石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于研究组织、细胞和分子的结构与功能。
它通过使用抗体与特定抗原相互结合，然后使用酶、免疫荧光等标记物来检测这种结合，从而实现可视化染色和定位目标分子的目的。
下面，我们将详细介绍石蜡切片免疫组化染色的步骤。
步骤一：蜡块去蜡石蜡切片通常是由固定的组织样本制备而成，这些样本在处理过程中会被包埋在石蜡中。
因此，第一步是将蜡块去蜡。
首先，将蜡块放在温水中加热，使蜡块软化。
然后，将蜡块用刮刀从玻片上刮下。
这样可以得到蜡块去蜡后的组织样本。
步骤二：样本再固定在蜡块去蜡后，为了更好地保持组织的完整性和稳定性，通常需要对样本进行再固定。
常用的再固定方法是将样本放入4%的中性缓冲福尔马林溶液中，在室温下固定4-24小时。
固定后，将样本从福尔马林中取出，用PBS（磷酸缓冲盐溶液）洗涤数次，以去除残余的福尔马林。
步骤三：切片制备在样本再固定后，需要将样本制备成切片。
首先，将组织样本放入甲醇中脱水，然后转移到乙醚中脱脂。
脱脂后，将样本放入苯骚酸乙酯中浸泡，使样本渗透均匀。
在苯骚酸乙酯中浸泡一段时间后，将样本转移到石蜡中浸泡。
石蜡具有很好的切片性能，可以更好地保持组织的结构。
最后，将样本放入石蜡包埋机中，进行加热和固化，制备成为石蜡块。
之后，使用旋转切片机将石蜡块切成4-6微米厚的切片。
切片后，将切片浸泡在热水中，使其展开并粘附在玻片上。
步骤四：抗原修复切片制备完毕后，需要对切片进行抗原修复。
抗原修复是为了使样本中的抗原能够更好地暴露出来，增加抗体的结合效率。
常用的抗原修复方法有热处理和化学处理两种。
热处理通常是将切片浸泡在含有缓冲盐的蒸馏水中，然后加热至高温（如95摄氏度）保持一定时间。
化学处理通常是将切片浸泡在含有抗原修复试剂的溶液中，如EDTA（乙二胺四乙酸二钠）溶液。
抗原修复的时间和条件需根据具体实验的要求来确定。
步骤五：非特异性结合阻断为了减少非特异性结合，需要对切片进行非特异性结合阻断。
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤石蜡切片免疫组化染色是一种常用的组织学染色技术，它能够通过染色反应检测组织中的蛋白质分子、细胞因子、细胞膜受体和细胞核因子等，为研究细胞和组织的功能以及疾病的发生机制提供了重要的工具。
下面将详细介绍石蜡切片免疫组化染色的步骤。
1.组织固定组织固定是石蜡切片免疫组化染色的第一步，它的目的是保持组织形态和结构，使得后续的染色步骤能够成功进行。
常用的固定方法有甲醛固定、醋酸盐固定和乙醇固定等。
其中，甲醛固定是最常用的方法，它可以固定组织细胞的形态和结构，同时减少细胞中的酶活性。
2.组织处理组织处理是将固定后的组织进行处理以便得到合适的切片和染色结果。
处理过程主要包括去水化、脱脂、透明化和浸渍等。
其中，去水化是将固定的组织从水中逐渐转移到无水乙醇中，以防止组织中的水分对后续蜡包埋产生干扰；脱脂是将组织中的脂肪酸等去除，以减少重组过程中的背景染色；透明化是将组织从乙醇中转移到透明剂中，以便光线穿过组织时不受阻碍；浸渍是将透明剂中的组织浸渍入蜡中，使其成为切片的固定基质。
3.蜡包埋蜡包埋是将处理后的组织浸入熔化的石蜡中，使其固定在蜡块中，并利用蜡的硬度和韧性将组织完整地包裹起来。
蜡包埋过程主要包括浸渍、浸透和固化等步骤。
其中，浸渍是将固定在透明剂中的组织浸渍入熔化的蜡中，以提高组织与蜡的亲和性；浸透是将融化的蜡逐渐浸透入组织内部的过程，以保持组织的完整性；固化是将蜡冷却固化，使其成为切片的固定基质。
4.制备切片制备切片是将包埋在蜡中的组织切成适当的厚度，以便后续的染色和观察。
制备切片的步骤主要包括切片机调节、切片和玻片浮法三个步骤。
其中，切片机调节是将切片机调整到适合的刀片和切片速度，以保证切片的质量和均匀性；切片是将包埋的组织从蜡块中切下，并将其转移到切片水槽中；玻片浮法是将切片从切片水槽中捞起，并将其平铺在预处理的玻片上。
5.脱蜡和重组脱蜡和重组是将切片上的蜡去除，并将组织重组成适合的形式，以便后续的染色步骤。
石蜡切片免疫组化步骤
石蜡切片免疫组化步骤1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。
2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(10min)→95%乙醇(10min)→90乙醇(10min)→80%(10min)4.抗原修复：柠檬酸钠缓冲液95度，10分钟. (枸橼酸三钠3g枸橼酸0.4g然后加水到950毫升左右，然后用NaOH或HCI调pH值6.0，最后定容在1000ml)5. PBS浸洗2次各5min6.加3%H2O2孵育5min(室温或37度，避光)。
肝组织过氧化物酶含量高。
需增加浓度或增长时间。
蒸馏水洗2minx3次8.pbs-曲拉通通透（pv法不需要）9.与二抗种属一致的血清封闭非特异位点。
（pv法不需要）9.滴加一抗4℃过夜10.PBS浸洗3次各5min11.滴加二抗室温或37℃孵育30min12.PBS洗3次各5min15.DAB显色5~20min，自来水充分涮洗16.苏木素复染2~3min，自来水充分涮洗17.氨水反蓝，过蓝可用盐酸酒精分化2s，自来水充分涮洗.用稀氨水返蓝，自来水里加几滴稀氨水，就行了，返蓝时间5分钟左右，就很好看了;淡氨水有人用50ml自来水＋三四滴的氢氧化铵；18.脱水、透明80%(5min)→90%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→ 100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min)19.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干二、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2h以上，然后按以下流程进行：二甲苯Ⅰ（1h）、二甲苯Ⅱ（30min）、100%酒精（30min）、95%酒精（15min）、70%酒精（15min）、50%酒精（15min）、蒸馏水（15min）2、3%H2O2，室温封闭5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
3、甩去H2O2，蒸馏水洗2min×3次。
石蜡切片免疫组化操作步骤
