石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于研究组织、细胞和分子的结构与功能。
它通过使用抗体与特定抗原相互结合，然后使用酶、免疫荧光等标记物来检测这种结合，从而实现可视化染色和定位目标分子的目的。
下面，我们将详细介绍石蜡切片免疫组化染色的步骤。
步骤一：蜡块去蜡石蜡切片通常是由固定的组织样本制备而成，这些样本在处理过程中会被包埋在石蜡中。
因此，第一步是将蜡块去蜡。
首先，将蜡块放在温水中加热，使蜡块软化。
然后，将蜡块用刮刀从玻片上刮下。
这样可以得到蜡块去蜡后的组织样本。
步骤二：样本再固定在蜡块去蜡后，为了更好地保持组织的完整性和稳定性，通常需要对样本进行再固定。
常用的再固定方法是将样本放入4%的中性缓冲福尔马林溶液中，在室温下固定4-24小时。
固定后，将样本从福尔马林中取出，用PBS（磷酸缓冲盐溶液）洗涤数次，以去除残余的福尔马林。
步骤三：切片制备在样本再固定后，需要将样本制备成切片。
首先，将组织样本放入甲醇中脱水，然后转移到乙醚中脱脂。
脱脂后，将样本放入苯骚酸乙酯中浸泡，使样本渗透均匀。
在苯骚酸乙酯中浸泡一段时间后，将样本转移到石蜡中浸泡。
石蜡具有很好的切片性能，可以更好地保持组织的结构。
最后，将样本放入石蜡包埋机中，进行加热和固化，制备成为石蜡块。
之后，使用旋转切片机将石蜡块切成4-6微米厚的切片。
切片后，将切片浸泡在热水中，使其展开并粘附在玻片上。
步骤四：抗原修复切片制备完毕后，需要对切片进行抗原修复。
抗原修复是为了使样本中的抗原能够更好地暴露出来，增加抗体的结合效率。
常用的抗原修复方法有热处理和化学处理两种。
热处理通常是将切片浸泡在含有缓冲盐的蒸馏水中，然后加热至高温（如95摄氏度）保持一定时间。
化学处理通常是将切片浸泡在含有抗原修复试剂的溶液中，如EDTA（乙二胺四乙酸二钠）溶液。
抗原修复的时间和条件需根据具体实验的要求来确定。
步骤五：非特异性结合阻断为了减少非特异性结合，需要对切片进行非特异性结合阻断。
石蜡切片免疫组化步骤.
石蜡切片免疫组化步骤1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。
2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(10min)→95%乙醇(10min)→90乙醇(10min)→80%(10min)4.抗原修复：柠檬酸钠缓冲液95度，10分钟. (枸橼酸三钠3g枸橼酸0.4g然后加水到950毫升左右，然后用NaOH或HCI调pH值6.0，最后定容在1000ml)5. PBS浸洗2次各5min6.加3%H2O2孵育5min(室温或37度，避光)。
肝组织过氧化物酶含量高。
需增加浓度或增长时间。
蒸馏水洗2minx3次8.pbs-曲拉通通透（pv法不需要）9.与二抗种属一致的血清封闭非特异位点。
（pv法不需要）9.滴加一抗4℃过夜10.PBS浸洗3次各5min11.滴加二抗室温或37℃孵育30min12.PBS洗3次各5min15.DAB显色5~20min，自来水充分涮洗16.苏木素复染2~3min，自来水充分涮洗17.氨水反蓝，过蓝可用盐酸酒精分化2s，自来水充分涮洗.用稀氨水返蓝，自来水里加几滴稀氨水，就行了，返蓝时间5分钟左右，就很好看了;淡氨水有人用50ml自来水＋三四滴的氢氧化铵；18.脱水、透明80%(5min)→90%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→ 100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min)19.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干二、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2h以上，然后按以下流程进行：二甲苯Ⅰ（1h）、二甲苯Ⅱ（30min）、100%酒精（30min）、95%酒精（15min）、70%酒精（15min）、50%酒精（15min）、蒸馏水（15min）2、3%H2O2，室温封闭5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
3、甩去H2O2，蒸馏水洗2min×3次。
石蜡切片免疫组化操作步骤
石蜡切片免疫组织化学操作流程一、组织获取（本实验室多做脑组织，所以以脑组织为例）1.动物麻醉：所用麻醉药物（水合氯醛水溶剂）剂量为350mg/kg动物体重，常用麻醉药物浓度为5%、6%、7%、10%（麻醉浓度越大，动物进入麻醉时间越短，但麻醉致死率相应较高，本人使用7%浓度，若注射位置正确，约3min进入麻醉状态）；动物麻醉后，将其固定于灌流操作平台，仰卧位；2.动物灌流手术：以胸骨剑突为起点，沿左右两侧肋下缘剪开老鼠皮肤至腋下，再次以剑突为起点，剪开皮下肌肉层，沿同样方向剪开肌肉至腋下，避免伤到内部脏器，剪破膈膜，沿左右两侧剪断胸骨，用止血钳夹住剑突向上翻转，充分暴露心脏；用弯镊分离心脏表面黏膜；左手持止血钳轻夹起心脏，倾斜一定角度，使心尖方向与升主动脉尽量位于同一直线上，右手持灌流针，沿直线所在所在角度由左心室进针，将灌流针直接插入升主动脉（可挑动灌流针于升主动脉内观察是否正确插入，此方法操作不熟练易插错血管或是直接刺穿心脏——或者直接将灌流针插入左心室，但前方法灌流效率较高）；固定器械（器械松动或是位置变化会严重影响灌流质量，有时会因为器械位置的变动直接将心脏牵扯下来导致灌流失败，应给与充分注意）3.动物灌流：C57小鼠25-30g左右，灌流开始，可见右心耳充盈，用剪刀剪开，便于血液流出：吊瓶灌流——以生理盐水50-100ml快速冲洗血液，持续最好不要超过5min（时间过长会导致脑组织降解），待无明显血迹流出后换用4%多聚甲醛进行灌流，约100-150ml，灌流速度不宜过快，约10min，固定液较充分的固定组织；注射器灌流——生理盐水50ml快速推注，后换用4%多聚甲醛50ml缓慢推注。
