脱色方法：
离子交换；活性炭吸附；氧化等
作业 2
1、改变发酵液过滤特性的方法有哪些？
2、试述影响絮凝效果的因素。
3、絮凝和凝聚的主要区别是什么？
4、发酵液的相对纯化方法有哪些？
深层过滤
四.改善过滤方法**
1.助滤剂：质地坚硬不可压缩性固体** 常用助滤剂：硅藻土，珍珠岩，活性炭 机理：表面吸附胶体及不可压缩型格子结构 使用方法： 发酵液的预处理和固液分离 a 预先制成滤饼 b 助滤剂混入悬浮液中一起过滤
第二章 预处理及固—液分离
2）渗透压突变法：高渗（蔗糖，高盐等）
平衡后迅速转入低渗溶液或水中。
另外：化学渗透法
某些有机溶剂（如苯、甲苯）、抗生素、表 面活性剂、金属螯合剂、变性剂等化学药品都可 以改变细胞壁或膜的通透性从而使内合物有选择 地渗透出来。其作用机理；化学渗透取决于化学 试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成。
存在的问题；时间长，效率低；化学试剂毒 性较强，同时对产物也有毒害作用，进一步分离 时需要用透析等方法除去这些试剂；通用性差： 某种试剂只能作用于某些特定类型的微生物细胞。
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
细菌细胞壁的结构
酵母菌细胞壁的结构 M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖
2.2.2 细胞破碎率的评价 Y(%)=[(N0-N)/N0]＊100 1.直接测定破碎前后的细胞数：
破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数； 破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。 2.测定导电率：
滤饼过滤：
过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维织布、金属织布、玻璃纤维纸、合成纤 维等无纺布。当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布阻拦而逐渐形成滤饼（滤 渣）。当滤饼至一定厚度时即起过滤作用，此时即可获得澄清的滤液，这种方 法叫做滤饼过滤，在滤饼过滤中，悬浮液本身形成的滤饼起着主要的过滤作用， 适合于固体含量大于0.1g/100ml的悬浮液的过滤分离。
第二章 发酵液的预处理
五、加入反应剂法 加入某些不影响产物的反应剂，可消除 发酵液中某些杂质对过滤的影响，提高过 滤速率。 反应剂和某些可溶性盐类（如CaSO4、 AlPO4等）生成不溶性沉淀，生成的沉淀能 防止菌丝体粘结，沉淀本身还可作为助滤 剂，并能使胶状物和悬浮物凝固，从而改 善过滤性能。
六、加吸附剂法或加盐法 该法是将吸附剂加入到细菌发酵液中， 使菌体吸附在吸附剂上的方法；或用无机 盐等在发酵液中形成的大絮状物把发酵液 中的悬浮粒子吸附在其中，使悬浮粒子沉 淀下来，从而大大改善发酵液的过滤特性。 采用的吸附剂：磷酸氢二钠和氯化钙 形成的CaHPO4凝胶、氧化铝凝胶、聚丙酰 胺凝胶等。
第二章
第一节 第二节 第三节
发酵液的预处理
概述 发酵液预处理的方法 发酵液的固液分离及设备
基本要求： 了解发酵液的特性和固液分离及设备， 掌握发酵液预处理的方法。 重点： 降低液体粘度的方法；凝聚与絮凝；发 酵液中高价无机离子的除去；杂蛋白的除 去。
第一节
概述
一、发酵液的一般特征 1、发酵液的组成 （1）大部分是水； （2）细胞或碎片； （3）少量未用完的培养基； （4）一定量的代谢产物及副产物。
3、混凝 无机电解质和絮凝剂交叉使用，可以大大提 高絮凝的效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过程， 称为混凝。 对带负电荷的菌体或蛋白质，阳离子型高分 子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸 附桥架的双重机理，所以可以单独使用。 对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，则 主要通过分子间引力和氢键作用产生吸附桥架， 所以它们常与无机电解质凝聚剂搭配使用 。
生物工业下游技术 第二章 发酵液的预处理
第三节 固液分离工程及设备
• 固液分离的方法很多，生物工业中常规的方法 有分离筛、重力沉降、浮悬分离、离心分离和 过滤等。
• 对于发酵液固液分离的主要是离心分离和
过滤。
一、离心分离
• 离心机是利用转鼓高速转动所产生的离 心力，来实现悬浮液、乳浊液分离或浓 缩的分离机械。 • 特点：分离速率快、分离效率高、液相 澄清度好等。 • 缺点：设备投资高、能耗大、固相干度 低不如过滤设备。
微生物发酵的特性： • 发酵产物浓度低，悬浮液大部分是水； • 悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差小； • 固体粒子可压缩性大； • 液相黏度大，大多为非牛顿型流体； • 性质不稳定随时间变化，如易受空气氧化、 微生物污染、蛋白酶水解等影响。
非牛顿型流体
• 不服从牛顿摩擦定律的流体。一般粘性 较大，且随着流动速度而变化。例如石 灰乳、泥浆、污水和许多高分子溶液等。
筛号
筛孔平均 内径（µm）
一号 二号 三号 四号 五号 六号 七号 八号 筛 筛 筛 筛 筛 筛 筛 筛
2000 850 355 250 180 150 125 90
九 号 筛
75
• 我国工业标准筛常用“目”数表示筛号，即 以每一英寸(25.4mm) 长度上的筛孔数目表示。
四、加入助滤剂
选择与使用助滤剂的要点： 粒度选择： • 当粒度一定时，过滤速度与澄清度成反 比； • 助滤剂的粒度必须与悬浮液中固体粒子 的尺寸相适应。
第二章发酵液预处理.