石蜡切片免疫组织化学操作流程一、组织获取（本实验室多做脑组织，所以以脑组织为例）1.动物麻醉：所用麻醉药物（水合氯醛水溶剂）剂量为350mg/kg动物体重，常用麻醉药物浓度为5%、6%、7%、10%（麻醉浓度越大，动物进入麻醉时间越短，但麻醉致死率相应较高，本人使用7%浓度，若注射位置正确，约3min进入麻醉状态）；动物麻醉后，将其固定于灌流操作平台，仰卧位；2.动物灌流手术：以胸骨剑突为起点，沿左右两侧肋下缘剪开老鼠皮肤至腋下，再次以剑突为起点，剪开皮下肌肉层，沿同样方向剪开肌肉至腋下，避免伤到内部脏器，剪破膈膜，沿左右两侧剪断胸骨，用止血钳夹住剑突向上翻转，充分暴露心脏；用弯镊分离心脏表面黏膜；左手持止血钳轻夹起心脏，倾斜一定角度，使心尖方向与升主动脉尽量位于同一直线上，右手持灌流针，沿直线所在所在角度由左心室进针，将灌流针直接插入升主动脉（可挑动灌流针于升主动脉内观察是否正确插入，此方法操作不熟练易插错血管或是直接刺穿心脏——或者直接将灌流针插入左心室，但前方法灌流效率较高）；固定器械（器械松动或是位置变化会严重影响灌流质量，有时会因为器械位置的变动直接将心脏牵扯下来导致灌流失败，应给与充分注意）3.动物灌流：C57小鼠25-30g左右，灌流开始，可见右心耳充盈，用剪刀剪开，便于血液流出：吊瓶灌流——以生理盐水50-100ml快速冲洗血液，持续最好不要超过5min（时间过长会导致脑组织降解），待无明显血迹流出后换用4%多聚甲醛进行灌流，约100-150ml，灌流速度不宜过快，约10min，固定液较充分的固定组织；注射器灌流——生理盐水50ml快速推注，后换用4%多聚甲醛50ml缓慢推注。
灌流成功的标志——灌流开始，可见肝脏颜色迅速变浅，随着灌流进行，肝脏颜色逐渐变为乳黄色或是白色；换用4%多甲固定液后小鼠全身痉挛抽搐，组织僵硬。
4.开颅取脑：根据实验取材位置的不同，分为不同的取脑方式：应注意需要的组织区域，避免取脑过程中损坏，多从小脑后方依次向前剥离颅骨，获取脑组织（在颅骨剥开后，应注意脑膜的存在，因为会发生脑膜将皮层割裂损伤的情况）5.脑组织修块：将多余脑组织去除，便于固定充分均匀，应留出试刀或找平的部分多余组织（本人实验中因需要海马组织，故修块时沿大脑皮层后边缘切除多余小脑，人字缝前约2.5-3mm切除前脑部分）6.固定过夜：将修块完成的脑组织，浸泡于4%多聚甲醛中，固定过夜，通常不要超过18小时（固定时间越长，组织抗原损失越严重，呈数量级损失），一般控制在12小时以内为宜二、组织石蜡包埋7.组织梯度脱水透明：将过夜固定的脑组织取出置于包埋窗内，并用铅笔做好相应标记，自来水流水冲洗约10min，去除残留的杂质成分，进行梯度酒精脱水（注意：不同的组织类型，同组织类型不同组织块大小所需的每阶段脱水时间不同，需根据自身需要进行简单摸索；若盲目脱水透明，脱水透明过头，会使组织脆性增加，切片时全为粉末状，无法成形；脱水透明不够，会使组织与蜡块分离，无法获取平整组织切片）本实验中，组织样本为脑组织，组织修块后所进行的脱水流程如下：自来水冲洗完成→50%乙醇 25min→70%乙醇 25min→80%乙醇 25min→90%乙醇 25min →95%乙醇I 10min→95%乙醇II 15min→无水乙醇I 10min→无水乙醇II 15min→二甲苯I 15min→二甲苯II 15min8.组织浸蜡：在进行二甲苯透明开始的时候，将石蜡用沸水融化，置于60度烘箱内备用（此过程中应注意将盛放石蜡的烧杯上口封闭，避免水分溅入；根据组织块的数目准备合适体积的石蜡液体，以组织块完全浸没其中为宜）；将透明完成的组织块，尽量沥干多余二甲苯，迅速转入1号烧杯的石蜡液体内（避免包埋窗内产生气泡，气泡若围绕组织块会影响浸蜡过程），依次将所有组织块迅速转入其中，要求组织块要全部浸没在石蜡中，流程如下：1号石蜡2h→2号石蜡2h→3号石蜡2h在每个阶段的浸蜡过程中，可根据时间安排适量的延长浸蜡时间，但尽量不要减少时间9.组织块包埋：包埋前，准备沸水备用；清理干净包埋槽备用；包埋开始时，将装有组织块的烧杯浸入沸水中，防止在包埋过程中，烧杯中的石蜡凝固，具体操作如下：1）用镊子夹取包埋槽在酒精灯预温，控制包埋槽的温度不要过高；2）将烧杯内的石蜡倒入包埋槽内，液面高度刚好没过包埋槽两侧平台3）取出浸泡的组织块，用小镊子过火后夹取组织块放置在包埋槽的凹陷处中心部位，根据切片要求摆放位置，注意在放置过程中避免组织块下面接触包埋槽底部的位置产生气泡，通常在放置前，可将组织块浸没在凹槽内的石蜡中翻滚，使其各面均匀接触石蜡液体，然后放置在正确的位置（此时假如包埋槽预温过高，则会导致组织块在接触槽底面后异常干燥，在整个蜡块凝固后会在干燥处出现凹洞，不利于石蜡块的长期保存）；4）将包埋窗轻轻放置在包埋槽的平台上面，尽量保证两侧高度相同，此时槽内之前的石蜡会浸没部分包埋窗的格栏，静置1-2min（避免倒入热的液体石蜡后，石蜡从包埋窗的边缘流出）；5）静置后，石蜡表面会出现凝固表层，此时再用烧杯中的石蜡填充包埋窗的凹陷处以及靠近边缘的条状凹洞，液面稍高于包埋窗边缘（靠近边缘的条状凹洞一定注意填充石蜡，关乎整个蜡块凝固后与包埋窗结合的紧密程度；石蜡凝固后体积会缩小，避免因液面过低导致的后期包埋窗内部支撑不够）6）静置至少30min，可将包埋后的蜡块从包埋槽内分离（注意分离时，应先清理包埋槽四周的多余石蜡，露出包埋窗与包埋槽接触的边缘，然后从一个角将蜡块撬离包埋槽）三、石蜡切片10.准备工作：蜡块的修整——将组织周边的石蜡在保留操作位置的情况下尽量去除（1-减少石蜡块切面与刀片的接触面积，便于受力均匀，易切出完整切片；2-石蜡切面与刀片接触面积小，会减少刀片接触到蜡块中坚硬杂质的几率，增加刀片的使用寿命；3-接触长度减少，可增加刀片使用次数，通常情况下至少多使用1次）准备器材：40度恒温水浴（温度控制在40-42之间的恒温状态，此温度可使蜡片较长时间保持切片形态，温度较低切片不易展开，温度较高，切片会在短时间内融化，易造成组织变形）切片刀片、包被载玻片、弯镊、毛刷、铅笔、切片盒冰盒（通常情况不需要，在组织脱水透明严重，切片呈粉末状态时，可用冰块冰敷石蜡切面，在短时间内可改善切片表面状态，能够帮助切出3-5片完整切片，只有在前期处理出问题时才使用进行一定程度挽救）切片大致流程：1）安装刀片；将蜡块固定于切片机上，调整蜡块表面与刀片距离，矫正蜡块表面与刀片切线平行；2）调整切片模式为trim-10um进行表面找平，并观察切片状态，调整蜡块角度，使切片左右对称，同时注意观察目标区域出现位置；3）切片调平，并出现合适目标区域，调整切片模式为sect-5um进行切片，获取所需组织切片样本；4）将完整合适的切片，夹取至水浴锅内摊平，左手持载玻片，右手持弯镊辅助，将切片贴于载玻片中，放置在水浴锅边缘进行干燥并做好相应标记；5）将干燥完成切片，按照样本分类放置在一起收于切片盒中备用6）切片完成，清理清片机；剩余组织蜡块，需要在切面表面均匀涂抹融化的石蜡，避免组织块直接与空气接触（不进行封闭，会使组织块在长期的暴露过程中，含水量发生变化，易于与支撑蜡块分离，造成后续再次切片困难）7）切片盒中切片，干燥后可在室温下长期放置，推荐切片完成后及时进行后期组织染色或组织免疫化学孵育。
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤1 直接免疫荧光法的操作步骤标本的处理：石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次;• 2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min•抗体染色：C孵育30min；︒–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1：8或1：16稀释）,放在湿盒中，37• 0.0lmol/L PBS（pH 7。
4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。
