DGGE实验

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变性梯度凝胶电泳(DGGE)实验

变性梯度凝胶电泳（DGGE）实验一．DGGE的实验原理变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。

DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis)不是将分子量不同的DNA分开,而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同,将序列不同的DNA分开。

该方法的原理是根据DNA 的解链特性,不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所要求的变性剂浓度不同,混合双链DNA在变性剂浓度呈线性梯度增加的聚丙烯酰胺凝胶电泳时,当泳动到与DNA变性所需变性剂浓度一致的凝胶位置时,相对应的DNA发生解链变性,导致电泳迁移速率降低。

由于泳动受阻DNA分子在凝胶中的停留位置不同,从而使不同DNA分子得以分离。

根据变性剂梯度方向的不同, DGGE可分为:垂直DGGE,即变性剂梯度与电场方向垂直,常用于试验决定分离型、野生型和变异型的最佳变性剂梯度范围;平行DGGE,其变性剂的梯度和电场方向平行,主要用于解链范围明确的DNA片段的检测。

DGGE已广泛用于分析自然环境中细菌、蓝细菌, 古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性。

这一技术能够提供群落中优势种类信息并同时分析多个样品，具有可重复和操作简单等特点, 适合于调查种群的时空变化, 并且可通过对条带的序列分析或与特异性探针杂交分析鉴定群落组成。

然而一旦变性剂浓度达到DNA片段最高解链区域浓度时，DNA片段会完全解链，成为单链DNA分子，此时他们又能在胶中继续迁移。

因此如果不同DNA 片段的序列差异发生在最高解链区域时，这些片段就不能被区分开来。

在DNA 片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夹子，一般30-50个碱基对）可以解决这个问题。

含有GC夹子的DNA片段最高的解链区域在GC夹子这一段序列，它的解链温度很高可以防止DNA片段在胶中完全解链。

当加了GC夹子后，DNA片段中的每个碱基处的序列差异都能被分开。

DGGE操作步骤

DGGE操作步骤DGGE（denaturing gradient gel electrophoresis）是一种常用的DNA分析技术，用于研究DNA序列的变异情况和分类等。

