冰冻切片免疫荧光染色流程

冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例)

（1）冰冻切片室温晾干15分钟；

（2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1 小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）；

（4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5） PBS洗3次，每次10分钟；

（6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma 公司)，37℃孵育1小时；

（7） PBS洗3次，每次15分钟；

（8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照；

（9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。

注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥

（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光

附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）：

（1）pH7.4 0.01MPBS：

配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g

0.1MPBS 配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O

5.9g+NaCl 17g 定容至2000ml, 高压，

pH7.2-7.4

（2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存

（3）封闭液：10％NGS－0.3% TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存

（4）抗体稀释液：1％BSA－0.3% TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1ml/支－20℃保存