•缓冲甘油封片–分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2,0。
2M碳酸盐缓冲液1份配制。
•镜检：在荧光显微镜下观察。
•优点:方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
•缺点：敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体.若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。
直接免疫荧光法的注意事项μ•对荧光标记的抗体的稀释:要保证抗体的蛋白有一定的浓度；•一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
•染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；–染色时间：从10 min到数小时，一般30 min；C的低温，延长染色时间。
︒C可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0—2︒C)，高于37︒–染色温度:多采用室温(25C 30 min效果好的多。
︒–低温染色过夜较37•试验时需设置下列对照:–自发荧光对照(空白对照)：标本加0。
01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。
–阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
–特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体.•若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
•一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；•经荧光染色的标本最好在当天观察,随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案
石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案石蜡标本固定、脱水、包埋方法大鼠自心脏灌注4%多聚甲醛内固定1-2h后取材：取脑出血血肿处脑组织（厚度约3mm），置于塑料盒中并浸泡在4%多聚甲醛中固定，室温中固定时间12-48h，固定好的组织脱水前应流水冲洗30min-1h左右除去固定液，取固定好的脑组织标本脱水、包埋。
具体步骤按以下方法进行：此方法参考《组织病理学技术》周庚寅北京大学出版社 2006年⏹70%： 1h-2h⏹80%： 1h-2h⏹90%： 1h-2h⏹95%： 1h-2h⏹95%： 1h-2h⏹无水Ⅰ：30min-60min⏹无水Ⅱ：30min-60min⏹二甲苯及水水酒精 1：1混合液 30min⏹二甲苯Ⅰ：30min⏹二甲苯Ⅱ：30min⏹石蜡Ⅰ： 1h⏹石蜡Ⅱ： 1h⏹石蜡Ⅲ： 1h包埋：在病理科包埋方法基础上灵活改进：在包埋铁模具上进行，融蜡-放置组织于中央-扣包埋盒4℃冷却10min-撬蜡。
注意事项：1、固定液的种类：10%中性甲醛，4%的多聚甲醛最合适，在37°或室温中固定12-48h能很好保存抗原和抗体的反应能力，实验室用的更多的是在4℃冰箱中固定24h-3d。
有人建议中性甲醛40摄氏度固定2~3小时，流水冲洗20min-30min，这样可以缩短制片的时间。
2、熔蜡温度65 ℃左右；3、严格按照预定实验步骤进行，保证脱水及透明完全，透明后见云雾状说明脱水不完全，需退回无水酒精中返工。
4、经一级二甲苯透明后检查组织是否透明，二级二甲苯透明时间以具体时间而定。
5、注意及时更换梯度酒精及二甲苯（1月）。
组织石蜡切片摘自《免疫组织化学实验技术及应用》 P12 化学工业出版社20061.载玻片的处理：采用现成的APES处理过的硅化载玻片。
2.石蜡切片注意事项：1、用于免疫组化的蜡温应为56~58℃，切片水温为40℃左右，应先置于冷水中（冷水中可参入酒精有利快速展片-见相关方法），然后再移入热水中，这样可以使切片顺利展平；2、烤片时要注意：一般在62℃烤片30-60min，抗原较强的组织可在60摄氏度烤3~8h，抗原较弱的组织可于37℃的恒温箱内过夜；3、切片如需长期保存，可置于4℃或室温下，千万不可脱蜡后4℃保存，因脱蜡后失去了对抗原决定族的保护。
石蜡切片免疫组化染色步骤 -回复
石蜡切片免疫组化染色步骤-回复石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于检测组织中特定蛋白质的表达和定位。
通过特定抗体的结合，可以在组织切片上形成可见的染色反应，从而了解细胞分布、形态和功能。
本文将一步一步介绍石蜡切片免疫组化染色的详细步骤。
第一步：取材固定首先，需要取得要进行免疫组化染色的组织样本。
可以是新鲜组织，也可以是经过福尔马林或其他适当的固定剂固定后的组织。
固定的目的是固定细胞内蛋白质的结构，以保持其形态和抗原性。
固定过程中要避免产生过度固定，否则可能会破坏细胞结构和抗原的特异性。
第二步：组织脱水和浸渍将固定好的组织样本进行脱水和浸渍。
脱水的目的是去除组织中的水分，使其能够与石蜡充分相溶。
浸渍的目的是使组织均匀地吸收石蜡，以便切片时组织能够坚固并保持形态。
一般的脱水和浸渍步骤包括用不同浓度的酒精进行脱水，然后使用清洁剂和石蜡浸渍组织。
第三步：包埋和切片经过浸渍的组织样本需要进行包埋，以保持其形态和结构。
将组织样本放置在浸渍好的石蜡中，使其充分浸透，然后将其放置在冰上使石蜡固化。
固化后的组织样本可以用切片机切成非常薄的切片，通常是4-6μm。
切片质量对于后续的免疫组化染色非常重要，所以要确保切片的平整和完整。
第四步：切片除蜡和重现组织抗原切片除蜡是为了去除包埋后留在组织切片上的石蜡，以便进行后续的染色。
一般使用酮或甲醇进行除蜡，然后通过多次水洗将组织切片充分清洗。
重现组织抗原则是为了使切片上的抗原能够被抗体检测到。
根据抗原的性质和检测的目的，可以选择适当的方法进行重现组织抗原，如酶解、蛋白酶解或热诱导抗原修复等。
第五步：抗体孵育将免疫组化染色所需的一抗加在切片上，与切片中的特定抗原发生特异性结合。
孵育时间和温度根据抗体的性质和抗原的稳定性来确定，一般在室温下孵育数小时或过夜。
抗体孵育结束后，使用缓冲液或PBS洗涤切片，以去除未结合的抗体。
第六步：二抗孵育和信号检测在一抗的基础上，可以使用与一抗来源不同物种的二抗来进行信号放大。
石蜡切片免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫荧光染色方法1.组织固定将待染的组织标本取出，用生理盐水或磷酸盐缓冲液进行冲洗，以去除血液和其他污染物。
然后用组织固定剂（如4%的多聚甲醛）进行固定，时间一般为12-24小时。
固定后，将组织转移到30%蔗糖缓冲液中，保持在4°C下过夜。
2.组织包埋将固定后的组织进行脱水和透明化处理。
首先用70%乙醇进行脱水，然后使用95%和100%的乙醇进行脱水，每个浓度的乙醇浸泡时间为30分钟。
接下来，用细胞脱水剂（如xylene）进行透明化处理，每次浸泡30分钟。
