石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案

石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案

石蜡标本固定、脱水、包埋方法

大鼠自心脏灌注4%多聚甲醛内固定1-2h后取材：取脑出血血肿处脑组织（厚度约3mm），置于塑料盒中并浸泡在4%多聚甲醛中固定，室温中固定时间12-48h，固定好的组织脱水前应流水冲洗30min-1h左右除去固定液，取固定好的脑组织标本脱水、包埋。具体步骤按以下方法进行：此方法参考《组织病理学技术》周庚寅北京大学出版社 2006年

⏹70%： 1h-2h

⏹80%： 1h-2h

⏹90%： 1h-2h

⏹95%： 1h-2h

⏹95%： 1h-2h

⏹无水Ⅰ：30min-60min

⏹无水Ⅱ：30min-60min

⏹二甲苯及水水酒精 1：1混合液 30min

⏹二甲苯Ⅰ：30min

⏹二甲苯Ⅱ：30min

⏹石蜡Ⅰ： 1h

⏹石蜡Ⅱ： 1h

⏹石蜡Ⅲ： 1h

包埋：在病理科包埋方法基础上灵活改进：在包埋铁模具上进行，融蜡-放置组织于中央-扣包埋盒4℃冷却10min-撬蜡。

注意事项：

1、固定液的种类：10%中性甲醛，4%的多聚甲醛最合适，在37°或室温中固定12-48h能很

好保存抗原和抗体的反应能力，实验室用的更多的是在4℃冰箱中固定24h-3d。有人建议中性甲醛40摄氏度固定2~3小时，流水冲洗20min-30min，这样可以缩短制片的时间。

2、熔蜡温度65 ℃左右；

3、严格按照预定实验步骤进行，保证脱水及透明完全，透明后见云雾状说明脱水不完全，

需退回无水酒精中返工。

4、经一级二甲苯透明后检查组织是否透明，二级二甲苯透明时间以具体时间而定。

5、注意及时更换梯度酒精及二甲苯（1月）。

组织石蜡切片摘自《免疫组织化学实验技术及应用》 P12 化学工业出版社2006

1.载玻片的处理：采用现成的APES处理过的硅化载玻片。

2.石蜡切片注意事项：1、用于免疫组化的蜡温应为56~58℃，切片水温为

40℃左右，应先置于冷水中（冷水中可参入酒精有利快速展片-见相关方

法），然后再移入热水中，这样可以使切片顺利展平；2、烤片时要注意：一般在62℃烤片30-60min，抗原较强的组织可在60摄氏度烤3~8h，抗

原较弱的组织可于37℃的恒温箱内过夜；3、切片如需长期保存，可置

于4℃或室温下，千万不可脱蜡后4℃保存，因脱蜡后失去了对抗原决定

族的保护。

冰冻切片摘自《免疫组织化学实验技术及应用》 P12 化学工业出版社 2006

冰冻切片的优点是能较完整的保持抗原性。组织细胞的某些抗原成分，特别是细胞膜抗原、受体抗原、酶及肽类抗原在石蜡切片处理过程中，可不同程度遭受破坏或失去抗原性，而冰冻切片能最大限度地保护抗原。缺点是冷冻过程中形态结构可能破坏，抗原易弥散。方法：

1.载玻片的处理：经明胶处理的载玻片。

2.将新鲜组织置于-25℃左右的恒冷箱中，待组织完全冷冻后即可连续切片。

3.动物组织经4%多聚甲醛灌注内固定及其在4℃固定12-48h后，经40%蔗糖脱水沉底，

吸干组织表面的液体后置于-25℃左右的恒冷箱中，待组织完全冷冻后即可连续切片。

4.取出切片后，应用电风吹冷风吹干或自然干燥。

5.其注意事项：1、温度不能太低，否则组织表面易出现冰渣；2、抗卷板的位置要适中，

否则难以成片；3、贴片时动作轻而迅速，否则易出现褶皱；4、组织从液氮或-80℃取出，必须进行温度平衡后才能切成片，切完的组织如下次还用，应用冷冻头在没有完全溶解前取下，密封后低温保存。

石蜡切片免疫组化：

石蜡切片机切片，厚3 5um，充分晾干(>3小时)。烤箱62～64度1小时后并能较好粘片，可长期保存。

1. 烤箱65度5分钟。

2 石蜡切片脱蜡至蒸馏水。（脱蜡方法见后）30分钟

3 PBS 冲洗，2分钟x2 次。

4 抗原修复：微波炉30分钟（大火15min,中火15分钟）浸泡在PH 6.0的柠檬酸缓冲液里。

自然冷却到室温PBS 冲洗，2分钟x2次

53%H 2 O 2 室温孵育10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

PBS 冲洗，2分钟x2 次。

6 5-10% 正常山羊血清(PBS 稀释) 封闭，室温孵育20 分钟，倾去血清，勿洗。

7 滴加稀释一抗工作液，37 ℃孵育1-2 小时或4 ℃过夜。

(用100微升抗体稀释液稀释1微升一抗)

8 PBS 冲洗，2 分钟x3次。

9 滴加适量生物素标记二抗工作液，37 ℃或室温孵育30分钟。

10 PBS 冲洗，2 分钟x3次。

11 滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素（SABC）工作液，37 ℃或室温孵育20 分钟。

12 PBS 冲洗，2分钟x3次。

13 显色剂显色5-15 分钟（DAB ）1ml蒸馏水+A ,B ,C各一滴。在显微镜下观察效果。

14 蒸馏水2mi n×2次，

15 SE轻度复染<1min；必要时盐酸酒精分化数秒，见标本变粉红即可，分化后水洗5min.。

16 脱水；晾干，透明;

17 树胶封片。

（注意：盖玻片要先自己洗好晾干，高质量盖玻片可不用清洗，PBS冲洗时间因方式而异，浸泡时，时间可缩短。严格配制PH值要求的缓冲液）

HE染色程序30分钟

石蜡切片脱蜡后，冰冻切片水洗5min后可直接进行

1.苏木素：3min

⏹水洗：1min

2.盐酸酒精：20s

⏹水洗：5min

3.伊红：1min

⏹自来水洗净：5min

4.脱水步骤

⏹50%：片刻

⏹75%：片刻

⏹85%：片刻

⏹95%：片刻

⏹无水酒精1：2min

⏹无水酒精2：2min 晾干或烤干

⏹二甲苯1：1-2min

⏹二甲苯2：1-2min

5.封片：中性树胶

脱蜡方法30分钟

烤箱中65 度5分钟后

二甲苯1：10min

二甲苯2：5min

无水酒精1：5min

无水酒精2：2min

95%酒精：片刻

90%酒精：片刻

85%酒精：片刻

75%酒精：片刻

蒸馏水：5min

免疫组化常用缓冲液配制：

1、0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸0.4g，加蒸馏水定容至

1000ml

2、0.01mol/L PBS缓冲液生理盐水（pH 7.4，2000ml）

母液的配制：（0.2mol/L）

19ml B + 81ml A + 17g NaCl至2000ml 即为0.01mol/L PBS缓冲液生理盐水。

A液

Na

2

HPO

4

·12H

2

O

(磷酸氢二钠)

7.164g 28.656g 35.82g 71.632g

加蒸馏水至100ml 400ml 500ml 1000ml NaH2PO4•2H2O (磷

酸二氢钠)

3.121g 12.484g 15.605g 31.21g