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思考题第二章分子克隆工具酶1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。
常用的工具酶□工具酶名称主要功能限制性械酸内切酶在DNA分子内部的特异性的restriction endonucleases 破基序列内部进行切割DNA连接酶DNA ligase将两条以上的线性DNA分子或片段催化形成磽酸二酯键连接成一个签体DNA聚合酶1 DNA polymerase I 通过向3’螭逐一增加核昔酸以填补双链1）\A分子上的单链裂o.即5'f 3'DNA 聚合酶活性与3'->5’及5'-*3'外切酶活性多核甘祓激酶催化将把一个琪酸分子加到多核昔酸.低的DNA polymerase kinease 5' — 0H末端上反转母晦以RNAADXAK为棋板合成互补的cDNAtt reverse transcriptaseDNA*境转移酶DNA terminal Deoxynuc leatidy transferase 将璟聚物尾巴加到了线性双低或单KDNA分子的3’ 一0H未端或DNA的3’ 一未端破性碑酸酶BAP or CIP 核酸外切B&III exonuclease III 降解酶SI nuclease SI 核酸酶Bal 31 nuclease Bal31 Taq DNA聚合酶Taq DNA polymerase核檐核酸酶RNase脱氧核糖核酸》阴DNase去除DNA, RNA, dNTP的5’磽酸基团降解DNA3' - 0H末端的核甘酸歿基隆解单链DNA或R\A,产生带5’烫酸的单核甘酸或取聚核甘酸.同时也可切割双链核戳分子的单链降解双链D\A, R\A的5’及3’末端，高专一性单链核甘酸能在高温（72C）下的单链DMA为模板，从5'f 3’方向合成新生的互补钱专一性降解RNA内切核酸阴，水解单低或双低DNA2•说明限制性内切核酸酶命名原则（举例）。
基因工程知识点总结归纳(更新版)
基因工程绪论1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。
作动词：基因的分离和重组的过程。
2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。
供体、受体和载体是基因工程的三大要素。
3、基因工程诞生的基础三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。
以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。
三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。
2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。
5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。
6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。
7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。
8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。
9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
10、RNAH降解与DNA杂交的RNA，用于cDNA文库建立时除去RNA以进行第二链的合成。
基因工程重点总结（完整）
基因工程重点总结（完整）基因工程名词解释：基因工程：重组DNA技术或者基因转移技术，在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之渗入到原先没有这类分子的宿主细胞内，而能持续稳定的传递和表达。
报告基因：其编码产物能够被快速测定，常用来判断外源基因是否成功地导入受体细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。
双元载体：由两个分别含有T—DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒载体系统。
受体系统：用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源基因的整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。
正负选择法：哺乳动物细胞转染DNA发生随机整合的几率相当高，而同源重组的频率则相当低。
正是由于这种缘故，给哺乳动物细胞的基因定向插入事件的检测造成了很大困难。
用于富集同源重组事件的特殊试验体系，涉及正选择和负选择两个方面。
基因靶标：通过在转染细胞中发生的外源基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重组，使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改变系把你遗传特性的目的。
密码子使用的偏爱性：无论是真核基因还是原核基因，一种特定的氨基酸并不是以同等频率使用所有的同义密码子，而主要使用其中的某一两种。
这种密码子使用的非随机性现象选择标记基因：用于鉴别目标DNA的存在，将成功转化了质粒的宿主挑选出来的基因。
主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因。
HA T选择法：由于选择TK+细胞的培养基含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷，所以称之为。
生殖细胞浸泡法：将供试外植体如种子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗悬浮细胞培养物等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用渗透作用把外源基因导入受体细胞并稳定地整合、表达和遗传。