DGGE的操作步骤如下：1.准备样品2.PCR扩增将待测DNA进行PCR扩增，以增加DNA的数量。

需要用到一对引物，它们会扩增出感兴趣的DNA片段。

PCR反应体系中含有模板DNA、引物、dNTPs、DNA聚合酶和缓冲液。

引物的选择需要根据研究的目的确定。

3.准备DGGE凝胶将一定比例的聚丙烯酰胺和甲酰胺溶液以一定的比例混合，制备得到DGGE凝胶。

这个比例可以根据需要调整，以获得所需的DNA分离效果。

其中甲酰胺会使凝胶变性，使DNA分子在电泳中以变性形式进行分离。

4.准备DGGE系统将DGGE凝胶置于DGGE装置中。

根据实验需要，在凝胶两端插入电极，接通电源。

将凝胶槽填满电泳缓冲液，用于维持凝胶均匀膨胀，快速散发产热，以及降低电阻。

一般来说，TAE或TBE缓冲液可用于DGGE。

5.准备DNA样品将PCR扩增得到的DNA样品处理成等浓度。

可以用醋酸抽提、酚-氯仿法或商业DNA提取试剂盒等方法进行纯化。

6.电泳分离将等量的DNA样品加入到DGGE样品孔中。

将样品孔上方和下方的空孔填满DNA负载缓冲液，以避免样品在电泳过程中干涸。

开始电泳，一般电泳时间和电场强度要根据平台的规格表决定。

7.停止电泳和染色当DNA样品从顶端到底端通过凝胶后，在适当的时间内停止电泳。

将凝胶取出，根据需要进行染色。

GelRed或者SYBR Green等染料可以用于可视化DNA条带。

8.分析使用相应的软件如Quantity One或ImageJ等，对电泳结果进行分析。

将得到的DGGE电泳图像转化成数值形式，以研究样品中的DNA序列变异情况。

总结：DGGE是一种用于分析DNA序列变异的常用技术。

通过PCR扩增得到的DNA样品，经过一系列处理后，加入到DGGE凝胶中进行电泳分离。

PCR-DGGE实验

2 实验流程1.提取DNA并用琼脂糖凝结电泳检验2.用带GC发夹的引物进行PCR，并用琼脂糖凝结电泳检验3.DGGE将长度相同但序列不同的DNA片段分开，并切胶纯化4.用不带GC发夹的引物进行PCR5.连接转化，需要用到感受态细胞6.菌落PCR进行验证2.1 DNA提取用DNA提取试剂盒提取DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳检验。

2.2 琼脂糖凝胶电泳将0.3g琼脂糖溶解于30ml的1×TAE缓冲溶液中，加热溶解（微波炉加热或沸水浴加热，至琼脂糖溶解），稍微降温后加入3µL的核酸染料，混匀后倒入托盘中，插入梳子，约半小时后其冷却。

将凝胶放入电解槽中，加样（加有loading buffer的DNA样品），在5V/cm 电压下电泳30min。

在紫外光下观察电泳条带。

2.3 PCR反应及产物纯化采用25µL的反应体系：PCR反应体系成分终浓度引物GC Clamp-F 0.2 μM引物R 0.2 μMM g2+(M g Cl2) 0.5 mMBSA 0.2 mg/lTaq DNA Polymerase 1.25 U10×Taq Buffer 1×dNTP Mixture 0.2 mMDNA模板1~2μldH2O To 25 μl反应条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45秒，65 ℃复性45秒，72 ℃延伸45秒，共30个循环；72 ℃最终延伸5min。

将PCR产物全部进行1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下用无菌刀割下含目的DNA片段的琼脂糖块，称重，放入1.5 ml的离心管中，用DNA纯化通用试剂盒纯化PCR产物。

并用紫外分光光度计测定DNA浓度。

2.4 DGGE2.4.1 药品配制：1）40%聚丙烯酰胺丙烯酰胺38.93g双丙烯酰胺 1.07g dH2O To 100ml 2）0%变性剂6%Gel 8%Gel 10%Gel 12%Gel 40%聚丙烯酰胺15ml 20ml 25ml 30ml50×TAE缓冲液2ml 2ml 2ml 2ml dH2O 83ml(to 100) 78ml 73ml 68ml脱气15min，用0.45µm的滤膜过滤。

DGGE操作步骤

变性梯度凝胶电泳（DGGE）的溶液配制、操作步骤及注意事项一、实验试剂及配置1、40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（37.5：1）试剂用量丙烯酰胺38.93g双丙烯酰胺 1.07gMilliQ 水加到100mL 溶液采用0.45µm滤膜过滤，储存在4℃2、0％的变性储存液凝胶梯度6％8％10％12％40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL 20mL 25mL 30mL 50×TAE缓冲液2mL 2mL 2mL 2mL MilliQ 水83mL 78mL 73mL 68mL总容积100mL 100mL 100mL 100mL3、100％的变性储存液凝胶梯度6％8％10％12％40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺15mL 20mL 25mL 30mL 50×TAE缓冲液2mL 2mL 2mL 2mL去离子甲酰胺40mL 40mL 40mL 40mL 尿素42g 42g 42g 42g MilliQ 水加到100mL 加到100mL 加到100mL 加到100mL4、50×TAE缓冲液试剂用量终浓度Tris碱242.0g 2M冰乙酸57.1 1M 0．5M EDTA，pH8.0 100.0mL 50mM MilliQ 水加到1000.0mL将溶液混合溶解，121℃下蒸汽灭菌20-30min,储存在室温5、银染液的配制:原液：8×固定液（250 ml）：乙醇200 ml冰乙酸10mlMilliQ 水40ml（A）：1×固定液（400 ml）：8×固定液50mlMilliQ 水350ml（B）银染溶液(400ml)：AgNO3 0.8 g8×固定液50mlMilliQ 水350ml（C）：显影剂（500ml）：NaOH 7.5gMilliQ 水500 ml甲醛 1.5ml6、10％过硫酸铵（AP）：过硫酸胺0.3g超纯水 3.0ml溶解后使用0.45µm微孔滤膜过滤，4℃保存，保存时间为1周。

