冰冻切片免疫荧光染色流程
冰冻切片实验步骤
全部试验步骤1取颖组织于4%多聚甲醛固定24 小时230%蔗糖脱水48 小时以上3-250C 包埋〔冰冻切片机内〕4冰冻切片冰冻切片步骤冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片4~8μm，室温放置30 分钟后，入4℃丙酮固定10 分钟，PBS 洗，5 分钟×3 次。
用3%过氧化氢孵育5~10 分钟，以消退内源性过氧化物酶的活性。
PBS 冲洗，5 分钟×2 次。
下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。
(见我发的前面的帖子)你确定你是冰冻切片吗！冰冻切片不能用热修复啊！！以下是我的步骤：1冰冻切片室温放置30 分钟后，入4℃丙酮固定10 分钟，PBS 洗，5 分钟×3。
用3％过氧化氢孵育5~10 分钟，PBS 洗，5 分钟×2。
25~10％正常山羊血清〔PBS 稀释〕封闭，室温孵育10 分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2 小时或4℃过夜。
3PBS 冲洗，5 分钟×3 次。
4滴加滴加其次代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30 分钟。
PBS 冲洗，5 分钟×3 次。
5滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30 分钟。
6PBS 冲洗，5 分钟×3 次。
7显色剂显色〔DAB〕。
8自来水充分冲洗，复染，封片。
冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20 分钟。
此配方不易产生脱片。
配制方法是在9ml 甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次颖配制。
冰冻切片免疫组化染色步骤冰冻切片4~8mm，室温放置30 分钟后，入4℃丙酮固定10 分钟，PBS 洗，5 分钟×3。
用3％过氧化氢孵育5~10 分钟，消退内源性过氧化物酶的活性。
PBS 洗，5 分钟×2。
下接免疫组化染色操作步骤。
DAB 显色，显色时放置在白色纸上，观看显色程度以终止DAB 反响，最好把玻片置于显微镜上找到可能的阳性显色区域滴加DAB ，观看到阳性区和阴性区差异后终止，此时最 好有计时，以便于今后重复试验把握显色时间〔一般显色时间 2s-10min ，显色时间过长玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。
免疫荧光双染
免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS 1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、 DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。
去除PBS 后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
冰冻切片免疫组化染色步骤
冰冻切片免疫组化染色步骤一、前言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、切片、抗体染色等。
本文将详细介绍这些步骤。
二、样品处理1. 采集样品首先需要采集需要检测的样品。
比较常见的样品包括动物或人类组织、细胞培养物等。
2. 固定样品采集好的组织或细胞需要进行固定处理，保证其形态和结构不受损伤。
固定处理一般使用4%多聚甲醛或4%乙醛进行。
3. 脱水处理为了使样品更易于切割，需要对其进行脱水处理。
脱水处理可以通过将固定好的组织或细胞分别浸泡在70%、80%和95%乙醇中进行。
4. 包埋处理最后，将脱水后的样品进行包埋处理，即将其置于石蜡中，并逐渐加热至60℃以上，直到石蜡完全浸透到样品中。
三、切片1. 制备切片将包埋好的样品切成5-10微米厚的切片。
这一步需要使用专业的冰冻切片机进行，确保切片质量。
2. 将切片悬浮在载玻片上将制备好的切片悬浮在载玻片上，并进行干燥处理。
这一步需要注意，避免样品受到外界污染。
四、抗体染色1. 抗原修复为了提高抗体的结合效率，需要对样品进行抗原修复处理。
这一步可以通过加热或酶解等方式实现。
2. 阻断非特异性结合为了避免非特异性结合，需要在抗体染色前对样品进行阻断处理。
常用的阻断剂包括牛血清白蛋白和小鼠IgG等。
3. 抗体染色将已经稀释好的一抗和二抗依次加入到载玻片上，并进行孵育处理。
这一步需要注意控制反应时间和温度等因素。
4. 显色与荧光显微镜观察最后，通过加入显色剂或荧光染料实现蛋白质的可视化。
观察过程需要使用荧光显微镜进行。
五、总结冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、切片、抗体染色等。
在实验过程中，需要注意控制反应时间和温度等因素，以确保实验结果的准确性。
冰冻切片免疫荧光直接染色操作流程
冰冻切片免疫荧光直接染色操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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冰冻切片免疫荧光实验步骤
冰冻切片免疫荧光实验步骤1. 前言嘿，朋友们！今天我们来聊聊一个科学实验的酷炫玩法——冰冻切片免疫荧光实验。
你可能会想，这听起来有点高深，其实没那么复杂，咱们用轻松的方式来搞定它！这个实验就像是给细胞穿上五光十色的衣服，让它们在显微镜下闪闪发光。
是不是听起来有点像魔法？不过，魔法背后可是需要一系列精细的步骤哦，接下来就让我们一起踏上这趟科学之旅吧！2. 材料准备2.1 器材首先，咱们得准备好一些“武器”。