胚囊、子房注射法：使用微量注射器把外源DNA溶液注射到子房或胚囊中，由于卵细胞的吸收使外源DNA进入受精的卵细胞中，从而获得转基因的种子。
基因工程资料总复习重点总结
基因工程：称基因操作、重组DNA。
基因工程是以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因(DNA 分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA 分子，然后导人活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和功能。
穿梭载体：含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA片段的杂种质粒，有两个复制起点和既能在细菌又能在真核细胞中进行选择的选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主乙。
穿梭质粒：指一类由人工构建的具有两种不同复制起点以及相应的选择标记基因，因而可在两种不同种属的受体细胞中复制和检测的质粒载体。
同裂酶：不同来源的限制性内切核酸酶具有相同的识别序列，产生完全相同的黏性末端。
重组率：在连接反应结束后，含有外源DNA片段的重组分子数与所投入的载体分子数之比。
cDNA文库：由cDNA法构建的基因文库，只含有某一生物体的所有蛋白质编码序列，一般不含有DNA调控序列。
基因组文库：由鸟枪法构建的基因文库，含有某一生物染色体的所有DNA片段，包括基因编码区和间隔区DNA。
感受态：受体细胞最易接收外源DNA片段而实现转化的一种特殊生理状态。
同尾酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶识别的靶序列各不相同，但都产生相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。
接头：是一段含有某种限制性核酸内切酶识别序列的人工合成的寡聚核苷酸，通常是八聚体和十聚体。
转化：将质粒DNA 或以它为载体构建的重组质粒导入细菌中的过程称为转化。
星号活性：Ⅱ类限制性核酸内切酶虽然具有特异性的识别序列和切割的位点，但是当酶解条件发生变化时，酶切反应的专一性可能会降低，导致同种酶识别多种序列，这种现象称为限制性核酸内切酶的星号活性。
动物乳腺生物反应器：能够分泌乳汁的转基因动物生产其他来源的基因产品，并通过乳腺分泌出来。
细菌的限制—修饰系统：细菌中有作用于同一DNA 的两种酶，即分解DNA 的限制酶和改变DNA 碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。
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第一章绪论1 •基因工程的定义：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA）,转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。
2•基因工程理论上的三大发现和技术上的三大发现3 •基因工程的基本步骤（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
（2）重组体的制备：将冃的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。
（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞川。
（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。
（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
4 •基因工程的意义（1）基因工程在农业生产中的应用：提高植物的光合作用率；提高豆科植物的固氮效率；转基因植物；转基因动物。
（2）基因工程在工业中的应用：1）纤维素的开发利用：克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素來生产葡萄糖，发酵成酒。
2）酿酒工业：用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。
或用酿酒酵母生产蛋白质等。
（3）基因工程在医药上的应用：用微生物生产药物；用转基因植物或动物生产药物；设计高效高特异性的生物制剂-疫苗；制造新型疫苗；基因诊断；法医鉴定；基因治疗。
（4）基因工程在环境保护中的作用：1）检测水污染：用重组细菌或转基因鱼等检测水污染2）生物降解：用带有重组质粒的“超级菌〃分解油（烷怪类）、有机农药污染。
（5）基因工程商业化的发展第二章基因工程主要技术原理1. 质粒和基因组DNA的提取方法与纯化步骤，主要试剂是什么质粒的提取和纯化方法最常用的为碱抽提法：原理：闭合环状的质粒DNA,在变性后不会分离，复性快。
染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质-SDS复合物结合在一起, 在离心的时候沉淀下去。
基因工程期末考试重点知识整理
基因工程第一章基因工程概述1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT)基因工程（Gene Engineering）,是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术.2、基因工程的历史基因工程准备阶段：1972，第一个重组DNA分子的构建，构建人：Paul Berg及其同事PPT 基因工程诞生：1973，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化基因工程发展阶段的几个重要事件：一系列新的基因工程操作技术的出现；各种表达克隆载体的成功构建；一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现3、基因工程的内容（P9）4、基因克隆的通用策略（P12）(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)第二章分子克隆工具酶5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答)概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶，主要存在于细菌体内特点（参加PPT）命名：依次取宿主属名第一字母，种名头两个字母，菌株号，然后加上序号。
