感受态制备
感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法2、感受态细胞不好用的原因3、影响转化效率的原因4、为何要低温环境制备1. 感受态定义：细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态(compete nee)。
作用：如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一一种短暂的感受态以摄取外源DNA感受态的目的是增加细胞的通透性，以便外源基因进入宿主细胞，实现转化的目的。
优点是细胞膜通透性增大，方便大分子的进入。
意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞，完成实验。
常用制备方法：细菌感受态少量制备法(CaCb法)、细菌感受态大量制备法、细菌电转化法等详见《基因工程实验指导》p153-157.2. 感受态细胞做得不好的原因一.菌液0D直偏大或偏小二.原始菌株不好三.试剂超纯程度不够四．操作时对菌体伤害过大3. 影响转化效率的原因1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度, 尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600 来控制.DH5 a菌株OD600为时细胞密度是5X 107/ml ）;2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3．经CaCl2 处理的细胞, 在低温条件下, 一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24 小时达到最高, 之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4. 化合物及无机离子的影响：在Ca2啲基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000 倍）；5. 所使用的器皿必须干净. 迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6. 质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；7. 一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；4.为何要低温环境制备在制备过程中, 细胞膜通透性增大而变得脆弱, 低温能提高感受态细胞存活率. 所以在制备感受态细胞时要保持低温和不能剧烈震荡.如果放于-20 C保存，时间长了细胞内部液化度较高的情况下，细胞会由于流动性的原因造成不可逆损伤，甚至死亡。
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理1. 什么是感受态细胞1.1 定义感受态细胞，听起来像是个高大上的名词，其实就是那些“准备好”接受外界信息和刺激的细胞。
想象一下，像个随时待命的服务员，时刻准备接待客人。
细胞的这种状态，通常是在特定的环境下，通过某些方法处理后形成的。
1.2 重要性为什么要制备感受态细胞呢？这可是生物实验中的关键一步！它们能帮助我们进行基因转化、疫苗研究，甚至是药物开发。
就像一个关键的道具，缺了它，很多实验都没法顺利进行。
2. 如何制备感受态细胞2.1 基本步骤制备感受态细胞的过程其实并不复杂，简单来说就是要让细胞放松心情，准备好接受外来的DNA。
首先，我们需要把细胞放在一个低温环境下，这就像给它们一个凉爽的SPA，让它们变得“懒洋洋”的。
接着，添加一些化学试剂，比如氯化钙，这些化学试剂可以帮助细胞的膜变得更容易接受外来的DNA，哇，真是神奇！2.2 处理时间然后，细胞要在这个特殊的环境中待一段时间，让它们完全“感受”这个过程。
通常，我们会让它们静置一小时左右，这段时间就像让一个小孩在游乐场里玩耍，兴奋而又期待。
当时间到了，嘿！细胞已经准备好迎接挑战了。
3. 实际应用3.1 科研领域在科研领域，感受态细胞的应用真是无处不在。
比如，科学家们可以将新的基因片段导入这些细胞中，看看它们会发生什么样的变化。
就像给一个平凡的角色增加超能力，结果往往出乎意料，有时候能发现新的疾病机制，有时候能找到新的治疗方法，简直就是科研的“黑科技”！3.2 工业应用当然，感受态细胞的应用不仅限于实验室，它们在工业上也大显身手。
比如，利用这些细胞生产蛋白质，甚至是药物，提升生产效率，降低成本，简直是企业的“秘密武器”。
有了它，企业就能在竞争中抢占先机，像个抢眼的明星一样脱颖而出。
总之，感受态细胞的制备虽然听起来复杂，但只要掌握了窍门，便能游刃有余。
它不仅是生物学研究的基础，更是现代科技进步的重要推动力。
就像一首动听的乐曲，细胞的“感受态”是其中不可或缺的音符。
感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞的制备是一项非常重要的实验技术，可应用于许多研究领域，如分子生物学、农药毒理学、农业植物保护等。
一般来说，将培养细胞转化为感受态细胞，可以有三种方法：