▪ 例：枯草杆菌发酵液中加入磷酸二氢钙或 氯化钙，可与发酵液形成庞大凝胶。钙又 与菌体自溶放出的核酸类物质生成不溶性 盐，会沉淀，从而有助于过滤。
（七）高价态无机离子去除的方法
▪ 1、钙离子的去除 ▪ 钙的来源：发酵培养基中营养盐。 ▪ 去除方法：酸化剂去除。 ▪ 例：草酸除钙离子
生成草酸钙沉淀，同时沉淀还能促使发酵 液中的杂蛋白质凝固，提高过滤速度和滤 液质量；同时能使四环素类从菌丝中转入 水相。
▪ 例：枯草杆菌的发酵液 P10
（一）发酵液预处理的目的
▪ 1、改变发酵液中固体颗粒的物理性质（忙 改变表面类型、增大尺寸、提高硬度）， 加快悬浮液中固体颗粒的沉淀速度。
▪ 2、尽可能使发酵产物转入后续工序处理的 相中（多为液相）。
▪ 3、能够除去部分杂质，减少后续处理的负 荷。
（二）发酵液预处理的要求
▪ 絮凝剂种类：絮凝剂分子量在，链越长，吸附架 桥效果越好，但在水中溶解度减小会对絮凝不利， 故应分子量适当的絮凝剂；
▪ 絮凝剂浓度：低浓度时，增大浓度有利于絮凝， 但浓度过大同样会产生反作用；图2-1
▪ pH值：影响絮凝剂活性基团的解离，应选择合适 pH值，使絮凝剂解离度最大，作用最好。图2-2
▪ 搅拌和时间：搅拌速度和时间要控制在一个合理 范围。图2-3
物细小易受压，易阻塞或粘住过滤介质的细孔。 ▪ 加入助滤剂后，能在过滤介质和要分离的固形
（七）高价态无机离子去除的方法
▪ 1、钙离子的去除 ▪ 钙的来源：发酵培养基中营养盐。 ▪ 去除方法：酸化剂去除。 ▪ 例：草酸除钙离子
生成草酸钙沉淀，同时沉淀还能促使发酵 液中的杂蛋白质凝固，提高过滤速度和滤 液质量；同时能使四环素类从菌丝中转入 水相。
▪ 例：枯草杆菌的发酵液 P10
（一）发酵液预处理的目的
▪ 1、改变发酵液中固体颗粒的物理性质（忙 改变表面类型、增大尺寸、提高硬度）， 加快悬浮液中固体颗粒的沉淀速度。
▪ 2、尽可能使发酵产物转入后续工序处理的 相中（多为液相）。
▪ 3、能够除去部分杂质，减少后续处理的负 荷。
（二）发酵液预处理的要求
▪ 絮凝剂种类：絮凝剂分子量在，链越长，吸附架 桥效果越好，但在水中溶解度减小会对絮凝不利， 故应分子量适当的絮凝剂；
▪ 絮凝剂浓度：低浓度时，增大浓度有利于絮凝， 但浓度过大同样会产生反作用；图2-1
▪ pH值：影响絮凝剂活性基团的解离，应选择合适 pH值，使絮凝剂解离度最大，作用最好。图2-2
▪ 搅拌和时间：搅拌速度和时间要控制在一个合理 范围。图2-3
物细小易受压，易阻塞或粘住过滤介质的细孔。 ▪ 加入助滤剂后，能在过滤介质和要分离的固形
第二章发酵液的预处理和固液分离方法
采用凝聚和絮凝技术能有效地除去杂蛋 白质和固体杂质，提高滤液质量。
1．凝聚
凝聚是指在电解质作用下，由于胶 粒之间双电层电排斥作用降低，电位下 降，而使胶体体系不稳定的现象。
在生理pH值下，发酵液中的菌体或蛋白质常 常带有负电荷，由于静电引力的作用，使溶液中 带相反电荷的阳离子被吸附在其周围，在界面上 形成双电层。
电解质的凝聚能力可用凝聚值来表 示，使胶粒发生凝聚作用的最小电解 质浓度（mol/L）称为凝聚值。
根据Schuze-Hardy法则，反离子 的价数越高，该值就越小，即凝聚能 力越强。
阳离子对带负电荷的发酵液胶体粒子凝聚 能力的次序为：Al3+ > Fe3+> H+> Ca2+ > Mg2+ > K+ > Na+ > Li+。
絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其 相对分子质量可高达数万至一千万以上，它们具 有长链状结构，其链节上含有许多活性官能团， 包括带电荷的阴离子(如-COOH)或阳离子(如NH2)基团以及不带电荷的非离子型基团。