如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ，Hin指来源于流感嗜血杆菌，d表示来菌株Rd，Ⅲ表示序号。
分类：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：Ⅰ型酶、Ⅱ型（Ⅱs型）酶和Ⅲ型酶。
真核细胞中有4中DNA聚合酶：α，β，γ，线粒体DNA聚合酶原核生物中3中DNA聚合酶：Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ6、几个基本概念粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为~。
高中生物基因工程知识点总结
高中生物基因工程知识点总结一、基因工程1、基因工程：通过诱导、控制、修饰和组装酶分子改造生物的技术手段，即基因工程。
2、基因是什么：基因是DNA（deoxyribonucleic acid）在调控生物表达的功能单位，它是细胞在传递遗传信息的实体，也是遗传的核心物质。
它决定着生物体的各种性状特征。
3、基因的分类：基因可以按照性质和功能分为结构基因、调控基因和其他基因。
4、基因工程改造方法：基因工程技术有多种，包括基因重组技术、克隆技术、突变技术、转基因技术和增幅技术等。
二、基因工程在实验室中应用1、基因工程在实验室中的应用：基因工程技术在实验室中的应用大大提高了有关生命科学研究的准确性和灵敏度，广泛应用于药物研发、蛋白质检测、临床诊断等领域。
2、基因芯片：基因芯片是一种微小的电子设备，它可以通过在芯片上安装的特定探针来检测特定基因的表达情况或者其他特征。
这种技术可以用来快速检测病毒、细菌等多种病原体，也可以用来研究和监测人体疾病的进展情况。
3、基因测序：DNA测序技术是利用数字技术对准确确定和分析DNA序列的一种技术。
它可以用来检测基因组DNA的结构、查找靶基因和生物多样性、研究基因变异和肿瘤等。
4、基因合成：基因合成技术是以整合DNA的方式制造新的蛋白质的技术，它是把细菌、哺乳动物等常用基因以指定的比例混合在一起。
三、基因工程的发展1、基因工程的发展趋势：基因工程的发展将继续走向优化、分析和精细化。
将进一步提升对生命系统的认识，并能更好地利用基因信息提高生物系统的性能。
2、基因工程的应用场景：基因工程可用于转基因作物的研发、制药新药研发、生物燃料的生物柴油等方面的开发应用，还可以进行生命科学的深入研究，探索新的生物机理。
3、基因工程的未来发展：基因工程技术将在药物研发、医疗诊断、育种良种、食品检测、农药残留和农作物耐药性等方面获得更大的应用，发挥更大的作用，更好地促进人类健康。
基因工程复习总结
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①启动子：是一段有特殊结构的__D_N_A__片_段___，位于基因的 ____首_端_____，是_R_N__A_聚__合_酶__识别和结合的部位，能驱动 基因转录出_m__R_N_A_____，最终获得所需的_蛋_白__质______。 ②终止子：也是一段有特殊结构的__D_N__A_片__段__，位于基因 的___尾__端_____。 ③标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基 因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因 是_抗__生__素__抗__性_基。因
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基因工程的应用
1 . 植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植 物，利用转基因改良植物的____品_质_____。 2 . 动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜 产品品质。 3.基因治疗：把正__常_的__外_源__基_因______导入病人体内， 使该基因表达产物发挥作用。 4.基因工程制药
考点二 基因工程基本操作程序分高考析总复习.生物
一、目的基因的获取途径 1．从基因组中获取。 2．人工合成目的基因常用的方法有： (1)已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学 方法合成，不需要模板。 (2)以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成。
3．PCR技术扩增目的基因
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(2)“分子缝合针”——_D_N_A__连__接_酶__ ①两种DNA连接酶（ 大 肠 杆 菌 DNA连接酶和T4-DNA连接 酶）的比较： a.相同点：都缝合__磷__酸__二__酯__键。 b.区别： E • c o l i DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的 __黏__性__末__端__之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接 酶能缝合___两__种__末__端____。 ②与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将 _单__个__核_苷__酸__加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二 酯键。DNA连接酶是连接_两__个_D_N_A_片__段_的末端，形成磷酸 二酯键。