灌流成功的标志——灌流开始，可见肝脏颜色迅速变浅，随着灌流进行，肝脏颜色逐渐变为乳黄色或是白色；换用4%多甲固定液后小鼠全身痉挛抽搐，组织僵硬。
4.开颅取脑：根据实验取材位置的不同，分为不同的取脑方式：应注意需要的组织区域，避免取脑过程中损坏，多从小脑后方依次向前剥离颅骨，获取脑组织（在颅骨剥开后，应注意脑膜的存在，因为会发生脑膜将皮层割裂损伤的情况）5.脑组织修块：将多余脑组织去除，便于固定充分均匀，应留出试刀或找平的部分多余组织（本人实验中因需要海马组织，故修块时沿大脑皮层后边缘切除多余小脑，人字缝前约2.5-3mm切除前脑部分）6.固定过夜：将修块完成的脑组织，浸泡于4%多聚甲醛中，固定过夜，通常不要超过18小时（固定时间越长，组织抗原损失越严重，呈数量级损失），一般控制在12小时以内为宜二、组织石蜡包埋7.组织梯度脱水透明：将过夜固定的脑组织取出置于包埋窗内，并用铅笔做好相应标记，自来水流水冲洗约10min，去除残留的杂质成分，进行梯度酒精脱水（注意：不同的组织类型，同组织类型不同组织块大小所需的每阶段脱水时间不同，需根据自身需要进行简单摸索；若盲目脱水透明，脱水透明过头，会使组织脆性增加，切片时全为粉末状，无法成形；脱水透明不够，会使组织与蜡块分离，无法获取平整组织切片）本实验中，组织样本为脑组织，组织修块后所进行的脱水流程如下：自来水冲洗完成→50%乙醇 25min→70%乙醇 25min→80%乙醇 25min→90%乙醇 25min →95%乙醇I 10min→95%乙醇II 15min→无水乙醇I 10min→无水乙醇II 15min→二甲苯I 15min→二甲苯II 15min8.组织浸蜡：在进行二甲苯透明开始的时候，将石蜡用沸水融化，置于60度烘箱内备用（此过程中应注意将盛放石蜡的烧杯上口封闭，避免水分溅入；根据组织块的数目准备合适体积的石蜡液体，以组织块完全浸没其中为宜）；将透明完成的组织块，尽量沥干多余二甲苯，迅速转入1号烧杯的石蜡液体内（避免包埋窗内产生气泡，气泡若围绕组织块会影响浸蜡过程），依次将所有组织块迅速转入其中，要求组织块要全部浸没在石蜡中，流程如下：1号石蜡2h→2号石蜡2h→3号石蜡2h在每个阶段的浸蜡过程中，可根据时间安排适量的延长浸蜡时间，但尽量不要减少时间9.组织块包埋：包埋前，准备沸水备用；清理干净包埋槽备用；包埋开始时，将装有组织块的烧杯浸入沸水中，防止在包埋过程中，烧杯中的石蜡凝固，具体操作如下：1）用镊子夹取包埋槽在酒精灯预温，控制包埋槽的温度不要过高；2）将烧杯内的石蜡倒入包埋槽内，液面高度刚好没过包埋槽两侧平台3）取出浸泡的组织块，用小镊子过火后夹取组织块放置在包埋槽的凹陷处中心部位，根据切片要求摆放位置，注意在放置过程中避免组织块下面接触包埋槽底部的位置产生气泡，通常在放置前，可将组织块浸没在凹槽内的石蜡中翻滚，使其各面均匀接触石蜡液体，然后放置在正确的位置（此时假如包埋槽预温过高，则会导致组织块在接触槽底面后异常干燥，在整个蜡块凝固后会在干燥处出现凹洞，不利于石蜡块的长期保存）；4）将包埋窗轻轻放置在包埋槽的平台上面，尽量保证两侧高度相同，此时槽内之前的石蜡会浸没部分包埋窗的格栏，静置1-2min（避免倒入热的液体石蜡后，石蜡从包埋窗的边缘流出）；5）静置后，石蜡表面会出现凝固表层，此时再用烧杯中的石蜡填充包埋窗的凹陷处以及靠近边缘的条状凹洞，液面稍高于包埋窗边缘（靠近边缘的条状凹洞一定注意填充石蜡，关乎整个蜡块凝固后与包埋窗结合的紧密程度；石蜡凝固后体积会缩小，避免因液面过低导致的后期包埋窗内部支撑不够）6）静置至少30min，可将包埋后的蜡块从包埋槽内分离（注意分离时，应先清理包埋槽四周的多余石蜡，露出包埋窗与包埋槽接触的边缘，然后从一个角将蜡块撬离包埋槽）三、石蜡切片10.准备工作：蜡块的修整——将组织周边的石蜡在保留操作位置的情况下尽量去除（1-减少石蜡块切面与刀片的接触面积，便于受力均匀，易切出完整切片；2-石蜡切面与刀片接触面积小，会减少刀片接触到蜡块中坚硬杂质的几率，增加刀片的使用寿命；3-接触长度减少，可增加刀片使用次数，通常情况下至少多使用1次）准备器材：40度恒温水浴（温度控制在40-42之间的恒温状态，此温度可使蜡片较长时间保持切片形态，温度较低切片不易展开，温度较高，切片会在短时间内融化，易造成组织变形）切片刀片、包被载玻片、弯镊、毛刷、铅笔、切片盒冰盒（通常情况不需要，在组织脱水透明严重，切片呈粉末状态时，可用冰块冰敷石蜡切面，在短时间内可改善切片表面状态，能够帮助切出3-5片完整切片，只有在前期处理出问题时才使用进行一定程度挽救）切片大致流程：1）安装刀片；将蜡块固定于切片机上，调整蜡块表面与刀片距离，矫正蜡块表面与刀片切线平行；2）调整切片模式为trim-10um进行表面找平，并观察切片状态，调整蜡块角度，使切片左右对称，同时注意观察目标区域出现位置；3）切片调平，并出现合适目标区域，调整切片模式为sect-5um进行切片，获取所需组织切片样本；4）将完整合适的切片，夹取至水浴锅内摊平，左手持载玻片，右手持弯镊辅助，将切片贴于载玻片中，放置在水浴锅边缘进行干燥并做好相应标记；5）将干燥完成切片，按照样本分类放置在一起收于切片盒中备用6）切片完成，清理清片机；剩余组织蜡块，需要在切面表面均匀涂抹融化的石蜡，避免组织块直接与空气接触（不进行封闭，会使组织块在长期的暴露过程中，含水量发生变化，易于与支撑蜡块分离，造成后续再次切片困难）7）切片盒中切片，干燥后可在室温下长期放置，推荐切片完成后及时进行后期组织染色或组织免疫化学孵育。
石蜡切片免疫组化步骤
石蜡切片免疫组化步骤1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。
2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(10min)→95%乙醇(10min)→90乙醇(10min)→80%(10min)4.抗原修复：柠檬酸钠缓冲液95度，10分钟. (枸橼酸三钠3g枸橼酸0.4g然后加水到950毫升左右，然后用NaOH或HCI调pH值6.0，最后定容在1000ml)5. PBS浸洗2次各5min6.加3%H2O2孵育5min(室温或37度，避光)。
