农杆菌介导的植物转基因技术实验指导

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农杆菌的活化培养及介导的遗传转化

农杆菌的活化培养及介导的遗传转化一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。

二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。

共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。

三、材料及方法1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。

2.植物幼苗。

（一）细菌培养液直接浸染法操作︰（1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。

取自无菌试管苗。

取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。

（2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。

（3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。

取OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS；（4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。

从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。

取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。

20 【终版】农杆菌介导的烟草转gfp基因(叶盘法)

1 实验背景什么是“植物转基因技术”“转基因植物”？植物转基因技术：把从动物、植物或微生物中分离获得的目的基因，或者经过修饰的目的基因，通过各种方法转移重组到植物基因组内，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状的方法。

转基因植物：通过植物转基因技术获得的、整合有外源基因的植物个体。

1 实验背景为什么要进行植物转基因？优势：◆农业：生产抗逆、高产、优质、抗病虫、除草剂、营养品质改良等优良性状的作物；遗传育种等。

◆制药、化工等：可作为生物反应器，生产药用蛋白和有用次生代谢物，或生产某些有机化合物等。

◆园艺：美化生活等，如蓝玫瑰等。

◆科学研究：生物学、遗传学等多领域基础研究等。

1 实验背景怎样将外源基因转入植物？间接转化法(载体介导)病毒介导法农杆菌介导法（双子叶/单子叶）种质系统介导法胚囊和子房注射法生殖细胞侵染法花粉管通道法直接转化法物理法化学法基因枪法(单子叶植物)显微注射法电击法超声波法PEG 法脂质体法1 实验背景各种转基因方法的区别是什么？（引自崔广荣，2003）1 实验背景针对不同植物，怎样选择转基因方法？目前转基因植株中，约80%以上通过“农杆菌介导转化法”获得。

植株特点首选方法备注对农杆菌敏感农杆菌介导法效率高，方法成熟，转基因植株遗传稳定。

原生质体培养容易直接转化法（如PEG 法）转化率高，可克服转基因植株嵌合体的难题。

多胚珠花粉管通道法提高转化率子房中有较大单胚珠植物(如核果类)显微注射法提高转化率转化难度大的植物基因枪法其它方法不可行时的备选放射性农杆菌发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens旋钩子农杆菌1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？土壤农杆菌革兰氏阴性菌RiTi 质粒(tumor inducing plasmid ）约150~200 kb向植物细胞传递外源基因Ti1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？Vir 区:毒性区，包含多个致病基因，能激活T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，并使农杆菌表现出毒性。

植物遗传转化大实验

植物遗传转化大实验一、实验目的与原理简介农杆菌介导的遗传转化系统是外源DNA进入植物细胞的最成功和应用最广泛的方法，农杆菌可浸染大多数双子叶植物和少数单子叶植物，甚至裸子植物。

转化植物细胞的农杆菌主要有两类，即根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。

已有研究表明，影响农杆菌介导植物基因转化的因素很多，农杆菌菌株、植物基因型和外植体、培养方法、不同的选择标记等因素都影响农杆菌介导的遗传转化。

目前报道已有许多植物通过农杆菌的遗传转化获得了转基因植株或毛状根。

二、发根农杆菌介导的遗传转化步骤1．无菌组织的培养取组培苗幼嫩叶片，在超净工作台中切成0.5x0.5cm的方块，并在叶片上刻痕，接种于愈伤诱导培养基中，暗培养3周后作为受体。

在农杆菌浸染前，将愈伤组织在无菌条件下切割成小块在愈伤诱导培养基上分别预培养，增加受体细胞的活性进而提高转化率。

2．农杆菌的培养在转化平板上挑取c58c1单菌落在1ml农杆菌培养基中培养。

在50ml农杆菌培养基（含相应抗生素）中加入1ml上述培养物，200rpm，28℃振荡培养过夜；室温下4000rpm, 10min，弃上清夜，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，在与上相同的条件下培养2hr，使菌液的OD600=0.5左右。