你需要的工具有：冷冻切片机、显微镜、抗体、荧光染料、冰块、以及小瓶子。
别担心，这些东西在实验室里一般都能找到。
好比去超市购物，准备齐全才能大干一场嘛！2.2 样本收集然后，咱们得搞定样本。
可以用小动物的组织，比如小鼠的肝脏或脑组织，当然也可以是细胞培养。
像选菜一样，找个健康的样本，才能做出美味的实验结果。
记得小心翼翼哦，样本可是你实验的“主角”！3. 冰冻切片3.1 制作切片接下来就是最重要的环节了！将收集到的样本放进冷冻机，设置好温度，通常是在20°C到80°C之间，具体要看你使用的试剂。
等样本冰冻得像冰棍一样，取出来，用冷冻切片机将它切成薄薄的片，厚度大约在510微米之间。
要知道，切片越薄，观察的时候越清晰，就像看电影的时候画面越高清，效果自然越棒！3.2 贴片固定切好的薄片就像鲜花一样，需要“小心翼翼”地处理。
将切片放到载玻片上，记得用一些固定液，比如丙酮或者甲醇，给它们来个“定妆”！这样能让你的切片在后续步骤中更加稳固。
让我们给这些切片点个赞，做得不错哦！4. 免疫染色4.1 抗体孵育好了，接下来的步骤就像给细胞化妆一样。
把固定好的切片放进抗体溶液里，让它们充分“泡澡”。
通常来说，先用一抗（即特异性抗体）孵育，时间可以在1小时到过夜之间，视情况而定。
这个时候，你可以想象细胞们正开心地吸收着抗体，准备好接下来的“盛宴”！4.2 荧光染料待一抗充分结合后，咱们再来一剂“荧光染料”！同样把切片浸泡在二抗（荧光标记抗体）里，接着再静置一会儿。
免疫荧光双染完整版
免疫荧光双染集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS （PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。
去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
冰冻切片免疫荧光染色流程
冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例)（1）冰冻切片室温晾干15分钟；（2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）；（4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5）PBS洗3次，每次10分钟；（6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37℃孵育1小时；（7）PBS洗3次，每次15分钟；（8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照；（9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。
注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。
附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）：（1）pH7.40.01MPBS：配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl7.65g0.1MPBS配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O5.9g+NaCl 17g定容至2000ml,高压，pH 7.2-7.4（2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.40.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存（3）封闭液：10％NGS－0.3%TrixtonX100－pH7.40.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存（4）抗体稀释液：1％BSA－0.3%TrixtonX100－pH7.40.01MPBS，分装1ml/支－20℃保存。
冰冻切片的免疫组化染色步骤
冰冻切片的免疫组化染色步骤
1.准备工作：
（1）准备正常组织冰冻切片，使用离心切片机将原有组织材料切成
5-10μm厚的片层，切片后立即放入凝胶剂（如冰冻液中的季铵盐）内，
紧急冷冻到-20℃；
（2）准备石蜡糊，将石蜡熔解并加入一定量的溶剂使其至流体状态；
（3）准备免疫染色的药品，比如羊抗体、抗原标记物（Biotinimidazole）、Streptavidin-HRP（HorseradishPeroxidase）等。
（1）将冰冻切片浸入石蜡糊中进行热融化处理，处理完毕后将其放
置于待用；
（2）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用70％乙醇清洗，然后放
入PBS小规模洗涤，然后用清洗液（清水）浇上，以去除表面的乙醇；
（3）将冰冻切片浸泡在去除组织胶多聚体液中，液体里溶解蛋白质
类多聚体，以防止抗体与冰冻切片上的组织胶多聚体结合；
（4）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用于抗体的定量涂布，将
抗体与切片表面的抗原结合；
（5）在抗体涂布完毕后，将冰冻切片置于含有PBS溶液的室温下供
2小时以上，使抗体能够与冰冻切片上的抗原结合；
（6）将冰冻切片从室温溶液中取出，放入冰冻液中，将表面的多余
抗体冲洗掉；。
冰冻切片免疫荧光染色步骤
冰冻切片免疫荧光染色步骤
冰冻切片免疫荧光染色步骤
：
（1）冰冻切片取出，室温放置使其干燥后，用冷丙酮于4℃固定10分钟。
（2）切片用0.01MPBS清洗后加入1.2%双氧水作用30分钟，以除去非特异染色。