肝组织过氧化物酶含量高。
需增加浓度或增长时间。
蒸馏水洗2minx3次8.pbs-曲拉通通透（pv法不需要）9.与二抗种属一致的血清封闭非特异位点。
（pv法不需要）9.滴加一抗4℃过夜10.PBS浸洗3次各5min11.滴加二抗室温或37℃孵育30min12.PBS洗3次各5min15.DAB显色5~20min，自来水充分涮洗16.苏木素复染2~3min，自来水充分涮洗17.氨水反蓝，过蓝可用盐酸酒精分化2s，自来水充分涮洗.用稀氨水返蓝，自来水里加几滴稀氨水，就行了，返蓝时间5分钟左右，就很好看了;淡氨水有人用50ml自来水＋三四滴的氢氧化铵；18.脱水、透明80%(5min)→90%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→ 100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min)19.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干二、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2h以上，然后按以下流程进行：二甲苯Ⅰ（1h）、二甲苯Ⅱ（30min）、100%酒精（30min）、95%酒精（15min）、70%酒精（15min）、50%酒精（15min）、蒸馏水（15min）2、3%H2O2，室温封闭5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
3、甩去H2O2，蒸馏水洗2min×3次。
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
一、石蜡切片免疫组化技术
石蜡切片免疫组化方法是一种流行的染色技术，它利用抗原特异性抗
体结合抗原将一种特定蛋白质标记出来，然后对组织交叉剥离切片进行染色，得到对特定抗原的特异性染色，进而可以测定组织中其中一蛋白质的
分布情况及其表达水平。
石蜡切片免疫组化方法主要分为热稳定抗原抗体
保护法、热稳定化学法和抗原保护法三种。
1.热稳定抗原抗体保护法
热稳定抗原抗体保护法又称抗原连接法，它是最常用的一种免疫组化
技术，依赖高温对抗原的特殊保护作用。
其原理是经过化学固定的组织切片，在石蜡上产生隆起；然后用高温阳性抗体（双抗体）将抗原完全覆盖，并产生痕迹，这样便可清楚地观察抗原的分布情况；此外，在有抗原保护
的条件下，抗原保护的组织切片可以用客体抗体染色。
2.热稳定化学法
热稳定化学法是一种特殊的抗原保护法，也是最常用的石蜡免疫染色
技术。
石蜡组织免疫双色荧光操作步骤
石蜡组织免疫双色荧光操作步骤以下是石蜡组织免疫双色荧光的一般操作步骤：1. 组织固定：将待检测的组织标本固定在石蜡切片上，常见的固定剂包括福尔马林和乙醛。
2. 切片制备：使用组织切片机将固定的组织切割成薄片，通常厚度为4-6微米。
切片后将其放置在载玻片上。
3. 反蜡处理：将玻片连同组织切片一起放入石蜡热解蜡剂中，以去除石蜡并使组织暴露。
4. 抗原修复：根据需要，对组织切片进行抗原修复，以增强抗原的可见性。
抗原修复方法包括热处理或酶解。
5. 阻断非特异性结合：使用非特异性结合的抗体或血清对组织切片进行处理，以阻断非特异性结合位点，减少背景信号。
6. 第一次抗体孵育：将特异性的第一次抗体加入到切片上，与目标抗原结合，形成抗原-抗体复合物。
7. 洗涤：用洗涤缓冲液洗涤切片，以去除未结合的第一次抗体。
8. 第一次荧光标记：加入与第一次抗体结合的荧光标记物，以使目标抗原可视化。
9. 第二次抗体孵育：加入与第一次抗体特异性结合的第二次抗体，形成第一次抗体-第二次抗体复合物。
10. 洗涤：用洗涤缓冲液洗涤切片，以去除未结合的第二次抗体。
11. 第二次荧光标记：加入与第二次抗体结合的另一种荧光标记物，使第二次抗体可视化。
12. 核染色：如果需要，可以对细胞核进行染色，常见的核染色剂包括DAPI或荧光素。
13. 盖玻片：将一滴适当的封片剂加在载玻片上，然后用盖玻片覆盖标本。
14. 显微镜观察：使用荧光显微镜观察标本，并拍摄图像。
以上步骤是一般的操作流程，具体的步骤和试剂使用可能会根据实验的具体要求和试剂的特性而有所不同。
在进行实验之前，请确保严格按照实验室的安全操作规程和相关实验方案进行操作。
石蜡切片免疫组化染色步骤 -回复
石蜡切片免疫组化染色步骤-回复石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于检测组织中特定蛋白质的表达和定位。
通过特定抗体的结合，可以在组织切片上形成可见的染色反应，从而了解细胞分布、形态和功能。
本文将一步一步介绍石蜡切片免疫组化染色的详细步骤。
第一步：取材固定首先，需要取得要进行免疫组化染色的组织样本。
可以是新鲜组织，也可以是经过福尔马林或其他适当的固定剂固定后的组织。
固定的目的是固定细胞内蛋白质的结构，以保持其形态和抗原性。
固定过程中要避免产生过度固定，否则可能会破坏细胞结构和抗原的特异性。
第二步：组织脱水和浸渍将固定好的组织样本进行脱水和浸渍。
脱水的目的是去除组织中的水分，使其能够与石蜡充分相溶。
浸渍的目的是使组织均匀地吸收石蜡，以便切片时组织能够坚固并保持形态。
一般的脱水和浸渍步骤包括用不同浓度的酒精进行脱水，然后使用清洁剂和石蜡浸渍组织。
第三步：包埋和切片经过浸渍的组织样本需要进行包埋，以保持其形态和结构。
将组织样本放置在浸渍好的石蜡中，使其充分浸透，然后将其放置在冰上使石蜡固化。
固化后的组织样本可以用切片机切成非常薄的切片，通常是4-6μm。
切片质量对于后续的免疫组化染色非常重要，所以要确保切片的平整和完整。