最后，将组织置于石蜡中，使其逐渐浸透，浸泡时间一般为12-24小时。
3.组织切片将石蜡浸透的组织取出，固定在切片架上。
使用旋转切片机将组织切成5-10微米厚的切片。
切好的切片用除去石蜡的溶剂（如xylene）处理，然后通过悬浮在磷酸盐缓冲液中移至玻璃切片上。
4.抗原修复在切片上涂抹抗原修复液，将其加热至适当温度进行修复，以恢复组织中的抗原活性。
不同的修复条件适用于不同的抗原修复液，一般修复温度为95°C，时间为20-30分钟。
修复后，将切片用磷酸盐缓冲液冲洗数次。
5.抗体染色在切片上涂抹首要抗体（抗体与所要检测的抗原有特异性结合）。
将切片置于湿润箱中，室温孵育1小时，或在4°C下孵育过夜。
然后，用PBS缓冲液冲洗切片，以去除未结合的抗体。
接下来，涂抹荧光标记的二抗（与首要抗体结合的二抗），并孵育30分钟。
6.荧光显微镜观察将切片加装到玻璃片上，并用适当的荧光封装剂封盖。
使用荧光显微镜观察切片，观察和记录荧光信号和组织结构。
注意事项：1.在操作过程中，要严格避免组织检测和悬浮液受到光照。
2.切片机和刀片必须保持清洁和尖锐，以确保切片的质量。
3.在染色过程中，要注意温度和时间的控制，以保证染色效果。
4.切片和显微镜观察时，要确保显微镜的光源和滤光片与所使用的荧光标记相匹配。
5.进行染色之前，要检查抗体的适用性和浓度，以确保染色结果的准确性和可靠性。
免疫组化法和免疫荧光染色法的区别
免疫组化法和免疫荧光染色法是生物医学领域常用的实验技术，它们在细胞和组织的研究中扮演着重要的角色。
虽然它们都是用于检测特定蛋白在生物样本中的表达情况，但在操作方法、原理和应用范围上却有着明显的区别。
在本文中，我将深入探讨这两种技术的区别，并就其在生物医学研究中的应用进行全面评估，以期帮助读者更深入地理解并灵活运用这两种技术。
1. 免疫组化法免疫组化法是一种用于检测组织或细胞中特定蛋白表达的技术。
它的操作流程大致包括取材、固定、脱水、包埋、切片、脱蜡、抗原修复、蛋白质检测、染色和显微镜观察等步骤。
在实验过程中，首先需要将样本切片，并通过特定的固定、脱水和包埋步骤将其固定在载玻片上。
随后，利用抗原修复方法还原蛋白的空间结构，以便后续的免疫染色。
接下来，通过加入特定的抗体和标记物，可以对目标蛋白进行特异性染色，并最终通过显微镜观察蛋白在组织或细胞中的表达情况。
2. 免疫荧光染色法免疫荧光染色法是利用特定抗体与荧光染料结合，通过检测荧光信号的方式来标记和检测生物样本中的特定蛋白表达。
它的操作流程也包括取材、固定、脱水、包埋、切片等步骤，与免疫组化法的操作步骤较为类似。
不同的是，在免疫荧光染色法中，需要利用特定的荧光标记的二抗或荧光素-抗素进行染色，通过激光共聚焦显微镜等设备观察样本中荧光的分布情况，从而检测目标蛋白的表达位置和水平。
在应用范围方面，免疫组化法主要用于研究组织切片或细胞样本中特定蛋白的表达情况，可以定量地评估蛋白的表达水平和分布情况，适用于体内和体外实验样本。
而免疫荧光染色法由于其高灵敏度和高分辨率的特点，适用于细胞共聚焦显微镜观察，可以用于检测细胞中蛋白的定位、表达和相互作用等，是细胞生物学和免疫学研究中常用的技术手段。
在本文中，我主要介绍了免疫组化法和免疫荧光染色法的操作原理、步骤和应用范围，并就其在生物医学研究中的应用进行了全面评估。
通过对这两种技术的深入了解，我们可以更好地选择合适的技术手段，并在实验设计和结果分析中更加灵活地运用这些技术来开展生物医学研究。
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤1 直接免疫荧光法的操作步骤标本的处理：石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次；•2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min•抗体染色：C孵育30min；–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37•0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。
•缓冲甘油封片–分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。
•镜检：在荧光显微镜下观察。
•优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
•缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。
直接免疫荧光法的注意事项•对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度；•一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
•染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；–染色时间：从10 min到数小时，一般30 min；C的低温，延长染色时间。
C可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2C)，高于37–染色温度：多采用室温(25C 30 min效果好的多。
–低温染色过夜较37•试验时需设置下列对照：–自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。
–阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
–特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
•若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
•一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；•经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
石蜡切片免疫组化染色步骤
