常规细胞冻存和复苏方法
细胞学堂细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤
细胞学堂细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤细胞冻存与细胞复苏，是细胞培养过程中的常见工作。
细胞冻存，是指将细胞贮存在超低温环境中，使细胞暂时“冬眠”的技术，在需要的时候再进行复苏。
细胞复苏，是把冻存在-80℃冰箱或液氮中的细胞快速解冻，并使细胞重新恢复生长的技术。
本文将为大家介绍细胞冻存与复苏的技术要点和操作步骤。
细胞冻存篇冻存原则细胞冻存原则为“慢冻”，即让细胞在缓慢降温的条件下逐渐冷冻。
如果直接将细胞悬液放在超低温下快速冷冻，细胞会受到冷冻损伤而死亡。
在冻存液中添加的保护剂（如DMSO、甘油）和在冻存盒中添加的异丙醇，都起到程序性降温的作用。
DMSO使用注意事项DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，延缓温度下降速度，减少细胞内冰晶的形成，从而起到保护细胞的作用。
需注意的是，DMSO溶于培养基时，将释放大量热量，所以细胞冻存液需提前配制，不能直接将DMSO加入含有细胞的培养基中，避免烫伤细胞。
另外，DMSO属于致癌物质，使用时应戴好手套，规范操作。
程序冻存液配方程序冻存液成分一般由基础培养基、胎牛血清、DMSO组成。
血清比例为10%~90%，DMSO比例为5%~10%。
根据普诺赛实验室细胞培养经验，推荐冻存液配比：55%基础培养基＋40%胎牛血清＋5%DMSO，难养细胞可用90%胎牛血清＋10%DMSO冻存。
细胞冻存密度细胞冻存和复苏过程中，不可避免会损失部分细胞，所以冻存的密度不能太低。
提高冻存密度有助于提升细胞复苏存活率，推荐密度为100~300万细胞/mL。
冻存操作方法方法一：使用程序冻存盒使用程序降温盒是最常用的冻存方法。
市面上的降温盒有些需要添加异丙醇，有些则不需要。
降温盒须恢复室温后再使用。
根据普诺赛实验室细胞培养经验，使用程序冻存盒冻存效果良好，没有冻存盒的同学可以参照下文方法二和方法三。
操作步骤步骤1：配制程序冻存液，放在室温备用或放在4℃预冷步骤2：离心收集对数生长期的细胞（贴壁细胞消化下来离心，悬浮细胞直接离心，转速1200rpm或250g，时间3min）步骤3：用配制好的冻存液重悬细胞，按照1~1.5mL/管分装到冻存管中，拧紧管盖，做好标记步骤4：冻存管放入冻存盒，冻存盒放入-80℃冰箱过夜（24h）步骤5：冻存管从冻存盒取出，转移至液氮长期保存▲ 使用冻存盒操作示意图方法二：使用无血清非程序冻存液无血清非程序冻存液是一种商品化的冻存液，无需自己配制，无需降温盒，大大提升了便捷性。
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤以及细胞的运输
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤以及细胞的运输细胞株(系)的使用，为医学研究和测试工作带来了极大的方便。
但细胞的传代是有限制的，长期连续传代的细胞，不仅消耗大量的人力和物力，而且细胞的生长与形态等会有一定退变或转化，因而细胞失去原有的遗传特性，有时还会由于细胞污染而造成传代中断，种子丢失。
因此，在实际工作中常需冻存一定数量的细胞，以备替换使用。
细胞冷冻与复苏是细胞培养室的常规工作和通用技术。
细胞的冻存一、概述目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。
细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。
如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。
胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。
如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。
因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。
采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。
慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。
二、主要冷冻设备和材料常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。
使用时要注意以下几点：（1）一般两周需充液氮一次，至少一个月充氮一次。
液氮温度达-19 6℃，使用时注意勿让液氮溅到皮肤上，以免引起冻伤。
（2）液氮容器为双层结构，中间为真空层，瓶口有双层焊接处，应防止焊接部裂开。
（3）在装入液氮时，要注意缓慢小心，并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导，使液氮直达瓶底，如有专用液氮灌注装置则更好。
细胞冻存和复苏的原则
细胞冻存和复苏的原则细胞冻存和复苏是一种先进的技术，可以将细胞保存在极低温下，并在需要时重新复苏。
它在医学和科学研究领域有着广泛的应用，包括细胞治疗、尸体保存和生物研究等。
然而，细胞冻存和复苏并不是一件简单的事情，它涉及到许多原则和技术。
本文将介绍细胞冻存和复苏的原则和一些常见的方法。