（3）0.01M PBS清洗，3次×10分钟。
（4）0.3%Triton X-100作用30分钟。
（5）加入以抗体稀释液（含1%BSA的0.01M PBS，pH7.4）稀释至工作浓度的一抗，4℃过夜。
（6）0.01M PBS清洗，3次×10分钟。
（7）加入荧光抗体TRITC-IgG（1：100）或FITC-IgG（1：100），室温孵育2小时。
（8）0.01M PBS清洗，3次×10分钟。
（9）缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察。
对照组：采用空白对照：除用0.01MK PBS代替一抗外，其余程序与实验组相同。
载玻片处理步骤：
（1）硫酸浸泡过夜。
（2）自来水冲洗干净后双蒸水冲洗3遍。
（3）晾干后在0.1%明胶中快速浸泡后取出。
室温晾干或37℃烤干备用。
1/ 1。
免疫组织荧光染色法实验操作流程
5min
100%乙醇Ⅱ
5min
95%乙醇
2min
90%乙醇
2min
80%乙醇
2min
70%乙醇
2min
蒸馏水（浸洗）
3*2min
抗原
修复
高压锅柠檬酸盐缓冲液
3min
先将柠檬酸盐缓冲液加到洗盒里，加热高压锅，待柠檬酸盐缓冲液升温至60℃左右时放入水化后的标本，盖好高压锅，不加压力阀。加热高压锅，待压力阀处冒水蒸汽时，盖上压力阀，加热三分钟。压力降到正常大气压后打开锅盖，待玻片自然冷却。
含DAPI的封片液封片
冰冻切片（贴片）
操作步骤（贴片）
时间
备注
操作步骤（漂片）
时间
备注
标本
-80℃保存
标本
保护液-20℃保存
漂片最好要20um
复温
室温
10min
复温
PBS洗（24孔板）
3*5min
摇床
固定
4%PFA固定
30min
破膜
PBS洗
3*10min
破%PBST破膜
MBP兔抗体
4℃过夜
加Ⅰ抗
0.3%PBST浸洗
2*5min
在加Ⅰ抗的时候，要用吸水纸吸干周围的水，用pad笔画圈，防止Ⅰ抗流失，影响效果。
驴抗兔488
1h
加Ⅱ抗
1×PBS浸洗
3*5min
室温下1h，注意要避光。如果需要进行双标，在从封闭开始进行，
含DAPI的封片液封片
封片
因封片液中含有DAPI染细胞核（蓝色），所以不用做核的染色。
自然冷却
封闭
蒸馏水洗
2*3min
Ⅰ抗为兔抗鼠，Ⅱ抗就应该为**抗兔，所以我们封闭时选用被抗最少的物种，一般选用牛血清或者驴血清。再封闭时，为了防止封闭液流失，可以用pad笔在标本周围画圈，提高液体的利用度。
冰冻切片的免疫荧光
免疫荧光通用操作规程冰冻切片的免疫荧光1，动物组织直接OCT包埋，或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后，OCT包埋。
-20℃保存3月，-80℃长期保存。
请勿保存于液氮。
2，冰冻切片机切片至少10um，空气干燥2分钟后，-20℃储存3，切片从-20取出后，在通风橱放10-30分钟以去除水汽，4%PFA固定15分钟，或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时4, 1XPBS清洗玻片，3X5min 从此请保持玻片湿润5，有时，抗原修复3小时会得到更好的结果。
为此请：选用稳定的抗原修复方式（真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热）…关注修复的温度，时间（抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间），抗原修复液必须遵循自然降温规律，使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液（ A液枸盐酸缓冲液 PH6.0， B 液 EDTA-Na缓冲液 PH8.0， C液枸盐酸缓冲液 PH4.5）6，室温封闭1小时封闭液：5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清 in 1xPBS条件封闭液：1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清 in 1xPBS（细胞因子，无需封闭的蛋白7，一抗4℃过夜请用封闭液稀释一抗8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min9,二抗，1:1000 （alexa系列）1:300（dyelight )in封闭液，避光室温1小时10, Wash,1XPBS, 3x5min11, DAPI 染核5min，12，DDW Rinse13，抗淬灭剂封片，（避免气泡）避光置于通风橱过夜14，干片后4℃保存石蜡切片的免疫荧光1，动物组织取出后经固定-脱水-包埋（见随后操作步骤)，制成石蜡包块2，组织学染色切片厚度2um，免疫荧光染色切片厚度至少6um，切片复水： 58℃20min-xylene 2x10min-100%EtoH2x10min95%EtoH2x10min-70%EtoH10min-， DDW5min4, Rinse 玻片 1xPBS, 从此请保持玻片湿润5，抗原修复过夜。
冰冻切片免疫荧光染色流程
冰冻切片免疫荧光染色流程
一、准备液体和器材：
1. 表面活性剂：TBS-T，Triton X-100，PBS，Ethanol，DMSO；
2. 染色液：PBS，Trizma-HCL，和4％PFA；
3.小刀：刀片用于切片，可以用来将切片切割为更小的片段；
4.水槽：若可用多个水室，可以将液体装入不同的水室，流程操作更便捷；
5.酶标仪：一般是用来进行荧光染色的，也可以用来进行基因分析。
二、准备样品：
1.将样品置于-80℃冰箱内，并将其在冰上进行切片；
2.将切片放置于室温，进行解冻，解冻时间需要20分钟至30分钟，静置时间应该在2小时左右；
三、免疫荧光染色：
1. 将冰冻切片浸入表面活性剂（TBS-T，Triton X-100，PBS，Ethanol，DMSO）中，使样品有足够的湿润；