加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游 离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分 离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测 F/P 比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用 20%磺基水杨酸测定 蛋白（发生沉淀反应） ，继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来， 至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。 若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类， 可先在过 柱前透析一夜， 否则， NH4+太浓， 在蛋白未完全洗脱时即出现 NH4+， 因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集， 之后出现 SO4++ （用 1%BaCl2 检查发生白色沉淀） 。 最后是 NH4+， （用 纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀） ，待洗脱液无 SO4++及 NH4+后可再用。 如仅用小量荧光抗体， 可用 1×20cm 的柱层析柱， 取 2g Sephadex G-50 装柱，即可过滤 2～3.5ml 荧光抗体。 （四）DEAE 纤维素柱层析法 标记过多或过少荧光素的抗体分子可用 DEAE-纤维素柱层析法除 去。方法如下： DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯 IgG 方法相同。 装柱所需 DEAE-纤维素量以干重每克交换 20～50mg 标记蛋白量为宜。 常用梯度洗脱法如下： （1）层析柱用 0.01mol/L、pH7.2PB 平衡，标记物上柱后，先用 0.01mol/L、pH7.2PB 洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据 床体积大小每梯度乘 3） ，然后依下列各种离子强度洗脱液，分别洗
免疫组化法和免疫荧光染色法的区别
免疫组化法和免疫荧光染色法的区别免疫组化法和免疫荧光染色法是生物医学研究中常用的实验技术方法。
它们都是通过利用抗体与目标抗原的特异性结合来检测和定位特定蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
尽管它们的目的相似，但在具体实验步骤、原理和应用方面存在一些差异。
本文将对免疫组化法和免疫荧光染色法的区别进行详细阐述，以帮助读者更好地理解这两种常见实验技术。
一、实验步骤和原理1.免疫组化法：免疫组化法是一种通过使用抗原与特异性抗体相结合的技术，将抗体标记物（一般为酶）转化为可见信号，并用于检测和分析目标分子在细胞或组织中的表达情况。
其步骤包括抗原取样、固定、脱水、透明化、抗原恢复、阻断、抗体结合、洗涤、二抗结合、再次洗涤和显色等。
2.免疫荧光染色法：免疫荧光染色法是利用荧光标记的抗体来检测和定位目标抗原的一种技术。
其步骤包括抗原取样、固定、脱水、透明化、抗原恢复、阻断、抗体结合、洗涤、二抗结合和荧光染色等。
从实验步骤和原理上看，免疫组化法和免疫荧光染色法在很多方面是相似的。
它们都需要进行对抗原的取样和固定等预处理步骤，以及对目标抗原的特异性抗体进行结合。
然而，主要的区别在于信号检测和可见性。
免疫组化法使用酶标记物并在显色反应中产生可见的染色物质，而免疫荧光染色法则通过荧光标记的抗体在荧光显微镜下进行直接可视化。
二、应用领域1.免疫组化法：免疫组化法广泛应用于细胞生物学和组织学研究中，常用的应用领域包括但不限于肿瘤标记、蛋白质表达和定位、细胞内分子信号通路等。
2.免疫荧光染色法：免疫荧光染色法在细胞和组织研究中具有重要作用。
它常用于细胞活力检测、细胞分子定位、免疫分型、细胞凋亡检测等。
免疫组化法更适合定性分析和形态学研究，而免疫荧光染色法则更适合定量分析和定位研究。
在实际应用中，研究者可以根据自己的研究目的选择合适的方法，或者根据具体需求结合两种方法进行分析。
三、我的个人观点和理解免疫组化法和免疫荧光染色法作为两种常见的免疫化学实验技术，都在生物医学研究领域发挥着重要的作用。
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类
免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类1、免疫标记法及其分类1）荧光免疫法：原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2）放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3）酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L 板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug／L。
夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
组织切片免疫荧光染色的具体步骤
组织切片免疫荧光染色的具体步骤1 直接免疫荧光法的操作步骤标本的处理：石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，进行抗原修复，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次；• 2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min•抗体染色：C孵育30min；︒–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释)，放在湿盒中，37• 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。
•缓冲甘油封片–分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。
•镜检：在荧光显微镜下观察。
•优点：方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。
•缺点：敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。
若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。
直接免疫荧光法的注意事项μ•对荧光标记的抗体的稀释：要保证抗体的蛋白有一定的浓度；•一般稀释度不应超过1:20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。
•染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化；–染色时间：从10 min到数小时，一般30 min；C的低温，延长染色时间。
︒C可加强染色效果，但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2︒C)，高于37︒–染色温度：多采用室温(25C 30 min效果好的多。
︒–低温染色过夜较37•试验时需设置下列对照：–自发荧光对照(空白对照)：标本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。
–阳性对照：用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
–特异性对照(抑制试验)：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。
•若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。