细胞冻存的原则主要包括细胞处理、冷冻保护剂和冷冻过程等。
1.细胞处理：在冻存细胞之前，需要进行适当的处理。
首先，需要确保细胞的纯度和活力。
通常使用细胞培养的方法，将细胞培养至富有生长活力的阶段，然后进行冷冻。
同时，还需要对细胞进行适当的处理，如细胞除膜、固定细胞骨架等，以增加细胞的抵抗力。
2.冷冻保护剂：冷冻保护剂是一种在冷冻过程中起到保护细胞的作用的物质。
常见的冷冻保护剂包括甘油、DMSO（二甲基亚砜）和微生物发酵的液体。
这些保护剂可以减少细胞在冷冻过程中的损伤，防止冰晶的形成，从而保证细胞的完整性和功能。
在添加保护剂时，通常需要控制浓度和时间，以避免对细胞的毒性。
3.冷冻过程：冷冻过程是细胞冻存的核心环节。
一般来说，冷冻过程需要经历冷冻速率的调控、冷冻温度的选择和冷冻存储条件的维护等步骤。
细胞的冷冻速率是决定细胞成活率的一个重要因素，过快或过慢的冷冻速率都会导致细胞死亡。
冷冻温度的选择也非常重要，通常选择深度冷冻，即将细胞冰冻至极低温下，以防止细胞的新陈代谢和生物活动。
冷冻存储条件的维护是确保细胞冷冻的安全和稳定性的关键，包括低温保存、无菌保存和无氧保存等。
细胞复苏的原则主要包括解冻过程和恢复过程等。
1.解冻过程：解冻过程是将冷冻细胞重新回温至正常温度的过程。
在解冻过程中，需要控制解冻速率和解冻温度，以避免细胞的损伤。
解冻速率过快或温度过高都会导致冰晶的形成和细胞的破坏。
因此，解冻过程需要缓慢而温和，可以通过温水浴、离心和悬液稀释等方法进行。
2.恢复过程：细胞在解冻后需要进行恢复过程，以恢复其正常的生理和生化功能。
细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤
细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存方法，用于长期保存细胞并保持其生理活性。
下面将详细介绍细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤。
技术原理：细胞冻存是通过将细胞在低温下快速冷冻，并加入保护剂以减少冷冻引起的细胞损伤，从而降低细胞的新陈代谢活动，保持细胞的生命特性。
具体原理如下：1.冷冻缓慢升温原理：冷冻过程中细胞内水分形成冰晶，容易损伤细胞结构。
为了降低损伤，冷冻时的降温速率应尽量缓慢。
而复苏时，也需要采取缓慢升温的方法，以避免溶解冰晶时造成的细胞破坏。
2.保护剂的添加：在冷冻过程中，加入一定浓度的保护剂能够防止细胞水分快速冻结而形成冰晶，从而减少冷冻引起的细胞膜和细胞器损伤。
一般常用的保护剂有甘露醇、二甘醇和甘油等。
操作步骤：下面将介绍细胞冻存与复苏的具体操作步骤：1.细胞选择与培养：选择要冻存的细胞，并保证细胞处于健康和活跃状态。
采用无菌操作，将细胞培养在适当的培养基中，并严格控制培养条件。
2.细胞冻存液的配制：将适当的冻存液配制好。
一般的冻存液组成包括培养基、胎牛血清/胎儿犊牛血清、20%-50%的甘油或其他保护剂。
保护剂的浓度取决于细胞的类型和耐受性。
3.细胞冻存：将培养好的细胞用冻存液冷冻保存。
首先，用培养基洗涤细胞，去除残留的培养基。
然后，添加冻存液，将细胞悬浮均匀。
最后，将细胞悬液装入标记好的冻存管中，并缓慢冷冻至-80℃或液氮中。
4.细胞复苏：将冷冻的细胞迅速取出，用温暖的手掌加热，迅速溶化冰晶。
将细胞悬液转移到离心管中，并加入预先配制好的培养基。
然后，用离心机离心，除去冻存液或保护剂。
最后，加入适当的培养基，将细胞继续培养。
5.细胞复苏后培养条件的控制：在细胞复苏后的培养过程中，需要严格控制培养条件，包括温度、CO2浓度、培养基成分和营养物质的供给等，以确保细胞能够正常生长和繁殖。
总结：细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存技术，可以长期保存细胞并保持其生理活性。
细胞的冻存与复苏
细胞的冻存与复苏为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。
冻存的温度一般用液氮的温度为－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冷冻后，最终保存于液氮中。
在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。
冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。
复苏一般采用快速融化方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解，然后将细胞转入培养器皿中进行培养。
一、细胞的冻存（一）仪器、用品与试剂细胞培养箱、液氮罐、普通冰箱、－80℃超低温冰箱、离心机、冻存管、离心管、冻存盒、倒置显微镜、吸管、废液缸、添加有0.02%EDTA 的0.25%胰蛋白酶消化液、细胞冻存液（10ml体系：含7ml培养基、2ml FBS、1ml 甘油或DMSO）、细胞培养基（如添加有10％FBS的RPMI1640）等。
（二）方法1、取旺盛生长的、已基本上快要长满细胞的培养瓶，小心吸干瓶内培养液。
给每个培养瓶中加入1-2ml胰蛋白酶消化液，37℃消化细胞。
2、待大部分细胞从瓶壁脱落下来后，加入3-5ml细胞培养基终止消化。
3、1000rpm 离心5分钟，收集细胞沉淀。
4、加入适量细胞冻存液，调整细胞密度在1-10×106个/ml。