第四步：切片除蜡和重现组织抗原切片除蜡是为了去除包埋后留在组织切片上的石蜡，以便进行后续的染色。
一般使用酮或甲醇进行除蜡，然后通过多次水洗将组织切片充分清洗。
重现组织抗原则是为了使切片上的抗原能够被抗体检测到。
根据抗原的性质和检测的目的，可以选择适当的方法进行重现组织抗原，如酶解、蛋白酶解或热诱导抗原修复等。
第五步：抗体孵育将免疫组化染色所需的一抗加在切片上，与切片中的特定抗原发生特异性结合。
孵育时间和温度根据抗体的性质和抗原的稳定性来确定，一般在室温下孵育数小时或过夜。
抗体孵育结束后，使用缓冲液或PBS洗涤切片，以去除未结合的抗体。
第六步：二抗孵育和信号检测在一抗的基础上，可以使用与一抗来源不同物种的二抗来进行信号放大。
石蜡切片免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫荧光染色方法1.组织固定将待染的组织标本取出，用生理盐水或磷酸盐缓冲液进行冲洗，以去除血液和其他污染物。
然后用组织固定剂（如4%的多聚甲醛）进行固定，时间一般为12-24小时。
固定后，将组织转移到30%蔗糖缓冲液中，保持在4°C下过夜。
2.组织包埋将固定后的组织进行脱水和透明化处理。
首先用70%乙醇进行脱水，然后使用95%和100%的乙醇进行脱水，每个浓度的乙醇浸泡时间为30分钟。
接下来，用细胞脱水剂（如xylene）进行透明化处理，每次浸泡30分钟。
最后，将组织置于石蜡中，使其逐渐浸透，浸泡时间一般为12-24小时。
3.组织切片将石蜡浸透的组织取出，固定在切片架上。
使用旋转切片机将组织切成5-10微米厚的切片。
切好的切片用除去石蜡的溶剂（如xylene）处理，然后通过悬浮在磷酸盐缓冲液中移至玻璃切片上。
4.抗原修复在切片上涂抹抗原修复液，将其加热至适当温度进行修复，以恢复组织中的抗原活性。
不同的修复条件适用于不同的抗原修复液，一般修复温度为95°C，时间为20-30分钟。
修复后，将切片用磷酸盐缓冲液冲洗数次。
5.抗体染色在切片上涂抹首要抗体（抗体与所要检测的抗原有特异性结合）。
将切片置于湿润箱中，室温孵育1小时，或在4°C下孵育过夜。
然后，用PBS缓冲液冲洗切片，以去除未结合的抗体。
接下来，涂抹荧光标记的二抗（与首要抗体结合的二抗），并孵育30分钟。
6.荧光显微镜观察将切片加装到玻璃片上，并用适当的荧光封装剂封盖。
使用荧光显微镜观察切片，观察和记录荧光信号和组织结构。
注意事项：1.在操作过程中，要严格避免组织检测和悬浮液受到光照。
2.切片机和刀片必须保持清洁和尖锐，以确保切片的质量。
3.在染色过程中，要注意温度和时间的控制，以保证染色效果。
4.切片和显微镜观察时，要确保显微镜的光源和滤光片与所使用的荧光标记相匹配。
5.进行染色之前，要检查抗体的适用性和浓度，以确保染色结果的准确性和可靠性。
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法1、组织的采集、固定和保存：采取组织后，方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4︒C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年 tesis）PBS缓冲液洗三次，每次5min，4︒C保存于70%乙醇中。
2、组织的包埋、切片、展片及保存：：固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54︒C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10μm，贴于处理过的干净载玻片上，37︒C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。
石蜡包埋：保存于4︒C 70%乙醇中的组织样品↓80%乙醇 15 min↓95%乙醇 15 min↓100%乙醇 15min ⨯ 2↓1/2乙醇1/2二甲苯 15 min↓二甲苯透明 5-10 min↓1/2二甲苯1/2石蜡 30 min↓石蜡（1） 1.5hr↓石蜡（2） 1.5-2.5hr↓石蜡（3）包埋↓RT保存3、石蜡组织切片的免疫组化方法：密封保存于RT的组织切片↓二甲苯(1) 20 min↓二甲苯(2) 20 min↓100%乙醇 20min↓95%乙醇 10 min↓80%乙醇 10 min↓通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈↓切片在PBS中浸泡 5 min*2↓0.4%Tritonx RT 10 min↓切片在PBS中浸泡 5 min*33%H2O2 RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*30.25%胰酶RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*3Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min倾去blocking buffer，勿洗一抗4︒C overnight in blocking buffer取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h切片在PBS中浸泡 5 min*3DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）如果是增强型DAB只要1min即可。
石蜡切片免疫组化实验方法
石蜡切片免疫组化实验方法预处理：1.收集组织样品：选择实验需要的组织样品，如病变组织或动物组织，固定在4%的中性缓冲福尔马林溶液中，通常时间为24小时。
2.脱水：将固定的组织样品进行脱水处理，使用升级的乙醇浓度，如70%乙醇、85%乙醇和95%乙醇各浸泡5-10分钟，然后在无水乙醇中浸泡2-3次，每次浸泡时间为10分钟。
3.渗透剂处理：将组织样品置于染料渗透剂（如苯酚甲醛、苯酚）中进行渗透处理。