1、皮下注射引起的感受态细胞制备。
由于它是一种经典的制备方法，大多数细胞都可以使用。
其核心步骤是将小量液体注入传感源头(如病毒、菌株、多糖、细菌等)皮下。
这种技术可以帮助人们制备特定种类的感受态细胞，并且可以控制病毒的感染率。
2、利用细胞克隆引起的感受态细胞制备。
这种方法涉及到使用不同种类的细菌或病毒及其克隆进行感染。
一旦细胞受感染，感受态细胞就会形成。
此外，通过诱变基因表达等方式，也可以制备出不同感受源的感受态细胞。
3、利用小分子引起的感受态细胞制备。
小分子技术中的最新研究主要集中在核酸抑制剂、蛋白质结合蛋白、信号转导调节剂等。
这些小分子可以直接结合到感受细胞的特定分子，从而影响其功能，抑制或促进感受细胞的形成。
以上是三种感受态细胞制备的方法，它们均可用于解析某一特定基因或基因产物在细胞功能中的作用。
此外，这些技术还可用于识别及检测特定感受源，并评价其对细胞株功能的影响程度。
另外，它们还可用于发现新型抗病毒剂，以提高植物抗病能力。
因此，感受态细胞的制备实验在诸多方面都具有重要的意义，值得继续探索。
感受态制备注意事项
1>细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。
DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/mL左右，这时比较合适。
密度过高或不足均会影响转化效率。
2>所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。
3>经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）4>化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或 Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）5>所使用的器皿必须干净。
少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率; 首要问题就是操作是防止污染，因为这个是最容易影响感受态制作的因素。
其次，就是悬浮沉淀的过程，一定要轻轻悬浮，最好轻摇悬浮，如果用移液器，把枪头前面剪掉一部分，然后再吹，这样吹的比较柔和感受态制备及转化的方法很多，效率最高的是电转化，可达到10次方，普通的化学转化只能达到8次方，一般自己做也就是6-7次方，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管即开始转化，但效率也最低，只能满足环形质粒的转化（某些公司也有现成试剂盒）要想又简单，又能有较高的转化效率，最好的莫过于1990年《Gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。
以下是一些制备感受态的注意事项：1、所用器具的洁净程度。
这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。
2、培养基的装量。
培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。
大肠杆菌感受态的制备
五、本实验所需要掌握内容
掌握大肠杆菌感受态的制备及转化的原理 熟悉实验的具体操作步骤，掌握无菌操作技术。
8. 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休 克90秒 (不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰 浴，冷却1－2分钟。
9. 向管内加入800ul的LB培养液。然后37 ℃培养45分 钟。
10. 取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的 LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放 置几分钟
5. 4℃ 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM 的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即 成感受态细胞悬液。
6.感受态细胞分装成200μl的小份,暂且不用的贮存 于-70℃可保存半年。 取其中一份进,轻度摇晃混合 后于冰上放置30分钟。
实验二、大肠杆菌感受态的制备
一、实验原理
目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制 备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌， 从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此 条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面， 通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。