5、将上述细胞悬液小心分装入冻存管中，拧紧冻存管盖子，标注清楚细胞名称、冻存日期等内容。
6、置4℃普通冰箱中预冷30min或者1h。
7、将冻存管放入冻存盒中，立即转移入－80℃超低温冰箱过夜。
8、将冻存管转移入液氮罐中，在记录本上记录清楚细胞冻存管的位置、名称等信息。
（三）注意事项1、冻存细胞的生长状态要好，建议在冻存前24小时内对培养基进行换液，冻存前培养瓶中细胞的密度不宜过高。
2、冻存液的配方可根据细胞种类之不同进行适当调整，血清的浓度可以更高一些，甘油和DMSO的浓度也可在5-20%之间调整。
细胞复苏与冻存
慢冻快溶
细胞复苏的操作步骤：
1：从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37度水浴中，一般用烧杯倒入蒸馏水，然后放入水浴锅中预热，防止水浴锅中水污染细胞，将冻存管竖起，快速摇晃，直至冻存液完全融化。
2：将细胞悬液移入离心管，缓慢加入4ml 培养液，离心1000转每分钟，离五分钟。
3：将离心后的上清液吸出，加入PBS 清洗一下细胞，减少DMSO 对细胞的毒性作用，缓慢捶打均匀，然后离心。
4：将上清吸出，用培养液混匀沉淀的细胞，调整细胞密度，将细胞悬液吸入培养瓶中，再加入新的培养液培养，等细胞贴壁后即换液，以去掉死细胞。
细胞冻存的步骤：
1：将细胞从培养瓶上消化下来，然后加入培养液，混匀后计数，要按照每管冻存管中含有2×10 6个细胞。
2：然后将细胞悬液吸入5ml 离心管中，离心
3：将上面液体吸走，然后按计算结果加入DMEM 缓慢混匀。
4：冻存液的配制，1ml ；600ul10％DMEM 细胞悬液+300ul 血清+100ulDMSO ，
5：然后将混好的液体吸入2ml 冻存管中，冻存，先放入4度冰箱中，然后再放入-20度，最后放入液氮中保存。
细胞冻存与复苏的主要操作步骤
细胞冻存与复苏的主要操作步骤细胞冻存和复苏听起来像是高深的科学术语，其实说白了，就像把细胞装进冰箱里暂时“冷藏”，然后再拿出来“解冻”一样。
这样做的目的，是为了保存细胞的活性和功能，方便未来的研究或治疗。
那具体怎么操作呢？来，我给你一步步拆解这门科学。
1. 细胞冻存1.1 准备工作首先，你得确保你手头有一切所需的材料。
想象一下，你要出门旅行，得先把行李打包好对吧？冻存细胞也是一样，你需要准备冻存管、冻存液（通常是含有二甲基亚砜（DMSO）的冻存液）、冷冻设备等。
1.2 细胞收集接下来就是收集细胞了。
像是在收集宝贵的珍珠一样，你要小心翼翼地操作。
取出细胞时，要确保培养基是温暖的，细胞在里面像小鱼在水中一样舒适。
把细胞离心后，用吸管轻轻地取出细胞沉淀物，别弄成一团糟。
此时，你的细胞就像小小的珍宝，正准备“打包”进冻存管。
1.3 冻存液准备冻存液的准备很重要。
通常，冻存液里含有二甲基亚砜（DMSO），它能帮助保护细胞免受冷冻过程中冰晶形成的伤害。
用时，一般是按照比例混合好，倒入已经准备好的细胞悬液中，搅拌均匀。
这就像是给你的细胞穿上一件防寒大衣，确保它们在寒冷的“冰箱”里不会感冒。
1.4 冻存过程好了，液体准备好了，接下来就要将细胞放入冻存管中，然后开始冷冻过程了。
细胞冻存管要放进预冷的冰箱里，逐渐降温。
这时候，温度得降得非常缓慢，不能急功近利。
通常，我们会在80°C的冰箱里慢慢降温，直到彻底冻住。
记住，冷冻过程就像等待一锅慢炖汤，急不得。
2. 细胞复苏2.1 取出冻存管当你需要使用冻存的细胞时，首先要把冻存管从冷冻设备里拿出来。
这个步骤就像你从冰箱里拿出刚冷藏好的冰淇淋。
速度要快，不然细胞受热时间过长，可能会损失活性。
拿出来后，立刻放入37°C的水浴中，快速解冻。
2.2 解冻解冻的时候，就像把冰淇淋从冰箱里拿出来放在桌上，过一会儿就开始变得柔软。
细胞的冻存管要在水浴中不断摇晃，确保液体均匀加热。
细胞冻存与复苏的主要操作步骤
细胞冻存与复苏的主要操作步骤嘿，大家好！今天我们来聊聊细胞冻存和复苏的那些事儿，别担心，我会把这些操作讲得通俗易懂，带点幽默感，让你听得轻松又开心。
准备好了吗？那我们就开始吧！1. 细胞冻存的准备工作1.1 细胞的准备首先，细胞冻存之前，你得准备好你的“细胞宝宝”。
这就像给小朋友穿上厚厚的冬衣，你得确保细胞们在冻存前的状态良好。
先要确认细胞生长得旺盛、状态好，这样冻存后复苏才不会掉链子。
别让它们觉得自己快要去北极了，还是要保持好心情哦！1.2 冻存液的配制接下来，你得准备冻存液。
这东西就像给细胞们准备的“冰淇淋”，它的作用是防止细胞在冷冻过程中被冻坏。
通常冻存液里会有含有保护细胞的成分，比如二甲基亚砜（DMSO）或者甘油。
把这些成分混合在一起，就像调制一杯鸡尾酒，让细胞在寒冷中也能有滋有味地待着。
2. 细胞冻存的操作2.1 冻存前的处理冻存的过程开始啦！首先，你得把细胞从培养瓶里取出，像搬家一样，把它们小心放入冻存管里。
记住，操作时要尽量轻柔，别让细胞们觉得自己被“抛弃”了。
然后，把之前准备好的冻存液加入细胞管中，确保每个细胞都得到“冬衣”的保护。
2.2 冷冻过程现在来到了关键一步，冷冻！这个过程就像给细胞们上“冰雪世界”的体验了。
细胞管要放进冷冻箱中，逐渐降低温度，最好是每分钟下降1°C，这样可以防止细胞内形成大的冰晶，保护细胞不受伤害。
记得设置好降温曲线，确保细胞们能平安度过寒冬。
3. 细胞复苏的操作3.1 复苏前的准备好了，细胞们在冷冻中已经度过了漫长的冬季，现在该是复苏的时候了。
首先，你得把冻存管从冷冻箱里取出来，像迎接老朋友一样，准备好温暖的环境。
复苏液的温度要在37°C左右，就像给细胞们提供一个温暖的春天。