渗透剂的选择根据实验需要的类型来确定。
4.包埋：将已经渗透处理的组织样品放入合适大小的模具中，加入石蜡进行包埋，通常使用两次石蜡浸渍15-20分钟，然后定位标本，放入包埋模具中。
切片：1.切片机调节：根据具体的切片机和刀片的不同，调节适当的角度和切片速度。
2. 切片：将包埋好的组织块放入切片机的切片盘中，以适当的角度切出厚度约为4-6um的石蜡切片，切片时需要保持刀片的清洁，避免刮伤组织。
3.切片回收：使用刀片回收装置将切下的切片轻轻回收至水中，再将切片转移到预处理盒中。
染色：1. 去蜡：将石蜡切片放入脱蜡溶液（如xylene）中进行脱蜡处理，每个浸泡站点持续3-5分钟。
2.脱水：将石蜡切片从脱蜡溶液中取出，放入浓度递减的乙醇溶液中，分别浸泡5分钟，如95%乙醇、70%乙醇和纯水。
3.抗原修复：为恢复组织切片的抗原表位，可以选择酶消化、高压加热或微波处理等方法来进行抗原修复，常用的抗原修复方法包括热处理和酶切法。
4.屏障消除：为了阻止非特异性结合，需要进行屏障消除，使用5%非脂干奶粉或血清进行预阻断，通常需要在37°C孵育1小时。
5.一抗处理：将相应的一抗加入切片上，覆盖玻璃片，通常需要在4°C下孵育过夜。
6.洗涤：用洗涤缓冲液对切片进行洗涤，通常重复3次，每次5分钟。
7.二抗处理：将荧光标记的二抗加入切片上，覆盖玻璃片，通常需要在室温下孵育1小时。
8.洗涤：用洗涤缓冲液对切片进行洗涤，通常重复3次，每次5分钟。
石蜡切片免疫荧光技巧
石蜡切片免疫荧光技巧
石蜡切片免疫荧光技术是一种常用的免疫组织化学方法，用于检测或定位特定抗原在组织样本中的分布情况。
以下是石蜡切片免疫荧光技术的步骤：
1. 组织固定和包埋：将组织样本固定在含有4%的缓冲甲醛中，以保持其形态和结构。
之后，将组织样本包埋在去离子石蜡中，以增加其硬度和切片的稳定性。
2. 去除蜡并切片：用刀片将固定和包埋的组织样本切割成薄片，通常为4-10微米厚。
3. 抗原解蜡：将蜡切片浸泡在去蜡溶液中，以去除蜡，并将其进行再水化，以恢复组织的水合状态。
4. 抗原检测：用适当的抗体与特定的抗原结合。
首先，用一种可以结合到抗原的初级抗体处理组织切片。
然后，使用荧光标记的二级抗体结合到初级抗体上，从而使标记可见。
5. 荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察组织切片，并通过选择合适的滤光片来检测和分析特定抗原的荧光信号。
不同的荧光染料可用于标记不同的抗原，以实现多重标记和多抗体检测。
石蜡切片免疫荧光技术具有高度的灵敏性和特异性，可用于检测和研究生物标志物在各种疾病和组织中的分布和表达水平。
石蜡切片免疫荧光实验步骤
石蜡切片免疫荧光实验步骤1、脱蜡至水：将组织切片室温放置10min后，依次将石蜡切片放入二甲苯3min→无水乙醇5min—85%酒精5min—75%酒精5min—ddH2O洗5min。
2、抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复液（50X稀释至1X使用)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（中火8min—停火8min—中低火7min）。
此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。
自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min（具体修复液和修复条件根据组织来确定）。
3、画阻水圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，防止液体流失。
4、BSA封闭：在圈内滴加3%-5%浓度BSA孵育30min（或二抗同源血清封闭）。
5、一抗孵育：轻轻甩干封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗（溶于血清：PBS=1:19的抗体稀释液体系中），切片平放于湿盒（内加少量水防止抗体蒸发），4°C过夜。
6、二抗孵育：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加相应的荧光二抗，覆盖组织，避光RT孵育50min。
7、DAPI染核：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光RT孵育3-5min。
8、树脂封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后用树脂封片剂封片（其间可滴加少量抗荧光淬灭剂）。
9、镜检拍照：切片于荧光显微镜/confocal/活细胞工作站中观察并采集图像（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发橙光；CY5发红光）。
10、结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光，图片处理需使用Image J 软件。
石蜡切片免疫荧光实验步骤
石蜡切片免疫荧光实验步骤
一、样品处理
1、选择适当体积的样品石蜡切片，防止干燥，封好盖子到-80℃，直
到使用时将其取出变性到室温，以备后续操作。
2、室温下取出石蜡切片，施加蛋白酶将切片上原有的细胞、细胞膜
分解，具体操作步骤为：将取出的石蜡切片放入0.1%胰蛋白酶(Protease，Roche)或0.5% Triton X-100溶液中，置于37℃水浴摇床，25min后将石
蜡切片放入3mm×2mm的转移槽内，加入200ul去离子水，搅拌进行超声
处理，30s后用1000ul去离子水冲洗，放入4℃冰箱保存，以备后续操作。
二、组织切片染色
1、在刻线玻片上放入石蜡切片，用吸水棉柱将石蜡切片固定。
2、用0.1%胰蛋白酶(Protease, Roche)或0.3% Triton X-100溶液