3．共培养剪取无菌苗的叶片和茎段，放入发根农杆菌MS悬液中浸泡5min，倒出悬液，用无菌吸水纸吸干表面余菌，转到共培养培养基MS上，光照培养2天。

4．毛状根的诱导和培养将共培养的外植体转入到1/2 MS + Cef 500mg/L培养基上光照培养。

随时检测外植体的染菌情况，如出现细菌生长过多，须马上转移到新筛选培养基中培养。

20天左右即可长出毛状根，剪取毛状根，接种于1/2 MS + Cb 250mg/L培养基上暗培养数周，选择生长快、分枝好的毛状根转入脱菌筛选培养基中继代筛选。

白菜转基因实验报告

一、实验背景随着科学技术的不断发展，转基因技术在农业领域的应用越来越广泛。

白菜作为我国重要的蔬菜作物之一，其转基因研究对于提高产量、改善品质、增强抗病性等方面具有重要意义。

本实验旨在通过农杆菌介导法将抗病毒基因导入白菜，探究转基因白菜在抗病毒性方面的表现。

二、实验材料与方法1. 实验材料- 白菜（Brassica rapa ssp. chinensis）：取材于本地种植的结球白菜。

- 农杆菌：选择含有Ti质粒的根癌农杆菌C58。

- 抗病毒基因：TuMV-NIa及LMV-CP。

- 植物激素：6-BA、NAA、AgNO3。

2. 实验方法1. 基因转化1.1 准备农杆菌：将根癌农杆菌C58在含有卡那霉素的YEB培养基中培养至对数生长期。

1.2 制备外植体：取白菜叶片，用70%酒精消毒后，用无菌水清洗3次，再将其切成小块。

1.3 共培养：将外植体与农杆菌混合，共培养于含有植物激素的培养基上，共培养时间为2-3天。

1.4 诱导再生：将共培养后的外植体转入含有植物激素的再生培养基中，诱导其再生。

1.5 抗性筛选：将再生植株转入含有抗生素的培养基中，筛选出阳性植株。

2. 分子鉴定2.1 PCR检测：提取转基因植株DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否存在。