PCR-DGGE技术

PCR-DGGE技术一、实验原理变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最早是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。

Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究。

后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（TGGE）。

该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。

双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为取决于其分子大小和电荷。

不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。

DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。

一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。

一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基组成。

当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。

当变性剂那浓度再升高依次达到其他解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。

不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域和解链区域的解链浓度也是不一样的。

当进行DGGE电泳时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。

然而一旦DNA片段迁移到一特定位置，其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。

部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧下降。

因此同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度，因此它们会在胶中不同的位置分开。

DGGE原理和步骤

primer Sequence (5'-3')338f ACTCCTACGGGAGGCAGCAG519r ATTACCGCGGCTGCTGG338F 5’端带有一个40bp GC夹子:(5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGACGCGGGGGG-3')1、实验原理变性梯度凝胶电泳（DGGE）是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。

核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链，称之为变性。

核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度（Tm）。

Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。

DGGE 将凝胶设置在双重变性条件下：温度50~60 ℃，变性剂0~100%。

当一双链DNA 片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时，此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值，此区便开始熔解，而高熔点区仍为双链。

这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变，达到分离的效果。

Tm的改变依赖于DNA序列，即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。

因此，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。

为了提高DGGE的突变检出率，可以人为地加入一个高熔点区——GC夹。

GC夹（GC clamp）就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构，这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。

因此，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%。

作为一种突变检测技术，DGGE具有如下的优点：（1）突变检出率高。

DGGE的突变检出率为99%以上。

（2）检测片段长度可达1kb，尤其适用于100~500bp的片段。

（3）非同位素性。

DGGE不需同位素掺入，可避免同位素污染及对人体造成的伤害。

（4）操作简便、快速。

DGGE一般在24小时内即可获得结果。

（5）重复性好。

但是，该方法需要特殊的仪器，而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。

变性梯度凝胶电泳DGGE实验报告

变性梯度凝胶电泳DGGE刘琳 1131428 环境科学一、实验目的1．学习掌握变性梯度凝胶电泳的原理和方法。

2．练习变性梯度凝胶电泳的操作步骤。

3．分析并掌握变性梯度凝胶电泳的思路，并了解其在微生物群落研究中的地位。

二、实验原理双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。

不同长度的DNA 片段能够被区分开，但同样长度的DNA 片段在凝胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。

DGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA 片段区分开来。

不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。

同样长度但序列不同的DNA 片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。

然而，一旦温度（或变性剂浓度）达到DNA 片段最高的解链区域温度时，DNA 片段会完全解链，成为单链DNA分子，此时它们又能在胶中继续迁移。

因此，如果不同DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开来。

DNA 片段在DGGE 胶中的迁移行为（如下图）：变性剂LowHigh在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段（一般30-50个碱基对），使DNA 片段最高的解链区域在GC 夹子这一段序列处，它的解链温度很高，可以防止DNA 片段在DGGE/TGGE 胶中完全解链。

当加了GC 夹子后，DNA 片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开（Myers, 1985)。