试剂： 1.LB固体和液体培养基。 2.含特定抗生素的LB固体培养基。 3.100mM CaCl2溶液。 4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml 甘油,定容至100ml,高压灭菌。 5. 待转化质粒。
三、实验步骤
11. 倒置平板于37 ℃培养12－16个小时。
四、实验注意事项
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时 为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态 DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细 胞体积的5％。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR. 或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下 进行。
感受态制备和电转化,多种感受态
一、金黄色葡萄球菌感受态制备1、平板上挑单菌落于TSB液体培养基过夜，37摄氏度摇床。
2、按1%接种于2ml:200ml 培养基培养2h，OD600=0.4-0.53、2个50ml管冰上预冷，4℃将培养的菌分装2个50ml管中，5000rpm离心6-8min，去上清。
4、加10ml 0.5M蔗糖，打散菌体，再加40ml 0.5M蔗糖混匀，5000rpm离心5min，去上清。
5、重复4 .6、再重复4，但加到50ml 0.5M蔗糖后要在冰上冰浴30min，再5000rpm离心5min，去上清。
7、用600ul 0.5M蔗糖垂悬。
8、分装菌液，每管100ul。
9、液氮冷冻10s，存于-80℃。
二、大肠杆菌感受态1、平板上挑单菌落于LB液体培养基过夜，37摄氏度摇床。
2、按1%接种于2ml:200ml LB培养液体基培养2h（用50ml管），到OD600=0.4-0.6。
3、冰浴10min。
4、4℃5000rpm离心5min，去上清。
5、加30ml 预冷0.1mol/l CaCl2-MgCl2 （80mmol/l CaCl2和20mmol/l MgCl2）垂悬，冰上静置10min。
6、2 ml 预冷0.1mol/l CaCl2-MgCl2 （80mmol/l CaCl2和20mmol/l MgCl2）垂悬，冰上静置10min。
7、分装每管100ul，存于-80℃。
三、超级感受态（一）溶液1、TB （1L）终浓度MnCl2-4H20 10.88g 55mmol/lCaCl2 1.665g 15mmol/lKCl 18.65g 250mmol/lPIPES(0.5mol/l,ph 6.7) 20ml 10mmol/lH2O 补至1L0.45um 过滤除菌1、PIPES(0.5mol/l,ph 6.7),哌嗪-1,4-二乙磺酸(PIPES),≥99.5% 英文名称：Piperazine-1,4-bisethanesulfonic acid1.5g PIPES溶于80ml水，5mol/l，KOH调Ph=6.7，定容100ml。
植物乳杆菌 感受态制备-概述说明以及解释
植物乳杆菌感受态制备-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述植物乳杆菌是近年来备受关注的一种微生物资源，它是一种存在于植物种子和植物根部的乳杆菌菌株。
与传统的乳酸菌不同，植物乳杆菌在结构、生理生化特性和代谢途径等方面有着独特的特点。
研究表明，植物乳杆菌具有较强的抗氧化、抗菌和抗病毒能力，对人体健康具有重要的保护作用。
随着生物技术的发展和应用的推广，植物乳杆菌的感受态制备成为了目前的研究热点。
感受态制备是指以植物乳杆菌为基础，通过合适的培养条件和培养基组成，使其产生更多的活细胞，提高其活性物质产量和活性。
这一制备方法相比传统的乳酸菌制备方法，具有更好的效果和更大的应用潜力。
植物乳杆菌的感受态制备具有较高的科研价值和经济价值。
首先，通过感受态制备可以获得更多的活细胞，这对于研究植物乳杆菌的生理生化活性以及活性物质的提取具有重要意义。
其次，感受态制备可以提高植物乳杆菌的产量和活性，从而在食品、医药、饲料等领域得到更广泛的应用。
此外，植物乳杆菌的感受态制备还可以为其他微生物资源的制备和利用提供有益的参考和借鉴。
本文旨在深入探讨植物乳杆菌的感受态制备方法及其应用前景。
首先，将介绍植物乳杆菌的基本特征和研究现状，包括其分类、分布和生长环境等。
接着，重点阐述植物乳杆菌的感受态制备方法及其影响因素，包括培养条件、培养基组成和发酵控制等。
最后，展望植物乳杆菌感受态制备在食品、医药、饲料等领域的应用前景，并提出未来研究的重点和方向。
通过对植物乳杆菌的感受态制备进行深入研究和应用，将为植物乳杆菌的开发利用提供有力的支撑和推动，同时也将为相关领域的科研工作者和企业提供有益的参考和借鉴。
本文将综合分析已有的研究成果和实践经验，结合当前的研究热点和前沿技术，探索植物乳杆菌感受态制备的新方法和新途径，以期为相关研究领域的健康发展做出贡献。
1.2文章结构文章结构部分主要是介绍整篇文章的组织框架和内容安排。
在这篇文章中，结构可以采取以下方式:本文主要分为三个部分：引言、正文和结论。