2.接着将样品放入PBS，4％PFA溶液中；
3.将样品放入染色液中，依次洗涤，3次洗涤时间应该为30分钟；
4.将染色液置于酶标仪中，开始荧光染色；
5.酶标仪操作结束后，将样品取出，然后放入椰子油中水解，用来溶解染料分子；
6.最后，将样品放入可见光荧光镜下观察，观察免疫荧光染色的结果。
四、数据分析：
1.用酶标仪进行荧光染色实验时，结果会生成图像文件；。
冰冻切片免疫荧光染色流程
冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例)（1）冰冻切片室温晾干15分钟；（2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）；（4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5）PBS洗3次，每次10分钟；（6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37℃孵育1小时；（7）PBS洗3次，每次15分钟；（8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照；（9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。
注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。
附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）：（1）pH7.40.01MPBS：配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl7.65g0.1MPBS配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O5.9g+NaCl 17g定容至2000ml,高压，pH 7.2-7.4（2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.40.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存（3）封闭液：10％NGS－0.3%TrixtonX100－pH7.40.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存（4）抗体稀释液：1％BSA－0.3%TrixtonX100－pH7.40.01MPBS，分装1ml/支－20℃保存。
冰冻切片的免疫组化染色步骤
冰冻切片的免疫组化染色步骤冰冻切片的免疫组化染色步骤速冻组织将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。
取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。
冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。
室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。
也可根据需要选择其它的固定方式。
PBS洗，5分钟×3。
用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×3。
下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。
石蜡切片免疫组化染色步骤三步法（以SP试剂盒为例）1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。
4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5. PBS冲洗，2分钟×3次。
6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
7. PBS冲洗，2分钟×3次。
8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
9. PBS冲洗，2分钟×3次。
10. 显色剂显色（DAB或AEC）。
11. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。
石蜡冰冻片免疫荧光染色程序
1.石蜡片二甲苯、酒精梯度脱蜡复水；2.透化。
0.25%TritonX-100处理细胞10-30分钟；3.抗原修复。
微波热修复（柠檬酸盐修复液或EDTA抗原修复液）6分钟两次，中间间隔5分钟。
冷却至室温。
4.滴加与二抗同源的正常血清封闭（如10%山羊血清），室温20分钟。
甩去多余液体，不洗。
5.滴加适当稀释的一抗，37C1～2小时或4℃过夜。
0.01MPBS洗2分钟×3次。
6.滴加一抗相对应的荧光素标记二抗，37℃避光孵育30-60分钟。
0.01MPBS洗2分钟×3次。
7.DAPI染细胞核2-5分钟，清洗。
8.抗荧光衰减封片剂封片。
荧光显微镜观察。
1.冰冻片从冰箱取出后PBS浸泡恢复至室温；2.透化。
0.25%TritonX-100处理细胞10-30分钟；3.抗原修复。
预实验可以尝试不修复，若结果不理想可尝试蛋白酶消化10分钟（为主），或微波热修复（柠檬酸盐修复液或EDTA抗原修复液）6分钟两次，中间间隔5分钟。
冷却至室温。
4.滴加与二抗同源的正常血清封闭（如10%山羊血清），室温20分钟。
甩去多余液体，不洗。
5.滴加适当稀释的一抗，37℃1~2小时或4C过夜。
0.01MPBS洗2分钟×3次。
6.滴加一抗相对应的荧光素标记二抗，37℃避光孵育30-60分钟。
0.01MPBS洗2分钟×3次。