DGGE 有两种电泳形式：垂直电泳和水平电泳。

垂直电泳是为了确定变性剂梯度；而水平电泳则是对比分析不同样品的微生物差异。

本次试验做的是水平电泳，主要对比分析不同样品的微生物差异。

三、实验器材与药剂器材：DGGE system (D-Code, Bio-Rad)、移液管、移液枪、枪头、制胶设备、30ml 针筒、聚乙烯细管、电泳仪试剂：16s rDNA V3区PCR 扩增产物、胶浓度为8%变性剂浓度分别为0%和90%丙烯酰胺胶、50×TAE buffer、去离子甲酰胺、尿素、去离子水、10%过硫酸铵(Aps)、TEMED 、sDNA 染料变性剂Low high四、实验步骤1．首先按照实验要求将50x TAE buffer稀释为1×TAE buffer，并利用90%和0%的变性胶分别配置15.5ml的35%和55%的变性胶溶液。

DGGE实验方法

DGGE实验方法一、试剂准备（Reagent Preparation）Mix. Autoclave for 20-30 minutes. Store at room temperature.Degas for 10-15 minutes. Filter through a 0.45 u filter. Store at 4 ℃in a brown bottle for approximately 1 month.approximately 1 month. A 100% denaturant solution requires re-dissolving after storage.Place the bottle in a warm bath and stir for faster results.4.For denaturing solutions less than 100%, use the volumes for acrylamide, TAE and waterdescribed above in the 100% Denaturing Solution. Use the amounts indicated below forStore at room temperature.二、DGGE 凝胶制备及电泳步骤（1）仔细清洗玻璃板、塑料隔片和梳子，晾干水分，安装好玻璃板并固定到制胶底座上（短玻璃板面向自己，底座事先调水平），注意玻璃上缘与隔片、夹子平齐；（2）各取High/Low concentration 两种变性剂12.5 mL，分别加入两个离心管中，加入交联剂（先加APS，再加TEMED），轻轻旋转混匀，吸入相应注射器中，排尽注射器中的气泡，并迅速安装到凝胶传送系统相应的位置上；（3）将注射器上的塑料软管与Y形管相连，并用夹子将针头固定在长玻璃板上缘中央；（4）轻柔并匀速推动旋转凸轮来传送凝胶液体，使胶缓慢匀速的注入两块玻璃板中间，速度不易太快，但也不能太慢，以防胶凝固注射器中，直至胶液面距离短玻璃板1厘米左右为止；（5）迅速在胶液面上加封一层无菌蒸馏水，变性胶即灌制完毕。

PCR-DGGE操作流程

PCR-DGGE操作流程变性梯度凝胶电泳（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, PCR-DGGE）和FISH一样，也是一个常用的分子生物学实验，在环境生物技术领域常用于分析微生物群落的多样性。

DGGE实验的大体操作流程如下，比较麻烦，影响因素很多，有一段时间我曾经天天捣鼓PCR-DGGE，反复优化各个条件，非常无聊。

1. PCR扩增与普通PCR不同之处是Primer上要加一个GC夹（GC Clamp)，GC夹的序列为：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGC常用的细菌16S通用引物341fGC/518r的序列如下：341fGC:5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′518r: 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′2.制作凝胶需要的准备的试剂：(1)新鲜配制的Ammonium Persulfate Solution（APS） 0.1g in 1ml H2O(2)四甲基乙二胺(TEMED)(3)0%和100%变性剂（100%的变性剂不容易溶解，可以用80%的来代替），配制方法见最下面的表格准备四种不同浓度的凝胶：顶层胶： 4ml 0%变性剂+4微升TEMED+40微升APS溶液底层胶： 1ml 80%变性剂+4微升TEMED+40微升APS溶液如果DGGE需要的变性剂梯度为40%～60%，需要配制40%和60%变性剂凝胶溶液各约13ml：40%变性剂凝胶溶液：6.5ml 0%变性剂+6.5ml 80%变性剂+13微升TEMED+130微升APS溶液60%变性剂凝胶溶液：3.25ml 0%变性剂+9.75ml 80%变性剂+13微升TEMED+130微升APS溶液如需其它梯度，请重新计算。