3.2 细胞复苏最后一步是复苏！把冻存管放在37°C的水浴中，温柔地摇晃一下，直到细胞液完全融化。
注意啊，动作要轻柔，千万别让细胞感到惊吓。
然后，把细胞转移到预热的培养基中，让它们重新恢复生长。
干货I细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项
干货I细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项细胞培养之实验操作及注意事项｜细胞复苏/冻存/传代一、细胞培养前期准备工作细胞培养仪器设备：●细胞培养通风橱（即生物安全柜）●培养箱（通用推荐：湿式二氧化碳培养箱）●离心机●医用冰箱（4℃）和冰柜（-20℃）、生物超低温冰箱（-80℃）、液氮冷冻罐●倒置显微镜其他用品：细胞培养容器（培养瓶、培养皿、多孔板等），吸管和移液器，培养基、血清和试剂注意事项:●无菌工作区域：细胞培养实验室的主要要求是需要维持细胞培养操作工作区域处于无菌状态，最简单经济的方式就是使用细胞培养通风橱。
●无菌试剂和培养基：商品化试剂和培养基经过严格的质量控制以确保无菌，注意操作过程中不要被污染，其他试剂和溶液需要选择适当的灭菌方法（例如：高压蒸汽、无菌过滤等）进行灭菌。
●无菌操作：要求操作人员在实验开始前对工作区域和双手操作部分进行75%酒精消毒；尽量使用一次性塑料吸管进行单次操作，避免交叉污染；试剂瓶和培养用具使用时方可开盖，用后要第一时间盖上，暴露于环境中的时间尽可能要短。
●整体的细胞实验环境也弥足重要，需要定期对实验室环境进行较为彻底的清扫消毒和杀菌，包括实验用仪器和室内地面、桌面等。
二、细胞的复苏与冻存细胞复苏：在细胞状态不足以满足实验需求或者出现细胞污染的情况下，需要进行细胞复苏：a)从超低温冰箱或者液氮中取出自保存或商品化购买的冻存细胞后，快速转移至37℃水浴条件下轻轻转动融化（一分钟内）。
b)75%酒精擦拭冻存管外部后，转移至通风橱中。
c)加入适量新鲜的完全培养基混合，约800-1000rpm下离心5-10分钟，实际离心速度时间取决于细胞种类和细胞状态。
d)新鲜培养基重悬后接种于相应的培养器皿中，做好标记，37℃，5%CO2条件下培养。
细胞冻存：为现有细胞系做细胞储备，需要对代数相对靠前的细胞进行扩增培养和细胞冻存：a)准备细胞冻存液，置于2℃-8℃下备用。
b)观察待冻存的细胞，密度达到80%-90%左右，将贴壁/悬浮细胞分别按照传代方法收集。
细胞冻存及复苏步骤
细胞的复苏步骤1.实验前准备（1）将水浴锅预热至37℃。
（2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
（3）在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2.取出冻存管（1）根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
（2）从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
3.（1）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
（2）约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
4.离心：放入离心机中1000r/min离心4min。
（一般800即可，对于较小细胞可适当增加转速，一般不超过1000r）5.制备细胞悬液（1）吸弃上清液。
（2）向离心管内加入12ml培养液，吹打制成细胞悬液。
6.细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
（依照细胞类型而定）7. 培养贴壁细胞的冻存的步骤准备：从冰箱取出各药品在室温下放置，紫外照射超净台30min，配置5%DMSO的冻存液1.收集各管中培养液与一个大的离心管中，吸取1ml培养液加入已标记的EP管中用于支原体的检测，其余用于终止酶解反应。
2.加入5mlPBS洗卡氏瓶除去血清，防止酶解反应受影响。
注意：要在卡氏瓶的反面加液，防止把细胞冲掉。
加入2ml胰酶，使细胞从瓶壁上脱落下来。
3.酶解完全后迅速加入含血清的培养基终止酶解反应。
4.收集各瓶中的细胞悬液，并计算其体积，取出一部分于EP管中用于计数，计算冻存支数。
5.离心800r每分钟，4min。
在超净台中取出冻存管并做好标记（名称株号冻存人日期）6.去除上清，并用适量（依冻存支数而定，每支1ml）的冻存液使其悬浮，加入冻存管中，每管1ml7.放入冻存盒（标注放入日期有使用次数限制），在-80冰箱中过夜后放入液氮罐并作好记录。
细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项
细胞冻存与复苏步骤原理及注意事项细胞冻存是指将活体细胞暂时停止其代谢活动，并在低温下保存，以便今后可以复苏和继续进行研究。
这项技术对于维持细胞的长期保存和保护遗传材料非常重要。
步骤：1.细胞培养和准备：选择合适的细胞培养基和培养条件，使细胞处于最佳状态。
2.冻存液制备：制备一种含有细胞生长因子、保护剂（例如DMSO或甘油）以及缓冲剂（例如BSA或EDTA）的冻存液。
3.细胞收集和离心：将培养好的细胞通过离心来收集细胞沉淀。
4.细胞冻存和保存：将收集到的细胞与冻存液混合，将混合液分装到冷冻管中，并在极低温下保存（通常为-80°C或液氮温度）。
复苏：1.细胞溶解和补充：将冷藏的细胞迅速解冻，并将其加入到预先准备好的培养基中。