常用的凝聚电解质有： 硫酸铝A12(SO4)3·18H2O (明 矾) 氯化铝AICl3·6H2O 三氯化铁FeCl3·6H2O 硫酸亚铁FeSO4·7H2O 石灰、ZnSO4、MgCO3等。
2．絮凝
絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在 下，基于架桥作用，使胶粒形成较大絮 凝团的过程。
1．凝聚
凝聚是指在电解质作用下，由于胶 粒之间双电层电排斥作用降低，电位下 降，而使胶体体系不稳定的现象。
在生理pH值下，发酵液中的菌体或蛋白质常 常带有负电荷，由于静电引力的作用，使溶液中 带相反电荷的阳离子被吸附在其周围，在界面上 形成双电层。
电解质的凝聚能力可用凝聚值来表 示，使胶粒发生凝聚作用的最小电解 质浓度（mol/L）称为凝聚值。
根据Schuze-Hardy法则，反离子 的价数越高，该值就越小，即凝聚能 力越强。
阳离子对带负电荷的发酵液胶体粒子凝聚 能力的次序为：Al3+ > Fe3+> H+> Ca2+ > Mg2+ > K+ > Na+ > Li+。
絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其 相对分子质量可高达数万至一千万以上，它们具 有长链状结构，其链节上含有许多活性官能团， 包括带电荷的阴离子(如-COOH)或阳离子(如NH2)基团以及不带电荷的非离子型基团。
常用的凝聚电解质有： 硫酸铝A12(SO4)3·18H2O (明 矾) 氯化铝AICl3·6H2O 三氯化铁FeCl3·6H2O 硫酸亚铁FeSO4·7H2O 石灰、ZnSO4、MgCO3等。
2．絮凝
絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在 下，基于架桥作用，使胶粒形成较大絮 凝团的过程。
第二章发酵液的预处理
絮凝现象与原理
絮凝剂的种类
无机絮凝剂
硫酸铝、氯化钙、氯化镁、碱式氯化铝
有机絮凝剂
壳多糖、海藻酸钠、明胶、聚丙烯酰胺、 聚乙烯亚胺等
微生物絮凝剂
真菌、细菌等代谢产生的多糖、蛋白质 和核酸类大分子物质。
复合型生物絮凝剂 (Compound Bio-flocculants)
影响絮凝效果的因素 时间
三、发酵液预处理的方法
（一）凝集和絮凝方法 1、凝集 在凝聚剂的作用下，使发酵液中的胶
体脱稳并使粒子相互凝聚为1mm大小 块状絮凝体的过程。 本质：对初始粒子表面电荷的中和、 消除离子表面稳定的双电荷层。
卤水点豆腐——凝聚原理
黄豆里的蛋白质团粒被水簇拥着不停地运动， 聚不到一块儿，形成了“胶体”溶液。点卤 用盐卤或石膏，盐卤主要含氯化镁，石膏是 硫酸钙，它们能使分散的蛋白质团粒很快地 聚集到一块儿，成了白花花的豆腐脑。
一、发酵液过滤的目的
获得含有目标产物的细胞或发酵液。 除去发酵液中的固形杂质。 发酵液的固液分离是指用过滤或离心
等手段除去发酵液中的悬浮固体（如 菌体、细胞、细胞碎片、蛋白质及其 絮凝体）的过程。
二、影响发酵液过滤的因素
（一）菌种 （二）发酵液黏度
发酵条件 放罐时间 发酵染菌 发酵液的pH值、温度
（一）目的 改变发酵液特性，加速固液分离 富集分离产物于固相（或液相） 去除部分杂质，减少后续分离负荷
第二章 发酵液的预处理和固
2、常见离心分离设备
倾析式离心机： – 螺旋卸料沉降离心机； – 靠离心力和螺旋推进作用自动连续排 渣； – 可连续操作，适应性强，应用范围广， 结构紧凑，适于固含量高的悬浮液分 离； – 不适于细菌、酵母菌等分离；常用于 淀粉精制、废液处理等。
常用离心机的特性及选用
管式
0.01-0.2 固体含量（%） 0.01-1 微粒直径 （10-6m） 排渣方式 间歇或连续 滤渣状况 团块装 （间歇） 分离因素（g） 104-6 × 105 10 最大处理量 （m3/h)
二、发酵液的预处理（续）