PCR-DGGE操作流程

DGGE实验的大体操作流程如下，比较麻烦，影响因素很多，有一段时间我曾经天天捣鼓PCR-DGGE，反复优化各个条件，非常无聊。

微生物之微生物多样性分析-DGGE

变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳只能通过片段大小不同在同一浓度的胶上电泳迁移率不同而分离不同的DNA片段，对于片段大小接近或相同的DNA片段无法做到有效地分离；DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis) 即变性梯度凝胶电泳，是利用DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。

DGGE作为一种成熟的分子生物学技术被广泛应用于环境科学（土壤、海洋、河流、冰川、淤泥等）、医学（各种疾病治疗前后，病变部位微生物的差异）、人体（鼻咽、口腔、黏膜、肠道）等领域进行微生物多样性分析。

实验流程图：实验结果实验结果包括以下内容1 引物设计以下是DGGE中常用的引物，我们将根据客户的不同需求，进行针对性的引物设计。

引物序列（5’-3’）细菌 16S V3区扩增引物357-F-GC CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG GCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG518r ATTACCGCGGCTGCTGG引物序列（5’-3’）真核 18S V1-3区扩增引物Euk1A CTGGTTGATCCTGCCAGEukA516r-GCCGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCA CGGGGGGACCAGACTTGCCCTCC2 基因组DNA 抽提电泳检测图针对客户的样本来源不同，我们针对性优化不同的基因组抽提方法，已达到提取效果最佳。

说明：1-8为样本所抽提基因组DNA，上样量3uL；M 为1kb Marker 上数第一条带为8 kb，中间的亮带为3kb，浓度为30ng/uL，其余为10 ng/uL。

3 目的片段PCR 检测说明：1-8为样本，负为负对照（说明我们的实验没有污染，这对分子实验是至关重要的），上样量为5uL；M 为DL2000 Marker，上样量3uL。

PCRDGGE技术

Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究。

后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（TGGE）。

该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。

双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为取决于其分子大小和电荷。

不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。

DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。

一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。

一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基组成。

当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。

当变性剂那浓度再升高依次达到其他解链区域浓度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。

不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域和解链区域的解链浓度也是不一样的。

当进行DGGE电泳时，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。

然而一旦DNA片段迁移到一特定位置，其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。

部分解链的DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧下降。

因此同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度，因此它们会在胶中不同的位置分开。

变性梯度凝胶电泳(DGGE)实验

【实验目的】掌握变性梯度凝胶电泳检测新的突变，以及测定高度多态基因的基因型的技术方法。

【实验原理】在现代遗传学中DNA 序列突变的分析占有十分重要的地位。

由于在较大DNA 序列中检测一个细微的突变非常困难，因而现在人们建立了几种方法来解决这一难题。

变性梯度凝胶电泳(DGGE)能把长度相同而核苷酸顺序不同的双链DNA 片段分开。

这种方法利用了DNA 分子从双螺旋型变成局部变性型时电泳迁移率会下降的现象。

不同的DNA 片段发生这种变化所需梯度不同。

DGGE 的凝胶中沿电场方向变性剂(甲醛和尿素)含量递增，当DNA 片段通过这种变性剂递增的凝胶时，不同分子的电泳迁移率在不同区域会发生降低。

这就可使核苷酸顺序不同DNA 片段分开。

此方法可作为测序的初始步骤在杂合个体中分离等位基因。

许多研究表明变性递度凝胶电泳分离能力很强，它可以把相差仅1bp 的DNA 片段分开。

【仪器、材料与试剂】1.50×TAE 缓冲液(2mol/LTris 乙酸盐，0.05mol/L EDTA pH8.0)1L 体积：242gTris碱，57.1mL 冰醋酸，100mL 0.5mol/L EDTA pH8.0，加水至lL。