•一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；•经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
石蜡切片免疫荧光染色方法
对于石蜡切片：1、烤片：60℃ 60分钟2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟→蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。
3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入l柠檬酸钠，(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。
修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。
2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H2O22(2ml H2O22加入18ml蒸馏水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。
（也可不用去除内源性酶）。
3. 封闭(Blocking)加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。
如果背景较高，可以4℃封闭过夜。
不用洗，用滤纸吸干周边水分。
从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。
4. 一抗孵育(Primary antibody incubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。
立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。
PBS洗3次，每次5分钟。
5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)按照适当比例用稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
PBS洗涤3次。
每次5分钟。
如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6. 蛋白检测(Detection of proteins)对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。
7. 复染用DAPI对细胞核进行染色，室温10分钟，PBS冲洗5分钟×3次，封片（封片剂或分析纯的甘油与碳酸缓冲液1：1混合）显微镜观察，染色后为蓝色荧光。
免疫荧光技术：染色方法
免疫荧光技术：染色方法（一）制片选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。
用时取出用绸布擦净。
将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。
也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。
（二）固定除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。
固定的作用有三：①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。
标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。
（三）水洗固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。
（四）染色染色分直接染色法与间接染色法。
1．材料与试剂（1）荧光抗体，稀释至应用浓度。
（2）0.01Mol/L pH7.4PBS液（3）9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。
甘油有减少非特异性荧光的作用。
（4）带盖方盘2．直接染色法（1）将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖，37℃感做30 min～45min。
（2）PBS冲洗3次，每次冲洗3min，即3×3ˊ冲洗。
（3）蒸馏水冲洗。
（4）滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。
2．间接染色法（1）检查抗原：①取固定标本，加已知的免疫血清，37℃孵育30min；②以PBS 液3×3ˊ冲洗；③再加荧光标记的抗抗体，37℃孵育30min；④PBS 3×3ˊ冲洗；⑤H2O冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。
检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，甲醇固定；②滴加相应抗原液（按1﹕100～1﹕500稀释），37℃孵育30min；③PBS液3×3ˊ冲洗；④加荧光抗体，37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ冲洗；⑥水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。
最新石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法整理
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法1、组织的采集、固定和保存：采取组织后，方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年tesis）PBS缓冲液洗三次，每次5min，4C保存于70%乙醇中。
2、组织的包埋、切片、展片及保存：：固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10m，贴于处理过的干净载玻片上，37C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。