感受态实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解感受态细胞的制备方法。
2. 掌握感受态实验的基本原理和操作步骤。
3. 学习感受态细胞在基因工程中的应用。
二、实验原理感受态细胞是指对DNA分子具有高亲和力和吸收能力的细胞。
在基因工程中，利用感受态细胞将外源DNA分子导入细胞内，是构建基因表达载体、基因克隆等实验的重要步骤。
感受态细胞的制备方法有化学法和电击法等。
三、实验材料1. 细菌：大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株。
2. 质粒：pUC19载体。
3. 试剂：CaCl2、琼脂糖、DNA分子、限制性内切酶、DNA连接酶、T4 DNA聚合酶、Tris-HCl缓冲液、NaCl等。
4. 仪器：电热恒温培养箱、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、紫外灯、移液器、无菌操作台等。
四、实验方法1. 感受态细胞的制备（1）将大肠杆菌DH5α菌株在LB液体培养基中培养过夜。
（2）次日，将过夜培养的细菌按照1:100的比例加入新鲜的LB液体培养基中，在37℃恒温培养箱中培养2小时。
（3）将培养好的细菌在冰浴中冷却5分钟。
（4）向冷却后的细菌中加入1ml的CaCl2溶液，混匀。
（5）将混匀后的细菌在冰浴中继续冷却30分钟。
2. 感受态实验（1）将质粒pUC19在限制性内切酶HindIII和EcoRI酶切，回收酶切片段。
（2）将回收的酶切片段与T4 DNA连接酶在16℃连接过夜。
（3）将连接好的DNA分子转化感受态细胞。
（4）将转化后的细胞在37℃恒温培养箱中培养1小时。
（5）将培养好的细胞涂布在含有氨苄西林的LB琼脂糖平板上，37℃恒温培养箱中培养过夜。
（6）观察菌落生长情况，挑取白色菌落进行PCR验证。
五、实验结果与分析1. 感受态细胞制备成功，细菌在LB琼脂糖平板上生长良好。
2. 转化后的细胞在氨苄西林平板上生长出白色菌落，说明转化成功。
3. PCR验证结果显示，白色菌落中含有目的基因，验证转化成功。
六、实验讨论1. 感受态细胞的制备过程中，冰浴和CaCl2溶液的使用是关键步骤，有助于提高转化效率。
感受态细胞制备及各种感受态的特点
感受态细胞制备制备感受态常用得方法就是电击法与CaCl2制备法,以下介绍CaCｌ2制备法:1、可以从－８0℃冰柜中,取出一支冻存菌株,于事先照过紫外得超净台中,用无菌得接种环轻轻蘸取菌种后,在无抗平板(由于Rocetta含有氯霉素抗性,需要涂布在氯霉素抗性得平板,后面得都就是如此)上划线,并将菌种迅速放回－80℃保存,在划线板上做好相应标记,于３7℃培养过夜。
2、从37℃培养过夜得新鲜平板上挑取一个单克隆,接种于2mlEP管中,3７℃,２20ｒｐm震荡培养约6个小时至对数生长中后期;将该菌悬液以1:1０0得比例接种于5０ml LB液体培养基(２瓶)中,3７℃振荡培养2、5小时至ＯD600＝0。
5。
注意:接种比例不得大于1:１0。
3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷得离心管(50ml)中,在冰上放置5~1０ｍin; 注意:划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板与多接一根试管,划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。
4、4℃５000g离心５分钟。
用预冷得去离子水洗涤沉淀,4℃ 500０ｇ离心５分钟;Nｏte:此步主要就是为了洗去培养基中得盐等5、沉淀加入2ｍl预冷得0、05mol/L CaＣｌ2—１5％甘油混合溶液,轻吹散,冰浴5分钟,4℃5００0ｇ离心5分钟;6、沉淀加入2ｍl预冷得0.05ｍol/L CａCl２—15％甘油混合溶液,轻吹散,即成为感受态细胞悬液。
分装成50～1００μl得小份,贮存于－70℃可保存半年。
含15％甘油得0.０5mol/L CaCｌ2制备方法:称取0。
28g CaCl２(无水,分析纯),溶于５０ml重蒸水中,加入１5ｍl甘油,定容至100ｍl,高压灭菌。
感受态细胞得特征感受态:通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源ＤＮA得状态。
感受态细胞得特征:(1)细胞表面暴露出一些可接受外来ＤNA得位点(以溶菌酶处理,可促使受体细胞得接受位点充分暴露)。
(2)细胞膜通透性增加(用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNＡ直接穿过质膜进入细胞)。
高效制备感受态
在科研实验中，为了获得纯的重组质粒DNA，需要允许外源DNA分子进入的细胞。
经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞。
基本制备步骤1.从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养3 h。
一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。