2.丙烯酰胺贮存液：40%丙烯酰胺(38:2 丙烯酰胺:双丙烯酰胺)。

3.过硫酸铵贮存液(10%)：10mL 配制：1g 过硫酸铵加水至10mL。

TEMED(N，N，N＇，N＇，—四甲基乙二胺)。

（生物秀实验频道）4.变性剂贮存液：(0%)6%丙烯酰胺TAE 溶液。

250mL 溶液：37.5mL 丙烯酰胺贮存液，5mL50×TAE 缓冲液，加水至250mL，过滤和排气。

5.变性剂贮存液(100%)：6%丙烯酰胺，7mol/L 尿素，40%甲醛TAE 溶液。

250mL配制：37.5mL 丙烯酰胺贮存液，5mL50×TAE 缓冲液，105g 尿素，100mL 甲醛，加水至750mL，过滤并排气。

变性梯度凝胶电泳(DGGE)

DGGE在微生物生态学中的应用
1）广泛应用于各微生物生态系统，包括土壤，活性污泥，人体和动物肠道，温泉，植物根系，海洋，淡水湖，油藏等。绝大部分研究都是通过扩增细菌或古细菌的 16S rRNA 基因来研究各生态系统中的细菌或古细菌群落多样性。也有用真菌的通用引物扩增 18S rRNA 基因，从而研究真菌的群落多样性。
做DGGE注意事项

1、配置试剂时一定要用去离子水，制胶洗膜时用的各个容器也要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。 2、制胶是实验的关键，用连有聚乙烯管标有‘高浓度’的注射器吸取所有高浓度的胶，对于低浓度的胶操作同上，在往玻璃板中灌胶时，要匀速地转动滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。 3、分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好，注意这里一定要把位置放正确! 再将注射器的聚丙烯管同 Y 形管相连。

微生物生态学中应用的缺点
除了前面提到过的一些优缺点，分析微生物群落结构组成是还存在以下缺点： 1、分析微生物群落结构组成时，有很多偏差。不同细菌的基因组大小和核糖体 RNA 拷贝数不同；提取基因组总 DNA 时细胞的裂解效率不同；DNA提取和纯化时有偏差；PCR 扩增过程中有偏差。 2、DGGE一般只能分析 500 个碱基对以下的 DNA 片段，因此得到的系统进化相关的信息就很少
2）能快速同时对比分析大量的样品。因此它既可以对比分析不同的微生物群落之间的差异，也可以研究同一个微生物群落随时间和外部环境压力的变化过程。 3）它可以跟踪监测细菌的富集和分离，从而评价不同培养基及培养条件对分离菌种的影响 4）检测单个纯菌 rRNA 基因的微异质性；比较不同的 DNA 提取方法；另外，它还可以辅佐筛选克隆以及检测 PCR 和克隆过程中的偏差

变性梯度凝胶电泳(DGGE)

做DGGE注意事项注意事项
1、配置试剂时一定要用去离子水，制胶洗膜时用的各个容器也要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。 2、制胶是实验的关键，用连有聚乙烯管标有‘高浓度’的注射器吸取所有高浓度的胶，对于低浓度的胶操作同上，在往玻璃板中灌胶时，要匀速地转动滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。 3、分别将高浓度、低浓度注射器放在梯度传送系统的正确一侧固定好，注意这里一定要把位置放正确! 再将注射器的聚丙烯管同 Y 形管相连。
一段富含 GC 的 DNA 片段（GC 夹子，一般 30-50 个碱基对）可以解决双链DNA完全解链的问题,经验表明任何随机的GC序列 DNA , GC 都能达实验目的含有GC 夹子的 DNA 片段最高的解链区域在 GC 夹子这一段序列处，它的解链温度很高，可以防止 DNA 片段在DGGE胶中完全解链。当加了 GC 夹子后，DNA 片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开。
2）能快速同时对比分析大量的样品。因此它既可以对比分析不同的微生物群落之间的差异，也可以研究同一个微生物群落随时间和外部环境压力的变化过程。 3）它可以跟踪监测细菌的富集和分离，从而评价不同培养基及培养条件对分离菌种的影响 4）检测单个纯菌 rRNA 基因的微异质性；比较不同的 DNA 提取方法；另外，它还可以辅佐筛选克隆以及检测 PCR 和克隆过程中的偏差
变性梯度凝胶电泳（变性梯度凝胶电泳（DGGE））
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一、原理及定义
变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是 Lerman 等人于20 世纪 80 年代初期发明的，起初主要用来检测 DNA 片段中的点突变，DGGE 是最灵敏的突变检测方法，其效率可达99% （Grompe 1993）。Muyzer 等人在 1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究，现在该技术已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一