石蜡包埋：保存于4C 70%乙醇中的组织样品80%乙醇15 min95%乙醇15 min100%乙醇15min 21/2乙醇1/2二甲苯15 min二甲苯透明5-10 min1/2二甲苯1/2石蜡30 min石蜡（1） 1.5hr石蜡（2） 1.5-2.5hr石蜡（3）包埋RT保存3、石蜡组织切片的免疫组化方法：密封保存于RT的组织切片二甲苯(1) 20 min二甲苯(2) 20 min100%乙醇20min95%乙醇10 min80%乙醇10 min通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈切片在PBS中浸泡 5 min*20.4%Tritonx RT 10 min切片在PBS中浸泡 5 min*33%H2O2 RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*30.25%胰酶RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*3Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min倾去blocking buffer，勿洗一抗4C overnight in blocking buffer取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h切片在PBS中浸泡 5 min*3DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）如果是增强型DAB只要1min即可。
免疫荧光染色步骤
免疫组织化学染色步骤1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ10min）、入水（100%酒精Ⅰ5min→100%酒精Ⅱ3min→95%酒精2min→80%酒精1min→70%酒精1min），蒸馏水冲洗后，0.01M PBS冲洗，5min×3次；2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15min，自然冷却至室温，0.01M PBS冲洗，5min×3次；3．3%H2O2溶液，37℃，20 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M PBS 冲洗，5min×3次；4．正常羊血清封闭，37℃，30 min；5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M PBS冲洗，5min×3次；6．滴加二抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；7．滴加三抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；8．DAB避光显色，显微镜下控制显色时间；9．0.01M PBS终止显色；10．梯度酒精脱水（70%酒精1min→80%酒精1min→95%酒精Ⅰ1min→95%酒精Ⅱ1min→无水酒精Ⅰ10min→无水酒精Ⅱ10min），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15min →二甲苯Ⅱ10min；11．中性树胶封片。
免疫荧光染色步骤(1)将组织切片脱蜡入水；(2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15min，自然冷却至室温；(3)正常羊血清封闭，37℃，60 min；(4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，PBS冲洗，5min×3次；(5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；(6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。
(7)荧光显微镜观察拍照。
细胞免疫组化染色（培养板中染色）1．培养的细胞，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法1、组织的采集、固定和保存：采取组织后，方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4?C固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜方法二：采用bouin’s固定RT2h（6-8dtesis）orRT过夜（成年tesis）PBS缓冲液洗三次，每次5min，4?C保存于70%乙醇中。
2、组织的包埋、切片、展片及保存：：固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54?C石蜡包埋，常规切片，切片厚4-10?m，贴于处理过的干净载玻片上，37?C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。
石蜡包埋：保存于4?C70%乙醇中的组织样品?80%乙醇15min?95%乙醇15min?100%乙醇15min?2?1/2乙醇1/2二甲苯15min?二甲苯透明5-10min?1/2二甲苯1/2石蜡30min?石蜡（1）?石蜡（2）石蜡（3）包埋?RT保存3、石蜡组织切片的免疫组化方法：密封保存于RT的组织切片?二甲苯(1)20min?二甲苯(2)20min?100%乙醇20min?95%乙醇10min?80%乙醇10min?通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈?切片在PBS中浸泡5min*2?%TritonxRT10min?切片在PBS中浸泡5min*33%H2O2RT10min切片在PBS中浸泡5min*3%胰酶RT10min切片在PBS中浸泡5min*3Blockingbuffer(3%BSA+5%NGS+%Tritonx-100inPBS)RT60min倾去blockingbuffer，勿洗一抗4?Covernightinblockingbuffer取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡5min*3二抗inblockingbufferGAR1：200（GAM1：100），RT1h切片在PBS中浸泡5min*3DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）如果是增强型DAB只要1min即可。
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石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
1、组织的采集、固定和保存：
采取组织后，
方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4?C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜
方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年tesis）
PBS缓冲液洗三次，每次5min，4?C保存于70%乙醇中。
2、组织的包埋、切片、展片及保存：：
固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54?C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10?m，贴于处理过的干净载玻片上，37?C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。