2.培养和观察：将复苏后的细胞转移到培养皿中，并在适当的条件下培养。
观察细胞的生长和形态变化。
原理：细胞冻存的原理是通过降低细胞内温度来减缓或暂时停止细胞代谢活动。
冷冻液中的保护剂可减少细胞冷冻过程中的冻伤，防止细胞膜的破裂和细胞器的破坏。
细胞冷冻过程中，细胞内的水会形成冰晶，但保护剂的存在可以防止冰晶对细胞结构的破坏。
当细胞需要复苏时，通过迅速解冻并将细胞转移到适当的培养基中，细胞可以恢复其生理功能并继续生长和分裂。
注意事项：1.使用无菌的实验室条件和器具来避免细胞冻存和复苏过程中的污染。
2.选择适当的冻存液和培养基，以确保细胞的最佳保护和生长条件。
3.控制冷冻和解冻速率，过快或过慢的速率都可能对细胞造成伤害。
通常使用准备好的细胞冷冻容器或慢速冷却设备来控制速率。
4.正确选择适合冷冻保存的细胞类型。
不同细胞可能对冷冻敏感性有所差异。
5.注明冷冻细胞的信息，例如细胞类型、冷冻日期、冻存液配方等，以便于后续的管理和查询。
细胞复苏、传代、冻存过程
细胞复苏、传代、冻存过程引言细胞复苏、传代和冻存是细胞实验中常见的操作流程。
细胞复苏指的是从冻存状态下恢复细胞的生长和功能，传代是将细胞进行繁殖，冻存则是将细胞保存在极低温下，以便长期保存和后续使用。
下面将详细讨论这些过程。
细胞复苏 Process of Cell Revival材料和设备•冻存管：包含冻存细胞的管子•暖水槽：设置在37°C的恒温水槽内•柱塞：用于搅动和混合细胞悬液•无菌培养皿•无菌培养基步骤1.将冻存管取出放在暖水槽中，快速融化冰冻细胞。
2.将融化的细胞悬液转移到无菌培养皿中。
3.加入预热的培养基，使细胞悬液与培养基充分混合。
4.将细胞培养皿放入培养箱中，维持37°C的恒温和5% CO2的含氧条件。
5.定期观察细胞的生长情况。
细胞传代 Process of Cell Passage材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•无菌培养基•显微镜•无菌移液器•15ml离心管•离心机步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。
2.用无菌移液器将培养基吹洗细胞，移除老化细胞和细胞碎片。
3.将细胞用预热的无菌培养基均匀混合。
4.用无菌移液器将细胞和培养基移入新的细胞培养皿中。
5.定期检查和记录细胞的生长情况和数量。
冻存细胞 Process of Cell Cryopreservation材料和设备•细胞培养皿：含有生长的细胞•冻存液：包含细胞冻存所需的成分•冻存管•冷冻容器：用于储存冻存管的液体氮罐•标签：用于标记冻存管步骤1.将培养皿放在显微镜下，观察细胞的生长情况和密度。
2.用无菌移液器吹洗细胞，并移除老化细胞和细胞碎片。
3.用预热的无菌培养基将细胞均匀混合。
4.将混合的细胞和冻存液按照特定比例混合。
5.将混合液转移至冻存管中，并封闭管盖。
6.标记冻存管上的信息，包括细胞类型、传代数和日期。
7.将冻存管放入冷冻容器中，迅速冷冻至-80°C或更低温度。
常规细胞冻存和复苏方法
常规冻存方法下面以肿瘤细胞和杂交瘤细胞为例，介绍常规冻存细胞的详细过程。
✧主要材料（1）仪器设备：普通冰箱和-700C～-800C超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机等；（2）冻存管：容量为1ml或1.5ml；（3）冷冻保护液：一般是以5份小牛血清、4份细胞培养基与1份DMSO 混合而成。
现配现用，或配制后放入普通冰箱冰盒内冷冻保存。
使用前，于室温下水浴溶解；（4）待冻存细胞：各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。
✧操作过程1.待冻存细胞悬液的制备(1)按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计算细胞总数；(2)将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，去上清夜；(3)向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml；(4)按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖；(5)在冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。
2.分级冷冻(1)先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4～80C），约30min；(2)接着将冻存管臵于普通冰箱冷冻室（-100C～-200C），约30～60min；(3)将冻存管转入低温冰箱（-800C），放臵过夜；(4)最后将冻存管投入液氮保存。
3.记录做好冻存记录。
记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位臵以及操作人员。
✧冻存结果如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。
✧讨论在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。
高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。