DGGE-TGGE

89 33 39 39
89 32 37 42
84 26 32 26
82 31 36 31
100 100 33 33 100 39 44 89 100 28 33 94 83 100
Among KKAy mice Cs=82%-100%, C57BL/6J mice Cs =83%-94%, and the different genotypes mice Cs =26%-44%
2.目标片段的PCR扩增
采用2次PCR扩增：
第一次扩增用引物不带GC夹子，以粪便总DNA 为模板，Touchdown反应程序。第二次扩增引物用带GC夹子，以第一次扩增的产物为模板，只扩5个循环。叫Reconditioning-PCR，
3. 关于DGGE marker的制作
4. DGGE前的准备工作
• 为了提高DGGE的突变检出率，发明者人为地加入一个高熔点区，
就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构，即GC夹（GC clamp）这样，在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此，DGGE 的突变检出率可提高到接近于100%。
• 乳杆菌（Lac-1，Lac-GC-2）
8. 测序结果比对、聚类分析
－－结果与GenBank和RDP数据库比对
9. DGGE图谱的数字化——Quantity one
10. DGGE图谱的分析
1）DGGE图谱的聚类分析、主成分分析
2）DGGE图谱的相似性分析
• 用Sorenson配对相似性系数（pairwise similarity coefficient，Cs）比较不同样品PCR-DGGE图谱的相似性 • Cs=2j/(a+b)×100% • 其中a、b分别表示两个比较对象的条带数，j表示a 和b中共有的条带数。完全不同的两个图谱的Cs是

变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)

实验四变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）一、实验原理变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变(20, 42, 52, 53)。

Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究 (50)。

后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE） (49)。

此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一 (49, 51)。

1．原理双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。

不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样，因此不能被区分。

DGGE/TGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。

一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域(melting domain, MD)和解链行为(melting behavior) (20, 42)。

一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成（图1）。

当温度逐渐升高（或是变性剂浓度逐渐增加）达到其最低的解链区域温度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。

当温度再升高依次达到各其他解链区域温度时，这些区域也依次发生解链。

直到温度达到最高的解链区域温度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA完全解链。

（图1显示的是一个234bp长的DNA片段的解链区域，横坐标是该DNA片段的序列，依次从第一个碱基到第234个碱基；纵坐标是解链温度。

变性梯度凝胶电泳 DGGE

变性梯度凝胶电泳Denaturing Gradient Gel Electrophoresis变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)的方法应用于探究微生物的多样性，使得DGGE技术迅速成为了一项简单、可行的微生物多样性检测手段。