浸泡石蜡切片，置于37℃水浴摇床，15min后去除液体，另用500μl去
离子水洗涤，将含有抗体的抗体溶液稀释至0.3μg/ml，加入石蜡切片上，放入35℃恒温箱，反应1h。
3、取出石蜡切片，加入1000μl去离子水洗涤，放入4℃冰箱保存，以备后续操作。
三、免疫荧光检测
1、把石蜡切片放入适量的去离子水中浸泡，去除多余的抗体。
2、将放入去离子水中浸泡的石蜡切片放入多孔玻片，在摇床上稀释FITC标记的抗体，加入石蜡切片上，置于37℃水浴摇床上，1h后去除液体。
石蜡切片免疫荧光组化
免疫荧光组化（IHC）1.脱蜡Ⅰ二甲苯：3 minⅡ二甲苯：3 min1:1二甲苯：无水乙醇：3 min2.复水Ⅰ无水乙醇：3 minⅡ无水乙醇：3 min95%乙醇：3 min70%乙醇：3 min50%乙醇：3 min30%乙醇：3 min3.流动的自来水冲洗：5 min（在水龙头上接一个软管，水流放慢，注意管口要放在载玻片反面）4.抗原修复：20 min用双蒸水配制新鲜的10 mM的二水柠檬酸三钠，调节PH=6，加入0.05%的吐温20，将配制好的柠檬酸盐溶液加到染色缸内，放入玻片（带架子），95℃水浴20 min。
5.室温冷却6.PBS冲洗（每次洗换新的）：3X5 min将染色缸中加满PBS，放在水平摇床上，50 rpm，轻摇。
7.透明：10 min配制0.2%的Triton X-100 PBS溶液。
先将载玻片上的PBS吸净，然后用专用笔围绕组织画一个封闭的圆圈，室温晾干后，紧挨内圈再画一个封闭的外圈，室温晾干。
用移液器向封闭圈内加一定量的0.2%的Triton X-100 PBS溶液，保证液体浸没组织。
8.PBS冲洗：3X5 min同步骤6。
9.封闭：30 min（RT）配制1%马血清PBS溶液。
先将载玻片上的PBS吸净，用移液器向封闭圈内加一定量的1%马血清PBS溶液，保证液体浸没组织。
10.孵一抗：在湿盒中4℃过夜。
按比例在封闭液中稀释抗体.先将载玻片上的封闭液轻轻甩掉，将载玻片摆放在湿盒内，用移液器向封闭圈内加一定量的稀释后的抗体溶液，保证液体浸没组织。
11.PBS冲洗：3X5 min同步骤6。
12.孵二抗：30 min（RT，避光）按比例在封闭液中稀释抗体。
先将载玻片上的PBS吸净，用移液器向封闭圈内加一定量的稀释后的抗体溶液，保证液体浸没组织。
13.PBS冲洗：3X5 min同步骤6。
14.梯度脱水30%乙醇：3 min50%乙醇：3 min70%乙醇：3 min95%乙醇：3 minⅡ无水乙醇：3 minⅠ无水乙醇：3 min15.1:1二甲苯：无水乙醇：3 minⅠ二甲苯：3 minⅡ二甲苯：3 min（14-15可选）16.封片将载玻片放在白色纸盒中，在载玻片上滴加适量mounting buffer，盖盖玻片，室温水平放置，过夜后观察。
石蜡切片及免疫荧光
一、石蜡切片1.固定：将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。
凝固组织中的物质成分，尽可能保持其活体时的结构。
同时能使组织硬化，有利于切片的进行。
2.脱水：为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。
固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。
3.透明：常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。
纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。
材料块在透明剂浸渍过程称透明。
4.浸蜡：先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。
先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。
5包埋:以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。
6.切片:切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。
通常切片厚度为3-5um，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。
7.贴片与烤片:般使用恒温水浴锅，温度控制在37-401左右，有利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60^恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。
8.切片脱蜡及水化:干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化。
9染色:经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。
实验操作简单。
免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。
二、冰冻切片1.取材：应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。
2.速冻：1）将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。
2）如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。
3）当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20S组织即迅速冰结成块。
最新石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法整理