调整pH（预处理中较常用方法）： – pH直接影响发酵液中某些物质的电离度和电 荷性质，调节pH可改善其过滤特性； 如调液pH值使蛋白质等达到等电点以除去；膜 过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附， 调pH值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵 塞和污染。 – 调pH时，选较温和的酸或碱，防止局部过酸、 过碱。常用草酸
影响絮凝效果的因素
絮凝效果与发酵液的性状（细胞浓
度、表面电荷种类和大小）有关， 不同发酵液应选不同絮凝剂； 对一定发酵液，与絮凝剂的加量、 分子量和类型、溶液pH、搅拌速度 和时间有关； 在絮凝过程中，常需加入一定的助 凝剂以增加絮凝效果。
絮凝技术
优点：提高固液分离速度，分离菌
体、细胞和细胞碎片等；有效去除 杂蛋白质和固体杂质，提高滤液质 量。 亲和絮凝：细胞絮凝技术发展的新 动向，利用絮凝剂和细胞膜表面某 种组分间具有的专一性亲和连接作 用而产生吸附架桥作用。
第2章 发酵液的预处理
2.1.1革兰氏阳性菌 a.15－50层肽聚糖片层 b.壁磷壁酸和膜磷壁酸 2.1.2革兰氏阴性菌 a.1－2层肽聚糖片层 b.脂蛋白（将外膜固定于肽聚糖层）、脂质双层及脂 多糖（稳定细胞结构）
2.2酵母菌的细胞壁
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与细菌不同，酵母细胞壁的主要成分为: 葡聚糖,与甘露聚糖以及蛋白质等， 比革兰氏阳性菌稍厚，面包酵母的细胞壁厚度约为60-70 nm， 而且其厚度随菌龄增加而增加.
b.细菌：糖苷酶，多肽酶，N-乙酰胞壁酰胺-L-丙氨酸酰胺 酶 C. 真菌、酵母：葡聚糖酶，甘露糖酶，甲克素酶，蛋白酶 d.藻类：纤维素酶
⑤注意事项
a.适应酶以及酶反应体系 b.特定的反应条件：T、pH、浓度等 c.与其他方法结合起来 Eg:辐射、高浓度盐、加EDTA及生长因子等
• 1.3超声波法 原理：细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，
从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引 起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了 剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使 细胞破碎。 适用：对于不同菌种的发酵液、超声波处理的 效果不同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏阴性菌 细胞比革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌 的效果级差。 特点：该法不适于大规模操作，因为放大后， 要输入很高的能量来提供必要的冷却，这是困 难的。
（3）吸附 在发酵液中加入一些反应剂，相互反应后生成的 沉淀物可吸附蛋白质而使其沉淀。如在四环素 发酵液中加入黄血盐和硫酸锌，两者反应生成 K2Zn3[Fe(CN)6]2 在枯草杆菌的碱性蛋白酶发酵液中加入氯化钙和 磷酸盐等 （4）盐析
第2章 发酵液的预处理
1.聚丙烯酰胺衍生物： 非离子型、阴离子型（含-COOH）、阳离子型（含-NH2）
2.苯乙烯类衍生物及其无机高分子聚合物絮凝剂 聚合铝盐、聚合铁盐 3.天然有机高分子絮凝剂 明胶、海藻酸钠在食品工业上应用较多 壳聚糖在生物产品分离中用得最多
四 杂蛋白的去除
等电点沉淀
蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。胶体粒 子的稳定性和其所带电荷有关。 蛋白质在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小， 称为等电点。因为羧基的电离度比氨基大，故 蛋白质的酸性性质通常强于碱性，因而很多蛋 白质的等电点都在酸性范围内（pH 4.0－ 5.5）。
加硅藻土作助滤 剂，板框过滤 结晶 （降温至 5~10℃）
滤液 洗涤、 酸解、 脱色、 过滤
活性炭 脱色
成品
分离实例
透明质酸发酵液预处理
保证产物稳 调节 1/2V10% 稀释 0.8V95% 定 pH7.0 TCA 乙醇
发酵液
变性去除降解 酶及杂蛋白
加硅藻土作助滤 剂，板框过滤
滤液
2V 95%乙醇
过滤
影响过滤的因素： 发酵液的性质：黏度、粒度、颗粒含量、滤饼 的性质 过滤装置：过滤面积、料液分布效果 过滤操作条件：压力、过滤方式
过滤
改善过滤的方法 (一）预处理：改善发酵液性质 （二）助滤剂：能改善过滤操作的质地坚硬不可压 缩性固体 机理：表面吸附胶体及不可压缩型格子结构 助滤剂选择：粒度与悬浮颗粒适当 使用方法： a 预先制成滤饼：滤液澄清度高 b 助滤剂混入悬浮液中一起过滤：容易达到滤速最 大 c 两种方法混用 常用助滤剂：硅藻土，珍珠岩，活性炭 （三）优化过滤装置
生物工程下游技术 第二章 发酵液预处理
4.加入助滤剂
◆一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤
速增大。悬浮液中大量的细微胶体粒子被吸附到助
滤剂的表面上，改变了滤饼结构，降低了过滤阻力。 ◆常用的助滤剂有： 硅藻土、纤维素、石棉粉、 白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。 ◆使用硅藻土时，通常细粒用量为500 g/m3；中等
粒度用量为700 g/m3；粗粒用量为700-1000 g/m3。
一、固液分离的方法
A.重力沉降 B.浮选
通气，产生气泡，使固体附着在气泡表面除去。 用于固液比重差小、直径5～30μm颗粒的分离，污水处理
C.旋液分离
悬浮液以较高速度沿切线方向进入旋风分离器， 轻相由分离器中央排出， 霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，发酵液采用 重相由分离器下部排出， 过滤方法； 细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，其发酵液采 但不适合直径<5 μm颗粒去除（可用丝网分离器）。 用高速离心分离，如对发酵液进行预处理，也可 D.介质过滤 用过滤进行固液分离。
第一节
发酵液的预处理
一、发酵液过滤特性的改变
微生物发酵液的成分极为复杂，其中除了所培
养的微生物菌体及残存的固体培养基外，还有
未被微生物完全利用的糖类、无机盐、蛋白质， 以及微生物的各种代谢产物。
微生物发酵液的特性为：
①发酵产物浓度较低，大多为1-10%，悬浮液
中大部分是水；
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发酵液中去除菌体和固体悬浮物后，一 些可溶性蛋白质仍留在滤液中，需设法去 除。
除去蛋白质的滤液要保证在一定的pH 范 围内不发生混浊，否则影响溶媒提取和离 子交换提取。
ຫໍສະໝຸດ Baidu
4、重金属离子的去除 重金属离子的存在，会影响提取和精制，
同时会影响发酵产物的质量和回收率，故 必须除去。
5、色素、热原质、毒性物质的去除 针对药用发酵产品尤为重要。尤其是针剂。
▪ 6、改变发酵液性质，以利于提取和精制后 续工序的操作顺利进行
当发酵终了时，发酵产物可能在发酵液 中，也可以在菌体内部或两相同时存在。 常采用调节pH、酸性或碱性的方法使发酵 产物转入后续处理的相中。
例：P11
7、调整适当pH值和温度