DGGE技术是根据长度相同但序列不同的DNA片段特点，在含有变性剂梯度的凝胶上，因其解链的变性浓度的不同而导致迁移率不同的原理而将DNA片段分离开的一种方法。

理论上DGGE能将仅存在一个碱基差异的DNA片段分开，而实际上，其分辩率较低且操作重复性差使得该方法仍然存在一些问题。

更重要的是，随着科技的突飞猛进，DGGE技术已逐渐被高通量测序所取代。

一、试剂与仪器1. 材料1.1 实验试剂表1.1 实验试剂一览表Table 1.1 The list of reagents试剂来源或生产公司EDTA Genebase®，Genebase Gene-Tech公司去离子甲酰胺分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司十二烷基磺酸钠Genebase®，Genebase Gene-Tech公司Tris碱Genebase®，Genebase Gene-Tech公司APS Genebase®，Genebase Gene-Tech公司TEMED Genebase®，Genebase Gene-Tech公司N，N’甲叉双丙烯酰胺Genebase®，Genebase Gene-Tech公司Gel-red染色液Biouim，美国氯化钠，二氯甲烷，甲醇等江苏永华精细化学品有限公司1.2 主要仪器设备表3.2 实验仪器一览表Table 3.2 The list of instruments and equipments仪器名称来源或出厂公司DGGE电泳仪Bio-Rad公司，美国EL 104电子天平梅特勒-托利多仪器有限公司pH计梅特勒-托利多仪器有限公司-20℃低温冰箱海尔公司Milli-Q纯水系统Millipore公司，美国G-560E型旋涡混合器Eppendorf公司，德国5810D型低温冷冻离心机Eppendorf公司，德国全套微量移液器Eppendorf公司，德国1.3 相关溶剂及试剂配制(1) EDTA溶液(0.5 M，pH 8.0)：取1000 mL的烧杯加约800 mL超纯水，称取186.1 g EDTA逐量加入并用磁力搅拌器搅拌加速其溶解，随后用NaOH调节溶液的pH值至8.0，然后用1000 mL的容量瓶定容至1000 mL。

SEM及PCR-DGGE实验步骤

一、扫描电镜实验1、污泥样品预处理方案一：（1）取样：自反应器中取数颗颗粒污泥，放入5ml的离心管中，用去离子水清洗数次，弃去上清液。

（2）固定：加入2.5%，pH为6.8的戊二醛使淹没泥样，并置于4℃冰箱中固定过夜。

（3）冲洗：用1mol/L pH为7的磷酸缓冲溶液冲洗3次，每次15min。

（4）脱水：用浓度为30%，50%，70%，80%，90%的乙醇进行脱水，每次15-30min，再用100%乙醇脱水2次，每次15-30min。

（5）置换：用乙醇：乙酸异戊酯为1：1的溶液，纯乙酸异戊酯各置换一次，每次15min。

（6）干燥：将置换后的样品用针头挑出，放入滤纸叠成的小盒中，置入干燥器中干燥8h。

（7）喷金：用离子溅射镀膜仪（IB-5（Giko）型）在样品表面镀上一层1500nm 厚度的金属膜。

（8）观测：将处理好的待检泥样置于扫描电镜下观察。

方案二：颗粒污泥扫描电镜观察的样品预处理方法如下：（1）取样与清洗：在所需要的不同的反应阶段，从反应器中取出数颗好氧颗粒污泥，放入5mL 的离心管中，用去离子水清洗数次，弃去上清液。

（2）固定：把清洗好的颗粒污泥加入2.5%，pH 为6.8 的戊二醛溶液并淹没样品，并置于4℃冰箱中固定2-12 小时。

（3）冲洗：固定好的好氧颗粒污泥，用0.1mol/L，pH 值为6.8 的磷酸缓冲溶液冲洗3 次，每次10min。

（4）脱水：采用梯度乙醇脱水，将冲洗好的样品依次置于系列浓度50%、70%、80%、90%的乙醇进行脱水，每次10-15min，再用100%的乙醇脱水3 次，每次10-15min。

（5）置换：用乙醇：乙酸异戊酯为1：1 的溶液，纯乙酸异戊酯各置换一次，每次15min。

（6）干燥：将置换后的样品小心取出，放入滤纸叠成的小盒中，置入干燥器中干燥8 小时。

（7）粘样与喷金：将干燥好的颗粒污泥样品，用镊子小心取出干燥好的样品，用导电胶把颗粒样品粘附在铝制托盘上，之后用离子溅射镀膜仪（IB-5（Giko）型）在样品表面镀上一层1500nm 厚度的金属膜。