6高等植物遗传转化系统

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四 显微注射转化法
利用显微装置将大分子物质（DNA）或细胞器注 射到培养细胞中。最初主要由于动物，80年代中后 期开始用于植物遗传转化。用微毛细管在显微镜下 将外源DNA导入特定细胞，并使其成活、增殖。
技术要点：注射针直径要细（1uM）;选择生长旺盛 的胚性细胞；注射细胞核；进行微培养法。
优点：可精细选择受体细胞，并直接导入细胞核。
基因枪价格昂贵，转化成本较高，轰击过程对细胞损害较大， 转化效率有待进一步提高。
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二 电击法
又称电击穿孔法，80年代发展起来的遗传转化技术， 利用高压放电产生的脉冲使细胞膜产生可逆的“微 孔”，从而使外源DNA等进入细胞。 最早应用于原生质体，近来有直接转化带壁植物细胞 核组织的报道。
国际公认的一种成熟可靠转化法，对受体无限制， 可用于胚性愈伤组织、悬浮细胞、分生组织、器官等。 但需对转化参数进一步优化，转化效率低。
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三 生殖细胞原位转化法
植物生殖细胞指雌雄配子体中形成的或参与生殖 过程的有关细胞，如大小孢母细胞、卵细胞与花粉。 生殖细胞原位转化法利用天然繁殖过程为转化系统 进行遗传转化。
外壳蛋白基因及复制 细胞间传递
注射
DNA A-NPT II
双元表达载体
三周后
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RB
叶片组织产
生kan抗性
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农杆菌
高等植物细胞直接转化法
❖ 基因枪转化法 ❖ 电击法 ❖ 生殖细胞原位转化法（花粉管通道法） ❖ 显微注射法 ❖ 激光微束穿刺法 ❖ PEG介导法（化学共培法）
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缺点：
目前对植物病毒分子生物学研究十分初浅，还 不能建立有效遗传转化体系。迄今为止，植物病毒 载体尚未发展到可以广泛使用的阶段。
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重组双子座病毒载体系统感染植物示意图
NPT II
外壳蛋 白基因
DNA A
DNA B
❖压缩气流直接传送
以氦气动力直接驱动微弹。
❖微靶点射击
无需载体，将DNA与金属颗粒混合为小液滴，压缩气体为动力轰击。
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基因枪转化法的影响条件
1 DNA：高纯度的DNA；质粒或裸露DNA 片段大小在 20-
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2 花粉介导法：收集成熟花粉，基因枪等转化 花粉，后用转化后的花粉授于成熟的柱头上， 最后搜集成熟的种子。
优点：避开组织培养再生的过程，技术简单， 不需要装备精良的实验室，适合于难以再生 的植物，常规育种工作者易于掌握 。
缺点：技术尚不成熟；筛选工作量大，转化效 率较低。
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2020日/11/趋22 减少。
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基因枪及动力源的类型
❖火药爆炸轰击载体
塑料子弹为载体，火药爆炸为动力，挡板阻挡塑料载体，而金属子弹高速 轰击靶细胞。
❖压缩气体冲击载体
以压缩氦气动力，可裂膜携带微弹高速运动，以阻网阻挡可裂膜，微弹轰 击靶细胞。
❖高压放电基因枪
高压放电使水气化产生动力，驱动微弹载体。
植物病毒可以感染植物寄主细胞，并进行复制和表达植物外源 DNA。利用植物病毒的特性有希望发展成为一种有价值的植物 遗传转化体系。
优点： ➢部分植物病毒对寄主的感染是系统性的，可扩散到寄主所有 细胞，故无需组培再生； ➢可对单子叶植物进行高效浸染； ➢病毒感染的植物能够繁殖大量病毒颗粒，有望大量生产外源 蛋白。
1 花粉管通道法：周光宇（1981）首先提出，之后
有不少改良。使子房预先充分授粉，在授粉后至合
子分裂之前，通过花柱断面滴加或子房注射，使外
源DNA到达培囊，搜集成熟种子，筛选转基因植株。
我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉
管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组
20织20/1培1/22养人工再生植株，IMAU, Huo XW
优点：可瞄准靶细胞定位导入外源DNA，与其他方法比较对靶 细胞损伤小、恢复快。单、双子叶植物均可，受体细胞可以是 花粉、单细胞或组织、器官。 缺点：需要相应昂贵的设备，穿刺处理速度较慢。
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六 PEG介导法
PEG为化学渗透剂，通过改变细胞膜的通透性促 使外源DNA进入靶细胞。所引起的膜透性可以恢复， 但引起的外源DNA进入机制尚不清楚。
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一 基因枪转化法
又称微弹射击法、粒子轰击法、高速粒子喷射技术、弹道 微靶点射击，将载有外源DNA的金属（钨或金）经驱动后通 过真空小室进入靶组织的一种遗传转化技术。
采用的基因枪分为火药引爆、高压放电、压缩气体等。
1987年美国康奈尔大学的Sanford首次用于植物遗传转化。 可用受体范围广泛，单、双子叶植物均可，许多单子叶植物 遗传转化的主要方法。
缺点：工作效率低，需要特殊显微操作系统，操作
复杂。 2020/11/22
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五 激光微束穿刺法
利用激光微束（0.3-0.5uM）射击靶细胞，引起可逆性穿孔， 从而直接导入外源DNA。首先在动物与人的细胞中获得成功， 80年代后期用于植物。 技术原理：激光照射系统产生高能量激光脉冲，照射经高渗处 理的材料，产生穿孔后，外源DNA向靶细胞渗入。然后培养靶 组织，产生转化植株。
技术原理：首先获得原生质体，并有相应的组培再 生体系。在一定渗透压体系内将外源DNA直接导入。 改进的方法有（1）脂质体法，将外源DNA与脂质体 （磷脂双分子膜）的复合体用于转化；（2）电击法 与PEG法相结合等，可提高转化效率。
特点：由于原生质体及相应的组培体系的获得较难，
且培养周期长、细胞遗传背景易变异，故PEG法使用
第六讲 高等植物遗传转化系统
The System for Plant Gene Manipulation
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高等植物遗传转化系统
❖ 农杆菌介导转化方法 ❖ 直接转化（理化法） ❖ 病毒感染
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病毒载体介导的植物遗传转化