避免引起产物的破坏和损失。
三、发酵液预处理的方法
▪ 从发酵液中分离固形物的速度，取决于发酵液的 物理性质。不同的发酵液，其流动特性不同。 细菌和放线菌的粘度较大；发酵液菌体自溶， 存在核酸、蛋白质和其它有机杂质，呈悬浮液， 且混浊。会导致过滤速度慢。 常采用絮凝和凝聚的方法，使发酵液中的固体粒 子增大，沉降速度提高；或稀释、加热、调整其 它理化因子来降低粘度，以利于过滤。
▪ 发酵液预处理是指采用凝集、絮凝、加热、 稀释法等技术来加速固相、液相分离。
▪ 过滤和离心是其最基本的单元操作。
▪ 发酵液预处理技术水平高低、质量好坏， 对减轻后续分离纯化的负荷、回收率、产 品质量和生产成本等均具有重大影响。
▪ 其中从发酵液中进行菌体的回收是目前发 酵液预处理的瓶颈问题之一。
▪ 6、发酵液中含有色素、毒性物质等有机杂 质，不仅增加提取过程的困难，还会对产 品的质量、安全卫生标准等产生负面影响。
二、发酵液预处理的目的和要求
▪ 发酵液属于复杂的多相体系，产物浓度低， 杂质组成复杂。若不经预处理，会使后续 的过滤、离心操作速度过慢或无法进行， 使发酵很难实现规模化的工业生产。
有机高分子絮凝剂含有离子化基团，分子中电荷 密度很高，可以中和胶体的电性，起凝聚作用。
▪ 细胞壁表面常带负电，一般常用阳离子絮 凝剂处理发酵液。可析出沉淀物，也可改 善分离后滤液的澄清度，同时可凝固部分 可溶性杂蛋白，将滤液总蛋白含量降低， 而对目标产物的活性无影响。
▪ （2）影响絮凝效果的因素
▪ 2、絮凝
絮凝是指某些高分子絮凝剂能在悬浮粒子之 间产生桥梁作用，使胶粒形成粗大絮凝团 的过程。
絮凝的作用：增大发酵液中悬浮粒子的体积； 提高固液分离速度和滤液质量。
▪ （1）絮凝剂
▪ 无机絮凝剂：使胶体的排斥电位降低而发生沉淀。
▪ 有机絮凝剂：絮凝剂的活性基团通过静电引力强 烈的吸附在胶粒表面上，降低胶粒双电层的排斥 电位，在胶粒间产生架桥作用，使其相互连接成 块状结构而沉淀。
▪ 絮凝剂种类：絮凝剂分子量在，链越长，吸附架 桥效果越好，但在水中溶解度减小会对絮凝不利， 故应分子量适当的絮凝剂；
▪ 絮凝剂浓度：低浓度时，增大浓度有利于絮凝， 但浓度过大同样会产生反作用；图2-1
▪ pH值：影响絮凝剂活性基团的解离，应选择合适 pH值，使絮凝剂解离度最大，作用最好。图2-2
▪ 搅拌和时间：搅拌速度和时间要控制在一个合理 范围。图2-3
▪ 对后续提取影响最大的是高价的无机离子 （钙、镁、铁）和杂蛋白，前者会影响离 子交换的选择性，后者会造成离子交换容 量降低和萃取分层困难。
▪ 根据杂质的种类和性质的不同，采用不同 的方法除去这些杂质。
（一）凝集和絮凝
▪ 1、凝集 凝集是指在投加的化学物质作用下，发酵 液中的胶体脱稳并使粒子相互凝集成为 1mm大小块状絮凝体的过程。 凝集剂的作用：粒子表面电荷的简单中和； 消除粒子表面稳定的双电荷层；通过氢键 或其它复杂的形式与粒子结合。最终使胶 体粒子的排斥电位降低而发生聚沉。
▪ 1、发酵液组成大部分是水，含水量达 90%—99%；
▪ 2、发酵液中发酵产物浓度较低，有的甚至 在1%以下；
▪ 3、发酵液中的悬浮固形物主要是菌体和蛋 白的胶状物，粘度大，不易过滤，增加了 后续的难度。
▪ 4、发酵液中含有培养基中的残留成分，对 后续提取、精制等操作产生影响；
▪ 5、发酵液中含有少量的代谢副产物，其结 构、理化特性与目标物极为相似，会对后 续操作有影响；
▪ 凝集和絮凝是发酵液预处理的主要方法， 是将化学药剂事先加入发酵液中，通过改 变菌体细胞和蛋白质等胶体粒子的分散状 态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离 的絮凝体，然后再进行下一步分离。
▪ 凝集和絮凝能使悬浮颗粒尺寸增加，并会 加大颗粒的沉降速度，从而使过滤饼在深 层过滤时产生较好的颗粒保留作用。