石蜡包埋：
保存于4?C 70%乙醇中的组织样品
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80%乙醇15 min
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95%乙醇15 min
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100%乙醇15min ? 2
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1/2乙醇1/2二甲苯15 min
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二甲苯透明5-10 min
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1/2二甲苯1/2石蜡30 min
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石蜡（1） 1.5hr
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石蜡（2） 1.5-2.5hr
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石蜡（3）包埋
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RT保存
3、石蜡组织切片的免疫组化方法：
密封保存于RT的组织切片
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二甲苯(1) 20 min
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二甲苯(2) 20 min
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100%乙醇20min
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95%乙醇10 min
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80%乙醇10 min
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通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈
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切片在PBS中浸泡 5 min*2
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0.4%Tritonx RT 10 min
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切片在PBS中浸泡 5 min*3
3%H2O2 RT 10min
切片在PBS中浸泡 5 min*3
0.25%胰酶RT 10min
切片在PBS中浸泡 5 min*3
Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min
倾去blocking buffer，勿洗
一抗4?C overnight in blocking buffer
取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3
二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h
切片在PBS中浸泡 5 min*3
DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）
如果是增强型DAB只要1min即可。
切片浸入PBS终止显色，HE衬染1s，
玻片架放入泡沫盒，流水冲洗15min，肉眼看到淡淡的紫色即可停止。
若颜色太深，可用0.1-0.5%盐酸乙醇分色1～2秒钟（或更久）
脱水85%乙醇 5 min
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95%乙醇 5 min
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无水乙醇 5 min
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无水乙醇5min
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二甲苯(1) 10min
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二甲苯(2) 10min
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中性树胶封片，室温干燥保存
4、石蜡组织切片的免疫荧光方法：
密封保存于RT的组织切片
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二甲苯(1) 20 min
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二甲苯(2) 20 min
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100%乙醇20min
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95%乙醇10 min
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80%乙醇10 min
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通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈
?
切片在PBS中浸泡 5 min*2
?
0.4%Tritonx RT 10 min
?
切片在PBS中浸泡 5 min*3
切片在PBS中浸泡 5 min*3
0.25%胰酶RT 10min
切片在PBS中浸泡 5 min*3
Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min 倾去blocking buffer，勿洗
一抗4?C overnight in blocking buffer
取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3
荧光二抗in blocking buffer GAR-cy3 1：1000，GAM-488 1：1000RT 1h DAPI（1：1000请根据二抗说明稀释二抗）
切片在PBS中浸泡 5 min*3
moil封片，避光4?C保存。