2.2 Southern blot检测：将转基因植株DNA进行 Southern blot，检测目的基因是否整合到植物基因组中。

3. 抗病毒性检测3.1 人工接种：将转基因植株和对照植株分别接种TuMV和LMV病毒。

3.2 观察记录：观察记录植株发病情况，比较转基因植株和对照植株的抗病毒性。

三、实验结果1. 基因转化通过共培养和诱导再生，成功获得转基因白菜植株。

2. 分子鉴定PCR和Southern blot检测结果均显示，目的基因已成功导入白菜基因组中。

3. 抗病毒性检测与对照植株相比，转基因植株在接种TuMV和LMV病毒后，发病率明显降低，表现出较强的抗病毒性。

农杆菌转化实验步骤

农杆菌转化实验步骤
农杆菌转化实验步骤
农杆菌转化是一种常用的基因转移技术，可以将外源DNA导入植物细胞。

下面是农杆菌转化实验的基本步骤：
1. 制备农杆菌：首先，选择适合的农杆菌株，常用的是农杆菌株Agrobacterium tumefaciens。

接种农杆菌于适宜的培养基中，培养至合适的生长期。

2. 构建质粒：在进行转化实验前，需要构建包含目标基因的质粒。

质粒可以通过常规的分子生物学技术，如PCR扩增、限制性酶切和连接等方法来获得。

3. 准备细菌：将构建好的质粒转化到农杆菌中。

通常采用电穿孔或热激方法，使质粒能够进入农杆菌内。

4. 感染植物：选择适当的植物愈伤组织或幼苗作为接受体，将其暴露在含有农杆菌的培养基中。

农杆菌会侵入植物细胞，并将质粒转移
到植物基因组中。

5. 抗生素筛选：转化后的细菌通常在培养基中含有特定抗生素。

将被转化的植物细胞接种于含有抗生素的选择培养基中，该抗生素能够选择出已转化的细胞。

只有具备目标基因的细胞能够生长并形成抗性。

6. 再生植物：选定抗生素抗性的植物细胞，进一步培养和处理以促进其发育和增殖。

通过激素处理和适当的培养条件，可以使其分化成完整的植株。

7. 验证转化：最后，通过分子生物学技术，如PCR和Southern blot 分析，来确认转化的植物是否成功地获得了外源基因，以及其在植物细胞中的表达。

农杆菌转化实验是一种常用且有效的方法，可用于植物基因工程及改良研究。

通过以上步骤，可以成功将目标基因导入植物细胞中，以获得具有所需性状的转基因植物。

农杆菌介导植物的遗传转化实验报告

农杆菌介导植物的遗传转化实验报告
本实验使用农杆菌介导植物的遗传转化技术，将外来基因导入到拟南芥植物中。

通过将拟南芥的幼苗浸泡在农杆菌中，再经过一定的培养条件，使外来基因被顺利地导入到拟南芥植物的细胞中，并观察到了转化成功的基因表达现象。

实验过程：
1. 构建外源基因载体——将目的基因把它克隆进载体中，构建出我们所需要的质粒；
2. 建立农杆菌表达载体——通过将农杆菌表达载体连接到质粒上，形成我们的转化载体；
3. 准备转化基质——通过将农杆菌营养培养在一定条件下，形成我们所需要的转化基质；
4. 转化拟南芥中——通过将拟南芥幼苗浸泡到农杆菌基质中，利用细胞壁酶和孔道蛋白结合作用，导入外源基因，最终实现基因转化；
5. 鉴定转化水平——通过将转化后的拟南芥植株置于含有抗生素的培养基中，筛选出转化成功的植株。

实验结果：
通过观察实验结果，我们发现拟南芥细胞成功地接受了外源基因，使其表达了目
的蛋白。

同时，通过筛选，我们也成功得到转化成功的植株。

结论：
农杆菌介导植物的遗传转化技术是一种有效的基因转化方法，可以将外源基因导入到植物细胞中，从而实现第二代遗传分析、基因功能研究、新品种选育等方面的应用。

简述利用农杆菌介导法进行植物基因转化的具体流程

简述利用农杆菌介导法进行植物基因转化的具体流程农杆菌介导的植物基因转化技术是利用细菌“农杆菌”这一自然载体，将特定的基因从一个植物中转移到另一个植物，或者将外源基因引入到植物体内，以获得期望的新特性。

近年来，越来越多的研究者开始应用农杆菌介导的植物基因转化技术，以获得期望的新基因和新特征。

农杆菌介导的植物基因转化一般可以分为以下步骤：（1）质粒制备：将要进行转化的外源基因连接到质粒上，形成可转化的质粒。

（2）农杆菌介导的转化：使用传统的农杆菌介导转化或者现代的抗性转化技术，将质粒转化到农杆菌中，从而形成转化的农杆菌。

（3）转化的农杆菌的特殊处理：将转化的农杆菌带入植物体内，通过不同的处理，使其能够将外源基因转入植物体内，形成期望的植物体。

（4）细胞内克隆：将转化后的植物细胞放入适当的生长培养基中，使其接受稳定的培养基环境，在此基础上进行细胞内克隆，以获得具备期望特性的植物体。

（5）鉴定特异性植物：为了取得具备期望特性的植物体，对转化过程中获得的基因进行特异性检测，以筛选出具有期望特性的基因组植物。

农杆菌介导的植物基因转化技术能够有效地促进基因转化，提高新基因的成功率。

在植物基因转化过程中，根据转化的具体目标，研究者可以选择不同形式的农杆菌载体来进行转化，具有非常好的灵活性和适应性。

另外，农杆菌介导的植物基因转化技术在植物基因工程应用中占有重要地位。

此外，农杆菌介导的植物基因转化技术还可以改变植物的形态和特性，提高农作物的抗病性和对环境的适应性，改善其营养价值，以提高其品质和市场价值。

例如，可以将外源抗性基因引入到植物体内，使其具有抗病虫性；也可以将外源优生基因引入到植物体内，使其具有高效优良的生产性状；还可以将外源营养基因引入植物体内，使其具备营养价值。