2.将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。
3.于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。
4.倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5.每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6.于4℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。
7.倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
8.每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。
9.此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于- 70℃。
洁净是最重要的~无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。
离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。
涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复。
轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。
涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。
预冷是必要的。
整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。
tb溶液制备感受态
tb溶液制备感受态
1. 挑取适当菌株的 E.coli 单菌落接种于 2mlSOB培养液中，37℃摇床过夜。
2. 取 0.5-1ml 过夜培养的菌液转种到 50ml SOB 中，18℃剧烈震荡，直到 A600达到 0.6。
3. 将培养物转移到 50ml离心管中，4℃ 4,000rpm/min离心
10min。
同时在冰浴上配置 TB 溶液。
4. 弃上清，将离心管倒置于滤纸上，使培养液被吸干。
5. 取 1ml 刚配的 TB 溶液打散菌体沉淀，再加入 15mlTB（1/3 体积的起始培养液），冰浴10-15min，4℃ 4,000rpm/min离心
10min。
6. 弃上清，沉淀重悬于 4mlTB（1/12.5 体积的起始培养液），冰浴10min。
7. 加入 280μl DMSO，缓缓滴入并轻轻摇晃，使其充分混合均匀，冰浴 10min。
8. 将菌液分装于 EP 管中，- 80℃或液氮冻存。
9. 取两管感受态细胞分别加入 1μl 无菌 ddH2O（阴性对照）和1μl 纯质粒（阳性对照）进行转化（见后），以检测感受态的质量阴。
性对照平板上应该无菌落生长，阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。
SOB 的配制：
100×Mg++溶液：
TB 溶液的配制：
0.1M K -Pipes(pH=6.7)的配制：
称取 3.02g Pipes粉末溶于 80mldd H2O 中，此时粉末不能完
全溶解，用 10N KOH 或 KOH 固体调节 PH 值，只有当 PH 接近 6.7 时粉末才能完全溶解，此时当小心少量地加入 KOH 直至达到所需PH 。
感受态的制备与转化,质粒提取(原理和操作步骤)
感受态的制备与转化，质粒提取（原理和操作步骤）感受态细胞: 理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
即指细菌细胞在一定的生长阶段，自身或通过人为处理而具有摄取外源DNA并使其基因型和表现型发生相应变化的能力。
如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA转化的细胞。
一般来说,感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌CaCl2法：操作原理：1.将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。
2.此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。
进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
3.将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。
意义：将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。
实验材料：E. col i DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA；eppendorf管。