在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时最好带手套。
在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐内溅出。
若液氮溅出，可能对皮肤造成冻伤。
操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。
应注意控制冻存细胞的质量。
既要在冻存前保障细胞具有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。
细胞的冻存及复苏ppt课件
细胞的冻存和复苏
1.细胞冻存
细胞冻存与细胞传代保存相比优势在于：一，可以减少 人力、经费投入，减少污染，减少细胞生物学特性变化； 二，有利于保存那些不立即使用的细胞系或者将细胞系 转给其他使用者。
要获得好的冻存与复苏效果，必须了解如下几 个问题：冷冻速率、复苏速率、冷冻保护剂，冷 冻保存温度。
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细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻速率
冷冻速率：降温的速度，直接关系到冷冻效果， 对一种细胞进行冷冻保存之前，首先需要测定其 最适冷冻速率，以保证获得最高的冷冻存活率。
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冷冻速率：慢冻 复苏速率：快融 冷冻保护剂：渗透性和非渗透性 冷冻保存温度：－196 ℃（液氮）
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细胞冻存与复苏的关键因素 复苏速率
复苏速率：在细胞复苏时温度升高的速度。复温 速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说， 复温速度越快越好，速度过慢，细胞内往往重新 形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细 胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。
细胞复苏、传代、冻存
细胞复苏操作说明（针对冻存细胞）实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，水浴锅 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需复苏的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 从液氮罐中取出冻存管 ，直接浸入 37℃温水中 ，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从 37℃水浴中取出冻存管 ，打开盖子 ，移液枪吸出细胞悬液 ，加到离心管并滴加 5 倍以上完全培养 基并混匀 。
3. 操作离心 ， 调至1000 转/分 ，时长 10 分钟4. 弃去上清液 ，重悬离心管底部细胞沉淀 ，在 T25 培养瓶中加入 5-6ml 完全培养基 ，计数 ，调整细胞 密度，接种培养瓶 ，37℃培养箱静置培养。
5. 次日更换一次培养液，继续培养。
6. 注意：冻存细胞建议三管一起复苏到一个 T25 培养瓶。
细胞传代操作说明（贴壁细胞）实验仪器 ：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，0.25%胰酶 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 细胞于培养箱中 ，愈合度达到 80% ，可进行传代。
2. 按 T25 培养瓶计 ，吸出完全培养基 ，并 PBS 缓冲液轻冲 3 遍 ，添加 0.25%含 EDTA 胰酶 2ml ， 消 化 2min（具体时间视细胞而定） ，后用完全培养基将细胞冲洗下来。
1000r/min 离心 10 min ，弃上清 收集细胞，铺至 2 个 T25 培养瓶中培养，各添加 7ml 完全培养基。
3. 注意： 消化时间不易过长，消化前血清成分务必去除干净，终止消化请用新鲜完全培养基，原瓶培养基不可继续使用（终止消化或传代） 。
细胞传代操作说明（悬浮细胞）实验仪器：超净工作台 ，CO2 培养箱 ，倒置显微镜 ，离心机实验试剂：DMEM 培养基 ，胎牛血清 ，三抗实验材料：T25 细胞培养瓶 ，需传代的细胞 ，移液枪 ，枪头 ，离心管实验步骤：1. 细胞于培养箱中，密度达到悬浮细胞传代标准（沉降后可铺满底面），可进行传代。
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤细胞冻存是将细胞保存在极低的温度下，以延缓其新陈代谢过程，从而达到长期保藏的目的。
细胞复苏则是将冻存的细胞重新恢复到正常生活状态的过程。
下面将详细介绍细胞冻存和细胞复苏的方法步骤。
细胞冻存的方法步骤：1.细胞培养：首先，需要获得足够数量和质量的细胞进行冻存。
通过细胞培养技术，将细胞培养在含有适当营养物质的培养基中，使其生长繁殖。
2.细胞分离和检测：将细胞从培养基中分离出来，并进行质量检测，确保细胞的纯度和活力。
3.冻存液的制备：制备适当的冻存液，通常是含有细胞保护剂的冻存液，可以起到保护细胞免受低温伤害的作用。
4.冻存管的准备：准备干净的冻存管，并确保管内没有污染物。
