细胞实验的基本操作

细胞实验的基本操作

【细胞培养】

一、细胞的复苏：

非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

具体操作如下：

1、实验前准备：

1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。

1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。

1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

2、取出冻存管及迅速解冻：

2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。

2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；

4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；

5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。

6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括

悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培

养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避

免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。

二、细胞的传代：

培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积

累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞

的继续生存。这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。

1、贴壁细胞的传代

具体操作如下：

1.1、传代前准备：

1.1.1、预热培养用液：把装有培养液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

1.1.2、用75％酒精擦拭双手和经过紫外线照射的超净工作台

1.1.3、正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少

污染。

1.1.4、点燃酒精灯：注意火焰不能太小。

1.1.5、准备好将要使用的已灭菌的空培养瓶。

1.1.6、取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

1.1.7、从培养箱内取出细胞，注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察

细胞，并做好记录。

1.1.8、细胞培养瓶经用75％酒精擦拭后，再放入超净台。

1.2、胰蛋白酶消化：

1.2.1、将瓶盖过酒精灯火焰消毒后，打开瓶盖，靠近酒精灯，小心吸出旧培养液，用PBS清洗2－3次，沿

壁（无细胞的一面）缓缓加入适量消化液（胰蛋白酶液），轻轻摇晃。注意消化液的量以盖住细胞最好，最

佳消化温度是37℃。

1.2.2、显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时

细胞消化适度。

1.3、吹打分散细胞：

1.3.1、弃去大部分消化液（仅留少量在瓶内），并轻轻拍打培养瓶，使细胞分散，然后加入新鲜的培养液，

再用吸管轻轻吹打成细胞悬液（尽可能不要出现泡沫，否则对细胞有损伤〕

1.4、分装稀释细胞

1.4.1、将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。

1.4.2、倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞

的生长，传代细胞的密度应

该不低于5×105/ml。最后在瓶上做好标记，如细胞代数、日期及姓名等。

1.5、继续培养：

1.5.1、用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在

瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。

2、悬浮细胞的传代

悬浮细胞可以直接将培养瓶中的液体吸掉，只留下少量，然后加入新鲜培养液

即可。当细胞悬液中碎片或颗粒物较多，感觉到比较脏时，可以将悬液移到离

心管内，1000～1500rpm离心3分钟，弃上清，加入约2ml培养液，吹打至

均匀，滴加2-3滴至已加入新鲜培养液的培养瓶中。然后置于二氧化碳培养箱

中培养（拧松培养瓶盖）。

三、细胞的冻存

细胞冻存的原则是要逐步缓慢降温，以避免细胞内部形成冰晶对细胞造成伤害。

1、具体操作如下：

1.1、从增值期到形成致密单层以前的细胞都可以用于冻存，但最好选择对数增长期细胞，已长满的细胞冻存复苏后生存率低。在冻存前一天最好换一次培养液。

1.2、贴壁细胞经消化、离心（1000～1500rpm，5min）收集，悬浮细胞经离心收集；

1.3、大约106个细胞加入1ml冻存液（10％DMSO+90%血清），用吸管吹打，使细胞分散成单细胞悬液；

1.4、加入到冻存管中，每个冻存管加1－1.5ml的细胞悬液；密封；

1.5、在冻存管上标明细胞名称及冻存日期；

1.6、将冻存管直立放置于塑料盒或纸盒内，管置于4℃半小时，然后置于-20℃两小时，再置于-70℃两小时，然后置于液氮上方过夜；第二天将细胞置于液氮中；

1.7、记下冻存管存放的位置，作好冻存记录（冻存的细胞名称、代数、冻存日期等）。

2、注意事项：

2.1、使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭

菌反而会破华它的分子结构，以

至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。

2.2、不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要

发生在这一温度区内，是“危

险温区”。