生物基因工程知识点总结(精选4篇)
生物基因工程知识点总结（精选4篇）生物基因工程学问点总结（精选4篇）生物基因工程学问点总结篇1一、基因工程及其应用基因工程概念：基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。
通俗的说，就是根据人们意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。
原理：基因重组结果：定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。
二、基因工程的工具1、基因的“剪刀”—限制性核酸内切酶（简称限制酶）（1）特点：具有专一性和特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。
（2）作用部位：磷酸二酯键（4）例子：EcoRI限制酶能专一识别GAATTC序列，并在G和A 之间将这段序列切开。
（黏性末端）（黏性末端）（5）切割结果：产生2个带有黏性末端的DN断。
（6）作用：基因工程中重要的切割工具，能将外来的DNA切断，对自己的DNA无损害。
注：黏性末端即指被限制酶切割后露出的碱基能互补配对。
基因的“针线”——DNA连接酶作用：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。
连接部位：磷酸二酯键基因的运载体（1）定义：能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。
（2）种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。
三、基因工程的操作步骤1、提取目的基因2、目的基因与运载体结合3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测和鉴定四、基因工程的应用1、基因工程与作物育种：转基因抗虫棉、耐贮存番茄、耐盐碱棉花、抗除草作物、转基因奶牛、超级绵羊等等2、基因工程与药物研制：干扰素、白细胞介素、溶血栓剂、凝血因子、疫苗3、基因工程与环境爱护：超级细菌五、转基因生物和转基因食品的平安性两种观点是：1、转基因生物和转基因食品担心全，要严格掌握2、转基因生物和转基因食品是平安的，应当大范围推广。
三个方法让你生物成果飙升对比记忆法在生物学学习中，有许多相近的名词易混淆、难记忆，对于这样的内容，可运用对比法记忆。
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第一章基因工程概述第一节基因操作与基因工程基因操作（ gene manipulation）：指对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。
基因工程（ gene engineering）：通过工具酶，在体外将目的基因、基因片段或其它DNA 元件进行切割，与适当的载体进行连接和重组，导入相应受体细胞，并使外源基因进行复制和表达，定向改造受体生物性状或获得表达产物。
基因操作与基因工程的关系：基因操作的核心是基因重组（gene recombination）技术，基因工程是基因操作、基因重组的核心内容和主要目的。
基因工程的遗传学效果：受体生物发生遗传信息或遗传性状的变化并能稳定遗传给下一代。
第二节基因工程是生物科学发展的必然产物一、基因是基因重组的物质基础遗传因子、基因：是遗传信息的基本单位。
从物质结构上看，基因是染色体组核酸分子。
基因（gene）是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段并具有遗传学功能，可以是连续的，也可以是不连续的，可以是 DNA 也可以是RNA ，可以存在于染色体上，也可存在于染色体之外（如质粒、噬菌体等）。
基因工程的理论基础：⑴ . 明确了遗传信息的携带者—基因的载体是DNA ，明确了遗传的物质基础。
⑵. DNA 分子的双螺旋结构和半保留复制模型得以阐明，解决了基因的自我复制和传递问题。
⑶ . 中心法则、操纵子学说的提出以及遗传密码子的破译，解决了遗传信息的流向和表达问题。
(4). 遗传物质基础和中心法则的通用性决定了基因工程原理和技术在生物界普遍适用，尤其是可以实现跨越任何物种界限的遗传成分转移。
自此，从理论上讲，基因工程已有可能成为现实基因工程的技术基础：DNA 重组⑴ . DNA 体外切割和连接技术（限制性内切核酸酶和DNA 连接酶的发现与应用，标志着时代的开始）。
⑵ . 克隆载体的发展与应用。
⑶ . 大肠杆菌转化体系的建立。
⑷ . 琼脂糖电泳技术的应用。
⑸ . DNA 测序技术的应用。
基因工程知识总结
生物选修三 知识点--------基因工程一、 基因工程1、（a ）基因工程的诞生（一）基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA 重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程是在DNA 分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA 重组技术。
2、（a ）基因工程的原理及技术 原理：基因重组技术：（一）基因工程的基本工具1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA 片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2.“分子缝合针”——DNA 连接酶(1)两种DNA 连接酶（E ·coliDNA 连接酶和T4DNA 连接酶）的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：E ·coliDNA 连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA 片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA 连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