第二章 发酵液预处理
▪ 微生物经过好气性发酵可厌氧发酵培养后， 菌体会大量繁殖，并合成和积累了相当浓 度的代谢产物，这时便终于发酵，进入分 离加工过程。
▪ 不管是胞内产物还是胞外代谢产物，在分 离纯化目的产物时，首先都要通过发酵液 的预处理。将固相、液相分离后，才能采 用各种物理、化学、生物的方法进行产物 的进一步分离纯化。
第一节发酵液预处理的方法
▪ 发酵产物在发酵液中的浓度较低，并与大 量可溶的和混悬的杂质混杂在一起。
▪ 发酵液黏度大，过滤性能差，所以在过滤 前必须进行预处理。
一、发酵液的一般特征
▪ 不同的发酵过程所用的微生物、原料、培 养基种类和发酵工艺过程各不相同，发酵 液的特性也就各不相同，需根据不同发酵 液的特性来合理选择和优化发酵液预处理 的方法及条件。
▪ 例：枯草杆菌的发酵液 P10
（一）发酵液预处理的目的
▪ 1、改变发酵液中固体颗粒的物理性质（忙 改变表面类型、增大尺寸、提高硬度）， 加快悬浮液中固体颗粒的沉淀速度。
▪ 2、尽可能使发酵产物转入后续工序处理的 相中（多为液相）。
▪ 3、能够除去部分杂质，减少后续处理的负 荷。
（二）发酵液预处理的要求
▪ 1、菌体分离 发酵液中除发酵产物外，还含有大量的菌 体，为方便提取和精制，首先要将菌体与 发酵液分离。 为保证离心和过滤顺利进行，要正确控制 发酵终点。否则对目标物的回收均不利。
▪ 2、固体悬浮物的去除
通过过滤处理，将发酵液中相当数量的固 体悬浮杂质去除，获得透光度合格的澄清 处理液。
▪ 3、蛋白质的去除
除去蛋白质的滤液要保证在一定的pH 范 围内不发生混浊，否则影响溶媒提取和离 子交换提取。
ຫໍສະໝຸດ Baidu
4、重金属离子的去除 重金属离子的存在，会影响提取和精制，
同时会影响发酵产物的质量和回收率，故 必须除去。
5、色素、热原质、毒性物质的去除 针对药用发酵产品尤为重要。尤其是针剂。
▪ 6、改变发酵液性质，以利于提取和精制后 续工序的操作顺利进行
当发酵终了时，发酵产物可能在发酵液 中，也可以在菌体内部或两相同时存在。 常采用调节pH、酸性或碱性的方法使发酵 产物转入后续处理的相中。
例：P11
7、调整适当pH值和温度
避免引起产物的破坏和损失。
三、发酵液预处理的方法
▪ 从发酵液中分离固形物的速度，取决于发酵液的 物理性质。不同的发酵液，其流动特性不同。 细菌和放线菌的粘度较大；发酵液菌体自溶， 存在核酸、蛋白质和其它有机杂质，呈悬浮液， 且混浊。会导致过滤速度慢。 常采用絮凝和凝聚的方法，使发酵液中的固体粒 子增大，沉降速度提高；或稀释、加热、调整其 它理化因子来降低粘度，以利于过滤。
▪ 发酵液预处理是指采用凝集、絮凝、加热、 稀释法等技术来加速固相、液相分离。
▪ 过滤和离心是其最基本的单元操作。
▪ 发酵液预处理技术水平高低、质量好坏， 对减轻后续分离纯化的负荷、回收率、产 品质量和生产成本等均具有重大影响。
▪ 其中从发酵液中进行菌体的回收是目前发 酵液预处理的瓶颈问题之一。
▪ 6、发酵液中含有色素、毒性物质等有机杂 质，不仅增加提取过程的困难，还会对产 品的质量、安全卫生标准等产生负面影响。
二、发酵液预处理的目的和要求
▪ 发酵液属于复杂的多相体系，产物浓度低， 杂质组成复杂。若不经预处理，会使后续 的过滤、离心操作速度过慢或无法进行， 使发酵很难实现规模化的工业生产。
有机高分子絮凝剂含有离子化基团，分子中电荷 密度很高，可以中和胶体的电性，起凝聚作用。
▪ 细胞壁表面常带负电，一般常用阳离子絮 凝剂处理发酵液。可析出沉淀物，也可改 善分离后滤液的澄清度，同时可凝固部分 可溶性杂蛋白，将滤液总蛋白含量降低， 而对目标产物的活性无影响。
▪ （2）影响絮凝效果的因素
▪ 2、絮凝
絮凝是指某些高分子絮凝剂能在悬浮粒子之 间产生桥梁作用，使胶粒形成粗大絮凝团 的过程。