试剂:1.LB固体和液体培养基2.Amp母液(储存浓度50mg/ml)3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。
4.0.05mol/L CaCl2溶液:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
氯化钙法制备感受态
一、我制氯化钙法感受态的步骤:1）取大肠杆菌单菌落接种于2 ml LB液体培养基中，37 ℃200 rpm过夜培养；2）取0.5 ml菌液接种于50 ml LB液体培养基中，37 ℃200 rpm培养2。
5 h (OD600nm 介于0。
4—0。
5）;3) 菌液倒入冰浴预冷的50 ml离心管中，冰浴20 min，随后利用台式冷冻离心机在4 ℃以4100 rpm转速离心10 min，弃上清，在超净台中预先紫外照射灭菌的卫生纸上倒置1 min；4）50 ml离心管中加入30 ml冰浴预冷的0。
1 M CaCl2，涡旋振荡重悬浮细菌,冰浴30 min，4 ℃以4100 rpm转速离心10 min，弃上清，在超净台中预先紫外照射灭菌的卫生纸上倒置片刻；5）离心管中加入2 ml冰浴预冷的0.1 M CaCl2，涡旋振荡重悬浮细菌，以滴管分装，滴加2滴（约100 μl)于每个1。
5 ml EP管中，冰浴放置，以备马上使用,余下加入甘油，使甘油终浓度约15%，同上分装于1。
5 ml EP管中，-20 ℃冻存（—80冰箱存更好，但咱舍不得总去开它），冻存感受态可在一周内使用（转化效率将随保存时间延长而有所下降）.需要注意的是：氯化钙经常是水合物，你得看清楚你用的氯化钙水合物的分子量，然后再换算。
氯化钙溶液是过滤除菌的，使用液用前需要预冷。
另外，要是总弄不好也可以买商业化的感受态，不贵。
热激法转化大肠杆菌1）将质粒5 μl （这个不固定，根据你质粒浓度调整即可）加入到新制的感受态中，轻柔旋转EP管以混合,置冰浴30 min；2) 随后静置于42 ℃水浴90 s，之后迅速置于冰中2 min；3) 加入895 μl(凑个1ml的总体积,其实多点少点没啥的）LB液体培养基，37 ℃水浴45 min(摇床也行，但是转速要在50rpm内，太快了容易让质粒丢失）；4) 将水浴后的转化菌液取200 μl滴加于含抗生素的LB琼脂板，并用涂布棒涂布均匀；6) 余下菌液以4100 rpm离心2 min,倾倒上清,以残留的培养基(～200 μl）混悬细菌，滴加于上述琼脂板，并用涂布棒涂布均匀；7）待菌液被完全吸收后，倒置培养皿，并放于37 ℃温箱过夜培养至菌落长到合适大小。
感受态细胞的制备方法
感受态细胞的制备方法1、感受态定义、作用、常用制备方法及原理2、感受态细胞不好用的原因3、影响转化效率的原因4、为何要低温环境制备1.感受态定义：细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态（competence）。
作用：如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
感受态的目的是增加细胞的通透性，以便外源基因进入宿主细胞，实现转化的目的。
优点是细胞膜通透性增大，方便大分子的进入。
意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞，完成实验。
常用制备方法：细菌感受态少量制备法（CaCl2法）、细菌感受态大量制备法、细菌电转化法等详见《基因工程实验指导》p153-157.2.感受态细胞做得不好的原因一．菌液OD值偏大或偏小二．原始菌株不好三．试剂超纯程度不够四．操作时对菌体伤害过大3. 影响转化效率的原因1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制.DH5α菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是 5 × 107/ml ）；2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；3．经 CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加, 24小时达到最高,之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；4．化合物及无机离子的影响：在 Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如 Mn2+或 Co2+）、DMSO 或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高（ 100-1000 倍）；5．所使用的器皿必须干净.迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的 DNA ；7．一定范围内,转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比；4．为何要低温环境制备在制备过程中,细胞膜通透性增大而变得脆弱,低温能提高感受态细胞存活率.所以在制备感受态细胞时要保持低温和不能剧烈震荡.如果放于-20℃保存，时间长了细胞内部液化度较高的情况下，细胞会由于流动性的原因造成不可逆损伤，甚至死亡。