5.细胞冻存：将细胞悬浮液和冻存液混合，将混合液加入冻存管中。
随后，将管子放入冷冻器中，逐渐降低温度，使其达到细胞存活所需的最低温度，通常为液氮温度（-196℃）。
6.冻存管理：冻存后的细胞需要进行管理，包括记录存储位置、维护存档和监测保存条件等。
细胞复苏的方法步骤：1.细胞解冻：将冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃的温水中，并轻轻摇晃，以加快冻存液的溶解。
待细胞解冻完成后，立即将细胞转移到含有培养基的离心管中。
2.细胞复苏培养：将细胞悬浮液转移到培养基中，然后放入培养箱中进行培养。
培养基的组成与之前的培养条件相似，以帮助细胞适应新的环境。
3.细胞复苏检测：在细胞复苏后的一段时间内，需要对细胞进行监测和检测，包括细胞存活率、生长状况、形态特征等。
4.细胞复苏管理：对细胞进行管理和维护，包括定期更换培养基、检测细胞的多项指标、记录细胞的生长状态等，以确保细胞的健康状态和长期保存。
细胞冻存和细胞复苏的方法步骤需要严格控制和执行，以保证细胞的活性和质量。
冻存和复苏过程中的温度、冻存液的配方、时间等因素都会对细胞的生存和恢复产生影响，因此，在实施这些方法时需要权衡各种参数，并根据具体情况进行调整和优化。
同时，冻存和复苏过程中的操作要保持无菌、无污染，以保证细胞的无菌状态和纯度。
细胞冻存与复苏步骤
细胞冻存与复苏步骤一、细胞冻存步骤1.细胞准备：选择需要保存的细胞，如细菌、真核细胞或植物细胞等。
确保细胞在保存前是健康和活跃的。
2.细胞培养：将细胞培养在适当的培养基中，提供足够的营养物质供细胞生长和增殖。
3.预冷处理：在冰箱中对细胞进行预冷处理，以适应环境的改变，减少冷冻过程中对细胞的伤害。
4.冷冻介质配制：配制适合冷冻细胞的冷冻介质。
常见的冷冻介质包括甘油、DMSO（二甲基亚砜）等。
5.细胞冷冻：将培养好的细胞与冷冻介质混合均匀，并分装到冷冻管或冻存袋中，然后将其放入液氮罐中进行冷冻。
6.冷冻保存：将冷冻好的细胞保存在液氮罐中，温度通常保持在-196℃以下。
二、细胞复苏步骤1.预备工作：首先需要准备好细胞复苏所需的培养基和试剂。
培养基通常包括适当浓度的多糖、氨基酸和生长因子等。
2.细胞解冻：将冷冻的细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃的水浴中解冻，避免长时间暴露在室温。
3.细胞离心：解冻后将细胞离心，以去除残留的冷冻介质和杂质。
4.细胞重悬：将离心得到的细胞重悬于预先准备的培养基中。
5.细胞培养：将细胞转移至培养皿中，放入恒温培养箱中，通常为37℃，5%CO2的条件下继续培养。
6.细胞观察：观察培养皿中细胞的生长情况，通过显微镜观察细胞形态和数量的变化。
1.选择适当的冷冻介质：不同细胞类型对冷冻介质的耐受性不同，需要选择能够保护细胞完整性和生物活性的冷冻介质。
2.控制冷冻速率：过快或过慢的冷冻速率都可能导致细胞冻存失败。
通常使用控制冷冻速率的设备，如液氮罐或冷冻机。
3.防止细胞冻伤：冻存过程中细胞易受到冻伤的伤害，应尽量减少或避免冻伤的发生。
例如，在细胞冷冻前使用细胞保护剂可以提高细胞的存活率。
4.保存条件控制：细胞冷冻保存时，需要精确控制温度，确保保存温度稳定，以防止细胞失活或变异。
液氮罐中的细胞保存时间通常可以达到数年以上。
细胞冻存与复苏技术的发展为细胞研究和应用提供了更多的可能性，同时也为人类疾病的治疗和预防带来了希望。
细胞冻存与复苏方法
细胞冻存与复苏方法细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。
细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。
一、冻存和复苏的原则：慢冻快融当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。
复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
二、慢冻程序1、标准程序：采用细胞冻存器当温度在-25 ℃以上时，1~2 ℃/min；当温度达-25 ℃以下时，5~10 ℃/min；当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中。
2、简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1~2 ℃的速度，在40 min内降至液氮表面过夜，次晨投人液氮中。
3、传统程序：冷冻管置于4℃ 10 分钟→ -20℃ 30 分钟→ -80℃ 16~18 小时（或隔夜）→ 液氮槽长期储存。
三、低温保护剂的应用在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。
常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。
四、细胞冻存方法1、预先配制冻存液10%DMSO + 细胞生长液（20%血清+基础培养液）10%甘油+ 细胞生长液（20%血清+基础培养液）2、取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ~ 5 ×106细胞/ml）3、加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。