絮凝的作用：增大发酵液中悬浮粒子的体积； 提高固液分离速度和滤液质量。
▪ （1）絮凝剂
▪ 无机絮凝剂：使胶体的排斥电位降低而发生沉淀。
▪ 有机絮凝剂：絮凝剂的活性基团通过静电引力强 烈的吸附在胶粒表面上，降低胶粒双电层的排斥 电位，在胶粒间产生架桥作用，使其相互连接成 块状结构而沉淀。
▪ 絮凝剂种类：絮凝剂分子量在，链越长，吸附架 桥效果越好，但在水中溶解度减小会对絮凝不利， 故应分子量适当的絮凝剂；
▪ 絮凝剂浓度：低浓度时，增大浓度有利于絮凝， 但浓度过大同样会产生反作用；图2-1
▪ pH值：影响絮凝剂活性基团的解离，应选择合适 pH值，使絮凝剂解离度最大，作用最好。图2-2
▪ 搅拌和时间：搅拌速度和时间要控制在一个合理 范围。图2-3
▪ 对后续提取影响最大的是高价的无机离子 （钙、镁、铁）和杂蛋白，前者会影响离 子交换的选择性，后者会造成离子交换容 量降低和萃取分层困难。
▪ 根据杂质的种类和性质的不同，采用不同 的方法除去这些杂质。
（一）凝集和絮凝
▪ 1、凝集 凝集是指在投加的化学物质作用下，发酵 液中的胶体脱稳并使粒子相互凝集成为 1mm大小块状絮凝体的过程。 凝集剂的作用：粒子表面电荷的简单中和； 消除粒子表面稳定的双电荷层；通过氢键 或其它复杂的形式与粒子结合。最终使胶 体粒子的排斥电位降低而发生聚沉。
▪ 1、发酵液组成大部分是水，含水量达 90%—99%；
▪ 2、发酵液中发酵产物浓度较低，有的甚至 在1%以下；
▪ 3、发酵液中的悬浮固形物主要是菌体和蛋 白的胶状物，粘度大，不易过滤，增加了 后续的难度。
▪ 4、发酵液中含有培养基中的残留成分，对 后续提取、精制等操作产生影响；
▪ 5、发酵液中含有少量的代谢副产物，其结 构、理化特性与目标物极为相似，会对后 续操作有影响；
▪ 凝集和絮凝是发酵液预处理的主要方法， 是将化学药剂事先加入发酵液中，通过改 变菌体细胞和蛋白质等胶体粒子的分散状 态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离 的絮凝体，然后再进行下一步分离。
▪ 凝集和絮凝能使悬浮颗粒尺寸增加，并会 加大颗粒的沉降速度，从而使过滤饼在深 层过滤时产生较好的颗粒保留作用。
第二章 发酵液预处理
▪ 微生物经过好气性发酵可厌氧发酵培养后， 菌体会大量繁殖，并合成和积累了相当浓 度的代谢产物，这时便终于发酵，进入分 离加工过程。
▪ 不管是胞内产物还是胞外代谢产物，在分 离纯化目的产物时，首先都要通过发酵液 的预处理。将固相、液相分离后，才能采 用各种物理、化学、生物的方法进行产物 的进一步分离纯化。
第一节发酵液预处理的方法
▪ 发酵产物在发酵液中的浓度较低，并与大 量可溶的和混悬的杂质混杂在一起。
▪ 发酵液黏度大，过滤性能差，所以在过滤 前必须进行预处理。
一、发酵液的一般特征
▪ 不同的发酵过程所用的微生物、原料、培 养基种类和发酵工艺过程各不相同，发酵 液的特性也就各不相同，需根据不同发酵 液的特性来合理选择和优化发酵液预处理 的方法及条件。
▪ 例：枯草杆菌的发酵液 P10
（一）发酵液预处理的目的
▪ 1、改变发酵液中固体颗粒的物理性质（忙 改变表面类型、增大尺寸、提高硬度）， 加快悬浮液中固体颗粒的沉淀速度。
▪ 2、尽可能使发酵产物转入后续工序处理的 相中（多为液相）。
▪ 3、能够除去部分杂质，减少后续处理的负 荷。
（二）发酵液预处理的要求
▪ 1、菌体分离 发酵液中除发酵产物外，还含有大量的菌 体，为方便提取和精制，首先要将菌体与 发酵液分离。 为保证离心和过滤顺利进行，要正确控制 发酵终点。否则对目标物的回收均不利。
▪ 2、固体悬浮物的去除
通过过滤处理，将发酵液中相当数量的固 体悬浮杂质去除，获得透光度合格的澄清 处理液。
▪ 3、蛋白质的去除