7.DAPI染细胞核2-5分钟，清洗。
8.抗荧光衰减封片剂封片。
荧光显微镜观察。
肾 活 检 冰 冻 切 片 免 疫 荧 光 染 色
肾活检冰冻切片免疫荧光染色
（直接法）
一．试剂
1.冷冻包埋剂OCT
2.荧光抗体：IgG-FITC,IgA-FITC,IgM-FITC,C3-FITC,C4-FITC,C1q-FITC，
Fg-FITC。
均用抗体稀释液进行1：100稀释。
二．取材
1.准备冷冻头（标号并预先包埋少量OCT）、纱布（生理盐水浸湿）、冰块
2.活检标本取出后，立即放入装有纱布的Tip管中，置冰块上送回实验室
3.组织立即置冷冻好的冷冻头上，再包埋少量OCT，恒冷切片机内制作冰冻切片（切片厚度为3um），用蒸馏水冲洗掉切片上的OCT;加稀释好的抗体，避光，湿盒内4℃过夜;蒸馏水洗2分钟×3次;荧光显微镜观察结果
三．注意事项：
1.取材后标本须快速冷冻
2.切片温度需适宜，不宜过高或过低
3. 染色过程中必须防止切片干燥，严格避光。
组织冰冻切片如何进行免疫荧光
组织冰冻切片如何进行免疫荧光观察组织中目的蛋白的定位，一般可以选择冰冻切片进行免疫荧光。
冰冻切片制作时间短，操作过程简单快捷，同时获得的免疫荧光图片相对于免疫组化图更加漂亮。
冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。
用高分子材料配制成冰冻切片包埋液，将冰冻包埋液直接可直接在切片机组织卡盘上加少许包埋液，在其固化前嵌入组织块，然后再于组织周围加入少许包埋液稳定。
组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。
冰冻切片过程较简单，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态。
免疫荧光技术亦称荧光抗体技术，应用化学方法将荧光色素（主要是异硫氰酸荧光黄FITC）与抗体结合起来，即荧光抗体，这种结合荧光色素的抗体的免疫原性并不因此而发生改变。
在特定条件下用荧光抗体染标本，如果标本中存在有相应的抗原，荧光抗体便与标本中的抗原发生特异性结合，在荧光显微镜的蓝紫光或紫外光照射下，标本中的抗原抗体复合物便发出特异的荧光，荧光的出现表明被检标本中特异抗原的存在。
免疫荧光特异性强、敏感性高、速度快。
今天就为大家介绍一下冰冻切片免疫荧光染色流程。
冰冻切片免疫荧光染色流程1冰冻切片一般选择多聚赖氨酸黏附性载玻片，多聚赖氨酸处理载玻片是带强阳离子的,主要用于病理组织切片、液基细胞学涂片,作用是防止玻片掉片。
冰冻切片之后如果不即时染色，可将片子放于负八十冰箱。
再次取出后可先在室温晾干15分钟。
然后置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；2用组化油笔将待染组织圈好，目的是为了在进行后续孵育抗体时尽量缩小范围，使抗体进行有效的孵育；30.5%TritonX-100(PBS配制)室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）;用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干）封闭的目的是通过血清与非特异性位点结合,以消除非特异性染色,提高目的蛋白的准确性和降低背景；4加入一抗(1:100-1：500)，4℃孵育过夜。
冰冻切片实验步骤
冰冻切片实验步骤全部实验步骤1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时2 30%蔗糖脱水48小时以上3 -250C包埋（冰冻切片机内）4冰冻切片冰冻切片步骤冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片4~8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。
用3%过氧化氢孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS冲洗，5分钟×2次。
下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。
(见我发的前面的帖子)你确定你是冰冻切片吗冰冻切片不能用热修复啊以下是我的步骤：1 冰冻切片室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS 洗，5分钟×3。
用3％过氧化氢孵育5~10分钟，PBS洗，5分钟×2。
2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
3 PBS冲洗，5分钟×3次。
4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。
PBS冲洗，5分钟×3次。
5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
6 PBS冲洗，5分钟×3次。
7 显色剂显色（DAB）。
8 自来水充分冲洗，复染，封片。
冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。
此配方不易产生脱片。
配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制。
冰冻切片免疫组化染色步骤冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。
用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×2。
下接免疫组化染色操作步骤。
免疫组化染色步骤：（SP试剂盒为例)1 冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。