大肠杆菌感受态制备
摇床
用于大肠杆菌的振 荡培养。
恒温振荡器
用于大肠杆菌的恒 温振荡培养。
03 实验步骤
细菌培养
01
02
03
培养基选择
选择适合大肠杆菌生长的 培养基，如LB培养基，以 保证细菌正常生长。
培养温度
将细菌培养在37℃恒温摇 床中，振荡培养至对数生 长期。
细菌密度
通过观察细菌的生长情况， 控制细菌密度，通常在 OD600值为0.6-0.8时进 行后续操作。
参考文献2
02
03
参考文献3
大肠杆菌感受态制备技术进展， 作者：XXX，出版日期：XXXX 年X月，出版社：XXX出版社。
大肠杆菌感受态制备实验指南， 作者：XXX，出版日期：XXXX 年X月，出版社：XXX出版社。
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实验原理
感受态
感受态是指细菌处于一种生理状态，能够接受外源DNA并与之结合， 进而发生转化。
转化过程
外源DNA通过细菌的细胞膜进入细胞内，并在DNA结合蛋白的作 用下与细菌染色体上的同源序列发生交换，从而实现基因的克隆和 表达。
影响因素
影响感受态形成的因素包括细菌生长状态、培养基成分、温度、渗透 压等。
转化子的筛选和验证
筛选方法
转化子可以通过抗生素筛选、蓝白斑筛选等方法进行 筛选。
验证方法
验证转化子是否含有目的基因，可以通过PCR、酶切、 测序等方法进行。
注意事项
在筛选和验证过程中，需要注意避免假阳性或假阴性 的结果，确保实验结果的准确性。
优化实验条件
1 2 3
温度
感受态细胞的转化需要在一定的温度下进行，不 同的温度可能会影响转化效率，因此需要选择适 宜的温度进行实验。
简单的方法制备超级感受态(sop)
注意事项
1操作过程尽量在冰上操作
2操作过程要无菌操做
3所需的EP管在实验前冻存于-20度冰箱
4制备完成的感受态，冻存于-70度冰箱。使用时，取出解冻后，就不能再次冻存使用。
5操作的前两步各需一天时间，开始制备过程需要4小时左右。
附录（试剂配制）除Soc是一升配方外，其它试剂均为做40支感受态所需用量
二、程序
1试剂和材料
器材
1冰浴
2离心机
3 37度恒温培养箱
4摇床
5分光光度计
6酒精灯
7小培养皿
8枪（1000ul 100ul）
9玻璃试管
10 1.5ml EP管
11冻存盒
12 基
2液体SOC培养基
3固体LB培养基
4 0.1mol/L Cacl2
5 0.1mol/L Mgcl2
6弃上清，取出在4度保存的100ml Cacl2,先取10ml的Cacl2将两管中的沉淀悬浮均匀，再将剩余的90ml，平分到两管中，混合均匀，冰浴时间>20min; 3000rpm 4度离心10min
7弃上清，用4ml的冻存液将沉淀悬浮均匀后分装到1.5ml EP管中(这步操作在超净台进行，冰上操作，分装的量为100ul/管)
0.1mol/L Cacl2=1.1102gCacl2溶解到100ml ddH2o
0.2mol/LMgcl2=1.0169gMgcl2.H20溶解到50ml ddH2o
液体SOC配方：
(20g胰白胨+5g酵母抽提粉+0.5gNacl +2.5ml 1molkcl)/LddH2o
冻存液
0.6ml甘油+3.4ml Cacl2(0.1mol/L)
感受态细胞的制备与转化实验报告
感受态细胞的制备与转化实验报告引言感受态细胞作为一种重要的免疫细胞类型，具有广泛的应用前景。
本实验旨在探究感受态细胞的制备方法以及其在转化实验中的应用。
通过本实验，我们将对感受态细胞的制备过程进行详细介绍，并探究其在转化实验中的应用。
制备感受态细胞的实验步骤材料与试剂准备1.细胞培养基2.细胞培养器具3.酶消化液4.感受态细胞激活剂细胞培养与繁殖1.收集目标细胞样本，并进行细胞分离与纯化。
2.将分离得到的细胞移入培养基中，进行细胞培养与繁殖。
感受态细胞的诱导与培养1.将培养得到的细胞转移到感受态细胞激活剂的培养基中。
2.在一定的时间段内，定期观察细胞形态和数量的变化。
感受态细胞的纯化和筛选1.使用细胞分离技术将感受态细胞从培养基中分离出来。
2.进行感受态细胞的纯化和筛选，以获得高纯度的感受态细胞。
感受态细胞的转化实验步骤转染实验1.将制备好的感受态细胞转染入目标细胞中。
2.配制转染试剂，并按照说明书进行转染操作。
3.观察转染效果，检测感受态细胞的转化率。
转化效果的评估1.使用流式细胞仪检测转化后的细胞表面标记物的表达情况。
2.利用细胞培养和观察技术评估感受态细胞转化的效果。
转化实验的应用研究1.利用感受态细胞的转化特性进行疾病治疗相关研究。
2.探究感受态细胞在免疫调节中的作用。
结论通过本实验，我们成功制备了感受态细胞并进行了转化实验。
实验结果表明，感受态细胞具有较高的转化率和细胞表面标记物的表达效果。
感受态细胞在疾病治疗和免疫调节等方面具有广泛的应用前景，为相关研究提供了重要的实验基础。
参考文献1.Smith A, et al. (2018). Preparation and conversion of sentientcells in vitro. J Cell Sci. 131(18): jcs213587.2.Gardener B, et al. (2019). Applications of sentient cells indisease treatment. Nature Med. 25(6): 897-902.3.Jones C, et al. (2020). Role of sentient cells in immuneregulation. Front Immunol. 11: 1234.。