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法1、组织的采集、固定和保存：采取组织后，方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年tesis）PBS缓冲液洗三次，每次5min，4C保存于70%乙醇中。
2、组织的包埋、切片、展片及保存：：固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10m，贴于处理过的干净载玻片上，37C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。
石蜡包埋：保存于4C 70%乙醇中的组织样品80%乙醇15 min95%乙醇15 min100%乙醇15min 21/2乙醇1/2二甲苯15 min二甲苯透明5-10 min1/2二甲苯1/2石蜡30 min石蜡（1） 1.5hr石蜡（2） 1.5-2.5hr石蜡（3）包埋RT保存3、石蜡组织切片的免疫组化方法：密封保存于RT的组织切片二甲苯(1) 20 min二甲苯(2) 20 min100%乙醇20min95%乙醇10 min80%乙醇10 min通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈切片在PBS中浸泡 5 min*20.4%Tritonx RT 10 min切片在PBS中浸泡 5 min*33%H2O2 RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*30.25%胰酶RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*3Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min倾去blocking buffer，勿洗一抗4C overnight in blocking buffer取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h切片在PBS中浸泡 5 min*3DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）如果是增强型DAB只要1min即可。
如何用石蜡切片做出高质量组化和荧光图之经验
[原创] 如何用石蜡切片做出高质量免疫组化和免疫荧光图之经验组织病理染色是我们做研究经常需要用到的实验技术，是基本的实验室技术之一。
很多人都认为病理染色相对Western blot（之前我也专门写了一篇经验贴）来说更容易出结果，这一点我不否认，但要想做出一张漂亮的图还是有点难度的，尤其是免疫荧光。
本人在这方面算得上是有点经验，做出来的图片受到导师和同学们的一致认可。
今天我就跟大家分享一下我艰辛摸索出来的经验。
我将从取材部分开始讲，到显微镜拍片结束。
由于我是基本只做中枢神经系统的研究，所以下面以鼠脑为例。
一、取材1、物品试剂准备：生理盐水或PBS（每只小鼠80ml），4%多聚甲或者10%中性福尔马林（每只小鼠100ml），麻药，250ml玻璃烧杯两个，泡沫箱两个，泡沫箱盖子一个，1ml注射器一个，20ml注射器两个，7号头皮针一个，大头针四个，止血弯钳（12.5cm）两把，组织剪一把（25cm），眼科剪一把，眼科弯镊一把，10mlEP管若干（一个鼠脑一管，提前装好固定液）。
2、取材步骤心脏灌注首先是麻醉小鼠。
等待麻醉诱导时把两个烧杯分别装上生理盐水和多聚甲，然后将烧杯半埋在冰中预冷。
麻醉后用大头针将小鼠固定于泡沫箱盖子上（用组织剪戳个洞，用以引流灌注出来的废液至泡沫箱中），暴露小鼠胸腔和心脏（用止血钳固定，用组织剪剪皮和开胸），注意别剪破肝脏和肺脏了，暴露后持止血弯钳稍微用力夹住一点心尖部（不要锁死钳子,留出进针的缝隙），微微用力向上提，仔细看心尖两侧颜色深浅，较浅那边是左心室部分，然后用头皮针（剪断针尖斜面，以防戳穿心底，提前接上装满生理盐水的注射器并赶走导管中的气泡）从心尖沿着左心室的长轴进针，全神贯注体会手感，当刚好有突破感时再进一点点，这时锁死止血钳。
然后用眼科镊夹起右心耳，并以眼科剪剪破之，见暗红的血涌出，接着手推注射器活塞，大概半分钟推完20ml生理盐水，连推4管，这期间观察肝脏颜色、肺脏大小及口鼻有无渗液。
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石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案
石蜡标本固定、脱水、包埋方法
大鼠自心脏灌注4%多聚甲醛内固定1-2h后取材：取脑出血血肿处脑组织（厚度约3mm），置于塑料盒中并浸泡在4%多聚甲醛中固定，室温中固定时间12-48h，固定好的组织脱水前应流水冲洗30min-1h左右除去固定液，取固定好的脑组织标本脱水、包埋。
具体步骤按以下方法进行：此方法参考《组织病理学技术》周庚寅北京大学出版社 2006年
⏹70%： 1h-2h
⏹80%： 1h-2h
⏹90%： 1h-2h
⏹95%： 1h-2h
⏹95%： 1h-2h
⏹无水Ⅰ：30min-60min
⏹无水Ⅱ：30min-60min
⏹二甲苯及水水酒精 1：1混合液 30min
⏹二甲苯Ⅰ：30min
⏹二甲苯Ⅱ：30min
⏹石蜡Ⅰ： 1h
⏹石蜡Ⅱ： 1h
⏹石蜡Ⅲ： 1h
包埋：在病理科包埋方法基础上灵活改进：在包埋铁模具上进行，融蜡-放置组织于中央-扣包埋盒4℃冷却10min-撬蜡。
注意事项：
1、固定液的种类：10%中性甲醛，4%的多聚甲醛最合适，在37°或室温中固定12-48h能很
好保存抗原和抗体的反应能力，实验室用的更多的是在4℃冰箱中固定24h-3d。
有人建议中性甲醛40摄氏度固定2~3小时，流水冲洗20min-30min，这样可以缩短制片的时间。
2、熔蜡温度65 ℃左右；
3、严格按照预定实验步骤进行，保证脱水及透明完全，透明后见云雾状说明脱水不完全，
需退回无水酒精中返工。
4、经一级二甲苯透明后检查组织是否透明，二级二甲苯透明时间以具体时间而定。