液氮长期保存五、保存细胞的复苏方法1、快速解冻冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。
细胞冻存、复苏及传代
细胞冻存步骤
1、将细胞冻存液（10%DMSO+90%FBS)配好并放置冰箱预冷；
2、当10 cm培养皿中的RBMSC细胞汇合到80%-90%时，用胰蛋白酶将细胞消化下来，1200 rpm离心，去上清；
3、加入PBS重悬细胞，以洗去残留的胰蛋白酶，1200 rpm离心，去上清；
4、加入1ml细胞冻存液重悬后，将细胞重悬液放入冻存管中，并快速将冻存管放入冻存盒中(冻存盒需先复温),再将冻存盒放入-80℃冰箱中过夜，再转移至液氮中保存。
细胞复苏步骤
1、先将培养基配好并复温，在15ml离心管中加入3ml培养基
2、将从液氮罐取出的冻存细胞置于37℃水浴锅中1-2min溶解后，立即将细胞悬液转移至
15ml离心管中，1200 rpm离心3 min，弃上清；
3、加入6ml培养基重悬细胞，并将细胞悬液转移至6cm培养皿中培养，贴壁12h后换液。
4、复苏的细胞应传代2-3代后方可用于实验。
细胞传代步骤
1、当培养皿或培养瓶内的细胞增殖为80-90%时，可进行传代。
2、弃上清，PBS洗2-3次，6cm（10cm）培养皿中加入600μl（800 μl）胰蛋白酶消化1-2min
后，在显微镜下观察细胞是否变成圆形，当细胞变成圆形后，应立即加入培养基终止消化，以免细胞消化过度。
3、1200 rpm离心3min，弃上清，加入1ml培养基重悬，将细胞重悬液转移至含有培养基
的6cm培养皿中进行培养。
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常规冻存方法
下面以肿瘤细胞和杂交瘤细胞为例，介绍常规冻存细胞的详细过程。
✧主要材料
（1）仪器设备：普通冰箱和-700C～-800C超低温冰箱、液氮冻存罐、高速离心机等；
（2）冻存管：容量为1ml或1.5ml；
（3）冷冻保护液：一般是以5份小牛血清、4份细胞培养基与1份DMSO 混合而成。
现配现用，或配制后放入普通冰箱冰盒内冷冻保存。
使用前，于室温下水浴溶解；
（4）待冻存细胞：各种肿瘤细胞或杂交瘤细胞。
✧操作过程
1.待冻存细胞悬液的制备
(1)按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物，制备单细胞悬液，并计
算细胞总数；
(2)将细胞悬液以800～1000r/min离心5min，去上清夜；
(3)向细胞沉淀物中加入冷冻保护液，轻轻吹打混匀，使细胞密度达1×106～
1×107个/ml；
(4)按每管1～1.5ml的量分装于冻存管内，拧紧管盖；
(5)在冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期。
2.分级冷冻
(1)先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（4～80C），约30min；
(2)接着将冻存管臵于普通冰箱冷冻室（-100C～-200C），约30～60min；
(3)将冻存管转入低温冰箱（-800C），放臵过夜；
(4)最后将冻存管投入液氮保存。
3.记录
做好冻存记录。
记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位臵以及操作人员。
✧冻存结果
如此冻存的细胞，其存活率可达90%以上。
✧讨论
在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。
高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。
在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时最好带手套。
在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐内溅出。
若液氮溅出，可能对皮肤造成冻伤。
操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。
应注意控制冻存细胞的质量。
既要在冻存前保障细胞具有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。
另外，在每批细胞冻存一段时间后，要复苏1～2管，以观察其活力以及是否受到微生物的污染。
冻存细胞的复苏
✧主要材料
（1）仪器设备：恒温水浴箱、高速离心机；
（2）培养用液：完全培养液。
✧复苏过程
（1）调配370C～400C的温水，或将恒温水浴箱的温度调节至370C～400C；
（2）从液氮中取出冻存管，立即投入370C～400C温水中迅速晃动，直至冻存液完全溶解；
（3）将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5ml培养液(或10ml)，轻轻吹打混匀；
（4）将细胞悬液经800～1000r/min离心5min，弃上清夜；
（5）向细胞沉淀内加入完全培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养瓶内，补足培养液进行培养。
（6）复苏第二天上午更换新鲜培养基，以弃去残余DMSO。
✧结果
复苏后的细胞应该保持其冻存时的活力，活细胞数达90%以上。
✧讨论
细胞冻存悬液一旦融解后，要尽快离心除去冷冻保护液，防止冷冻保护剂对细胞产生毒性。
实验人员在复苏细胞过程中，同样应具有自我保护意识，避免被液氮冻伤。