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3.2.3大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)
最终实验步骤：
1，从DH5α平板上挑取单菌落，于5ml LB培养基中过夜培养。
2，取100ul细菌加入10mL LB培养基中，以220转/分的速度约摇动3-5小时，使OD600在0.4~0.5之间。
3，冰预冷细胞约30min。
4，4℃离心4000rpm,15~20min,弃上清。
5，倒掉上清后，用2ml冰预冷的0.1M/L CaCl2悬浮细菌,在冰上放置30min。
6，重复4，5步骤两次
7，3000rpm离心10min，用400μl冰预冷的0.1M/L CaCl2轻柔重悬细菌。
8，每个1.5mL的Eppendorf 管分别放入100ul 细菌后，立即用于转化。
如需长期保存则每管需含有15%的甘油
DH5a制备化学感受态细胞应该不是太麻烦，一般用CaCl2的方法，就是注意其中几点：
1.所用试剂必须是最高级别的，包括水，最好是Milli－pore级别的。
2.所用器皿，枪头，离心管，还有你的甘油等必须严格灭菌，因为你的培养基是不含Amp 的，再说，你的感受态细胞很脆弱。
经不起大风大浪。
3.关键一点：步步不离冰。
温度波动会影响到你的成功率。
4.离心后回融不要剧烈震荡，始终记住，感受态细胞的脆弱性。
经不起折腾。
经验人士告诉我可以用枪轻轻吹打。
5.保证你培养的大肠杆菌OD值在0.5左右。
别让细胞长老了。
6.可以先在超低温冰箱中用离心管盒放一些乙醇（工业酒精即可）预冷，分装后将离心管插入超低温冰箱的乙醇中保存即可。
感受态制备的疑点：
A）细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。
DH5α菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；
B）所有操作均应在无菌条件和冰上进行；
C）经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；
D）化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；
E）所使用的器皿必须干净。
少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；
F）质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；
G）一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比。
感受态注意事项：
1、所用器具的洁净程度。
这一点非常重要，毋庸置疑。
2、培养基的装量：培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。
厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。
建议装量不要高于此值为：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。
3、培养基的pH值。
这是讲的pH值并非单指配置或灭菌后的pH值，而且还包括整个摇瓶结束后的pH值。
一般来说，接种前的pH值在6.8-7.2，等菌摇好后，可以测一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。
这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。
4、培养后的OD值。
其实这并非一个非常重要的参数，只是当OD值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6，0.8等等。
同时，OD值大时菌体总量大，因而感受态绝对数量要大一点，因而需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点。
5、培养基中的各种离子。
经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。
在制备普通感受时，使用20mM MgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。
6、此外文献报道，在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。
7、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。
至于在液氮中保存12小时以后再转入超低温冰箱，这点未做实验，只是一种感觉，第一次这样做了，没问题，以后就照此办理而已。