感受态制备

3.2.3大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)

最终实验步骤：

1，从DH5α平板上挑取单菌落，于5ml LB培养基中过夜培养。

2，取100ul细菌加入10mL LB培养基中，以220转/分的速度约摇动3-5小时，使OD600在0.4~0.5之间。

3，冰预冷细胞约30min。

4，4℃离心4000rpm,15~20min,弃上清。

5，倒掉上清后，用2ml冰预冷的0.1M/L CaCl2悬浮细菌,在冰上放置30min。

6，重复4，5步骤两次

7，3000rpm离心10min，用400μl冰预冷的0.1M/L CaCl2轻柔重悬细菌。

8，每个1.5mL的Eppendorf 管分别放入100ul 细菌后，立即用于转化。如需长期保存则每管需含有15%的甘油

DH5a制备化学感受态细胞应该不是太麻烦，一般用CaCl2的方法，就是注意其中几点：

1.所用试剂必须是最高级别的，包括水，最好是Milli－pore级别的。

2.所用器皿，枪头，离心管，还有你的甘油等必须严格灭菌，因为你的培养基是不含Amp 的，再说，你的感受态细胞很脆弱。经不起大风大浪。

3.关键一点：步步不离冰。温度波动会影响到你的成功率。

4.离心后回融不要剧烈震荡，始终记住，感受态细胞的脆弱性。经不起折腾。经验人士告诉我可以用枪轻轻吹打。

5.保证你培养的大肠杆菌OD值在0.5左右。别让细胞长老了。

6.可以先在超低温冰箱中用离心管盒放一些乙醇（工业酒精即可）预冷，分装后将离心管插入超低温冰箱的乙醇中保存即可。

感受态制备的疑点：

A）细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）；

B）所有操作均应在无菌条件和冰上进行；

C）经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；

D）化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）；

E）所使用的器皿必须干净。少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；

F）质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA；

G）一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比。

感受态注意事项：

1、所用器具的洁净程度。这一点非常重要，毋庸置疑。

2、培养基的装量：培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值为：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml。

3、培养基的pH值。这是讲的pH值并非单指配置或灭菌后的pH值，而且还包括整个摇瓶结束后的pH值。一般来说，接种前的pH值在6.8-7.2，等菌摇好后，可以测一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，按要求做，肯定效率不低。

4、培养后的OD值。其实这并非一个非常重要的参数，只是当OD值大到一定的程度后，菌体要保持对数生长已经不太可能，因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6，0.8等等。同时，OD值大时菌体总量大，因而感受态绝对数量要大一点，因而需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点。

5、培养基中的各种离子。经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时，使用20mM MgCl2做为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。

6、此外文献报道，在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。

7、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。至于在液氮中保存12小时以后再转入超低温冰箱，这点未做实验，只是一种感觉，第一次这样做了，没问题，以后就照此办理而已。