因此，农杆菌介导的植物基因转化技术能够更好地改善农作物的性能，为农业的发展提供重要的帮助。

总之，农杆菌介导的植物基因转化技术是一种新型的植物基因转化技术，它可以有效地将外源基因引入植物体内，以获得期望的新特性，可大大提高农作物的生产效率，在植物育种及农业发展中发挥着重要作用。

农杆菌介导实验报告

一、实验目的1. 掌握农杆菌介导植物遗传转化的基本原理和操作步骤；2. 了解农杆菌转化过程中的影响因素；3. 通过实验验证农杆菌介导植物遗传转化的可行性。

二、实验原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种革兰氏阴性土壤细菌，其Ti质粒（肿瘤诱导质粒）能够将外源基因导入植物细胞中。

Ti质粒上的T-DNA（转移DNA）片段能够插入到植物基因组中，从而实现外源基因在植物中的稳定遗传和表达。

三、实验材料1. 植物材料：拟转化植物的外植体（如叶片、茎段等）；2. 农杆菌菌株：含有T-DNA的农杆菌菌株（如LBA4404）；3. 转化载体：含有目的基因的载体（如质粒）；4. 培养基：MS培养基、诱导培养基、选择培养基等；5. 试剂：抗生素、酶、DNA标记物等。

四、实验步骤1. 构建转化载体：将目的基因克隆到载体上，构建含有T-DNA片段的转化载体。

2. 农杆菌活化：将农杆菌菌株接种于含有抗生素的LB培养基中，37℃培养过夜。

3. 外植体消毒：将外植体在70%乙醇中浸泡30秒，然后在无菌水中清洗3次，最后在无菌条件下用无菌刀片切取适当大小的外植体。

4. 农杆菌转化：将活化后的农杆菌与外植体在MS培养基上共培养，使农杆菌感染外植体。

5. 诱导再生：将转化后的外植体接种于诱导培养基上，诱导再生丛生芽。

6. 选择转化植株：将再生丛生芽在含有抗生素的选择培养基上培养，筛选出转化植株。

7. 鉴定转化植株：通过分子生物学方法（如PCR、Southern blot等）鉴定转化植株。

五、实验结果与分析1. 农杆菌转化频率：实验结果表明，农杆菌转化频率较高，转化植株数量较多。

2. 转化植株的遗传稳定性：通过分子生物学方法鉴定转化植株，发现转化植株的遗传稳定性较好，目的基因在植物基因组中的插入位置和拷贝数稳定。

3. 转化植株的表达：转化植株中目的基因的表达水平较高，达到预期效果。

六、实验结论通过农杆菌介导植物遗传转化实验，成功地将目的基因导入植物细胞中，实现了植物遗传改良。

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农杆菌介导的植物转基因技术
一、实验目的
1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。

2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。

二、实验原理
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。

农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。

因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。

人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。

实验一培养基配制
一、仪器和试剂
1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台
2、药品：Beef extract (牛肉浸膏) 5g/L ，Yeast extract (酵母提取物) 1g/L ，Peptone (蛋白胨) 5g/L ，Sucrose (蔗糖) 5g/L ， 100ml ，Agar (琼脂) 100ml， MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙酸），6-BA（6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif），链霉素（str）。

二、实验方法
第一组配制YEB固体培养基
1、配制250mlYEB固体培养基：先称取 Beef extract (牛肉浸膏)； Peptone (蛋白胨)； Yeast extract (酵母提取物)； Sucrose (蔗糖)；1g ；琼脂粉；将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml，用NaOH调pH=。

2、灭菌：将盛有250ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。

3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60℃时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100μg/ml kan+50μg/ml Str+50μg/ml rif），以免温度过高导致抗生素失效。

4、倒板：将抗生素与培养基混匀，每个平皿倒15ml培养基，可以倒16个平皿，倒完后打开平皿盖，在紫外灯下照10min，等待培养基凝固，盖上平皿盖，封口备用。

第二组配制YEB液体培养基
1、配制500mlYEB液体培养基：先称取 Beef extract (牛肉浸膏)； Peptone (蛋白胨)； Yeast extract (酵母提取物)； Sucrose (蔗糖)；2g ；将上述药品置于500ml 三角瓶中，用量筒称取450ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至500ml，用NaOH调pH=。