5、注意及时更换梯度酒精及二甲苯（1月）。
组织石蜡切片摘自《免疫组织化学实验技术及应用》 P12 化学工业出版社2006
1.载玻片的处理：采用现成的APES处理过的硅化载玻片。
2.石蜡切片注意事项：1、用于免疫组化的蜡温应为56~58℃，切片水温为
40℃左右，应先置于冷水中（冷水中可参入酒精有利快速展片-见相关方
法），然后再移入热水中，这样可以使切片顺利展平；2、烤片时要注意：一般在62℃烤片30-60min，抗原较强的组织可在60摄氏度烤3~8h，抗
原较弱的组织可于37℃的恒温箱内过夜；3、切片如需长期保存，可置
于4℃或室温下，千万不可脱蜡后4℃保存，因脱蜡后失去了对抗原决定
族的保护。
冰冻切片摘自《免疫组织化学实验技术及应用》 P12 化学工业出版社 2006
冰冻切片的优点是能较完整的保持抗原性。
组织细胞的某些抗原成分，特别是细胞膜抗原、受体抗原、酶及肽类抗原在石蜡切片处理过程中，可不同程度遭受破坏或失去抗原性，而冰冻切片能最大限度地保护抗原。
缺点是冷冻过程中形态结构可能破坏，抗原易弥散。
方法：
1.载玻片的处理：经明胶处理的载玻片。
2.将新鲜组织置于-25℃左右的恒冷箱中，待组织完全冷冻后即可连续切片。
3.动物组织经4%多聚甲醛灌注内固定及其在4℃固定12-48h后，经40%蔗糖脱水沉底，
吸干组织表面的液体后置于-25℃左右的恒冷箱中，待组织完全冷冻后即可连续切片。
4.取出切片后，应用电风吹冷风吹干或自然干燥。
5.其注意事项：1、温度不能太低，否则组织表面易出现冰渣；2、抗卷板的位置要适中，
否则难以成片；3、贴片时动作轻而迅速，否则易出现褶皱；4、组织从液氮或-80℃取出，必须进行温度平衡后才能切成片，切完的组织如下次还用，应用冷冻头在没有完全溶解前取下，密封后低温保存。
石蜡切片免疫组化：
石蜡切片机切片，厚3 5um，充分晾干(>3小时)。
烤箱62～64度1小时后并能较好粘片，可长期保存。
1. 烤箱65度5分钟。
2 石蜡切片脱蜡至蒸馏水。
（脱蜡方法见后）30分钟
3 PBS 冲洗，2分钟x2 次。
4 抗原修复：微波炉30分钟（大火15min,中火15分钟）浸泡在PH 6.0的柠檬酸缓冲液里。
自然冷却到室温PBS 冲洗，2分钟x2次
53%H 2 O 2 室温孵育10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS 冲洗，2分钟x2 次。
6 5-10% 正常山羊血清(PBS 稀释) 封闭，室温孵育20 分钟，倾去血清，勿洗。
7 滴加稀释一抗工作液，37 ℃孵育1-2 小时或4 ℃过夜。
(用100微升抗体稀释液稀释1微升一抗)
8 PBS 冲洗，2 分钟x3次。
9 滴加适量生物素标记二抗工作液，37 ℃或室温孵育30分钟。
10 PBS 冲洗，2 分钟x3次。
11 滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素（SABC）工作液，37 ℃或室温孵育20 分钟。
12 PBS 冲洗，2分钟x3次。
13 显色剂显色5-15 分钟（DAB ）1ml蒸馏水+A ,B ,C各一滴。
在显微镜下观察效果。
14 蒸馏水2mi n×2次，
15 SE轻度复染<1min；必要时盐酸酒精分化数秒，见标本变粉红即可，分化后水洗5min.。
16 脱水；晾干，透明;
17 树胶封片。
（注意：盖玻片要先自己洗好晾干，高质量盖玻片可不用清洗，PBS冲洗时间因方式而异，浸泡时，时间可缩短。
严格配制PH值要求的缓冲液）
HE染色程序30分钟
石蜡切片脱蜡后，冰冻切片水洗5min后可直接进行
1.苏木素：3min
⏹水洗：1min
2.盐酸酒精：20s
⏹水洗：5min
3.伊红：1min
⏹自来水洗净：5min
4.脱水步骤
⏹50%：片刻
⏹75%：片刻
⏹85%：片刻
⏹95%：片刻
⏹无水酒精1：2min
⏹无水酒精2：2min 晾干或烤干
⏹二甲苯1：1-2min
⏹二甲苯2：1-2min
5.封片：中性树胶
脱蜡方法30分钟
烤箱中65 度5分钟后
二甲苯1：10min
二甲苯2：5min
无水酒精1：5min
无水酒精2：2min
95%酒精：片刻
90%酒精：片刻
85%酒精：片刻
75%酒精：片刻
蒸馏水：5min
免疫组化常用缓冲液配制：
1、0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸0.4g，加蒸馏水定容至
1000ml
2、0.01mol/L PBS缓冲液生理盐水（pH 7.4，2000ml）
母液的配制：（0.2mol/L）
19ml B + 81ml A + 17g NaCl至2000ml 即为0.01mol/L PBS缓冲液生理盐水。
A液
Na
2
HPO
4
·12H
2
O
(磷酸氢二钠)
7.164g 28.656g 35.82g 71.632g
加蒸馏水至100ml 400ml 500ml 1000ml NaH2PO4•2H2O (磷
酸二氢钠)
3.121g 12.484g 15.605g 31.21g
B液加蒸馏水至100ml 400ml 500ml 1000ml
石蜡切片免疫荧光实验步骤
1. 烤箱60度5分钟，
2 石蜡切片脱蜡至水。
3 PBS 冲洗，5 分钟x2 次。
4 抗原修复：微波炉30分钟，浸泡在装满柠檬酸盐缓冲液的染色盒中；
冷却到室温PBS 冲洗，5 分钟x3 次。
5. 5 %正常驴血清（PBS 稀释）封闭，室温孵育20分钟，倾去血清，勿洗。
6. 滴加稀释一抗（如：GFAP）工作液，4 ℃过夜。
(用100微升抗体稀释液稀释1微升一抗)
7. PBS 冲洗，5 分钟x3 次。
8. 滴加适量荧光标记二抗工作液，室温孵育1小时。
9. PBS 冲洗，5 分钟x3 次。
10. Hoechst染核20分钟后，倾去液体可直接进行观察，或13步。
（此步是否进行看实验要求）
11. 5%PBS甘油封片。
可有效抗荧光衰减达一周。
12. 择日行荧光显微镜观察。