(2)与DNA 聚合酶作用的异同:DNA 聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。
DNA 连接酶是连接两个DNA 片段的末端，形成磷酸二酯键。
3.“分子运输车”——载体（1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA 片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA 的鉴定和选择。
基因工程总结15页word文档
主要内容:第一章基因操作的基本技术核酸制备；质粒及质粒载体；细菌的转化；凝胶电泳；核酸探针；限制性内切酶、酶切图谱及分子克隆用酶第二章 PCR技术第三章核酸分析与合成第四章噬菌体载体及粘粒第五章目的基因的准备和重组及重组子的鉴定第六章基因在原核及真核体系中的表达真核基因在大肠杆菌中的表达；哺乳动物基因工程；研究DNA与蛋白质相互作用的方法第七章植物基因工程第八章基因工程研究进展人类基因组计划；基因诊断、基因治疗和转基因；反义技术序言：1.什么是基因工程？基因工程是如何诞生的？答：在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这类分子的宿主细胞中，并能持续稳定的繁殖。
2.基因工程的两个基本特征？答：（1）跨越天然的物种屏障（2）确定的DNA扩增3.基因工程的步骤和内容？答：酶切分离目的基因→重组DNA分子→转移至受体细胞增殖→获得筛选目的重组子(→提取目的基因供进一步研究→重组目的基因功能表达)4.基因工程可以应用于哪些方面?答：(1)带来体外蛋白质化学的革命:甲型干扰素，红细胞生成素。
（2）对检测技术的贡献：提供大量高纯靶，提高准确性；病原体检出（HCV HBV HIV）；遗传病诊断。
（3）直接的遗传性疾病治疗和生物体改造：转基因动植物。
（4）促进对生命现象本质机理的研究：胰岛素基因与糖尿病、癌基因与抗癌基因。
5.什么是“安全”的宿主—载体体系？答：失去自我迁移能力，可以是营养缺陷性，在自然环境下无法生存。
第一章基因操作基本技术1、提取细胞总RNA的原则是什么？如何实施？为什么?答: 原则：抑制RNA酶活性实施：（1）高温：180℃，2小时，灭活RNase（2）二乙基焦炭酸乙酯（DEPC）,油状有毒, 是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。
它使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
（3）使用对RNase有强烈乙酯作用的细胞裂解剂，如盐酸胍、异硫氰胍（裂解细胞、抑制酶活性、解聚核糖体）（4）带手套、口罩：阻断RNA 酶来源，加少污染机会。
基因工程基础知识复习归纳
基因工程复习归纳第一章绪论1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体〔供体〕的基因与载体在体外进展拼接重组，然后转入另一种生物体〔受体/宿主〕内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。
2.基因工程概念的开展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆〔Molecular/Gene→基因工程→基因操作。
应用领域以“基因工程〞、“DNA重组〞为主基因工程基因工程的历史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因〔供体〕：外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子〔克隆载体、表达载体〕。
宿主〔受体〕：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞〔组织、器官或个体〕。
4.基因工程的根本步骤〔切、接、转、增、检〔大肠杆菌是中心角色〕〔1〕目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，别离出带有目的基因的DNA片断。
〔2〕重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记〔抗菌素抗性〕的载体分子上。
〔3〕重组体的转化：将重组体〔载体〕转入适当的受体细胞中。
〔4〕克隆鉴定：摘要转化成功的细胞克隆〔含有目的基因〕。
〔5〕目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
第二章 DNA重组克隆的单元操作一、用于核酸操作的工具酶1.限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。
限制性核酸内切酶的功能与类型其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。
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思考题第二章分子克隆工具酶1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。
常用的工具酶硝基序列内部进庁切割DrU逵接癖DT⅛A 1 i HaSe将两条以上的纯性HA方子咸序喪傕化昭成磷酸二酣键逢接战一6盘傢DNAJSt 合BBl DNA PDIytoeraSe 1通⅛u≡ιg'掰遥一蝎如械昔≡κ⅛<⅛■补双链小心子上的单俺毅口，WP5* *^,D∖AΛ⅛-βfc i⅛÷ΦfX⅛.Γ*5⅛5*-3*外切a⅞渚性¾κ⅛⅛⅛e一J t'碳6⅛z⅛w子初»1多棱甘IHU⅛的I)NA Polynlerase k i πc∣isc F-DH半螭上r,<3ve rs e t. ran sc ri IH rise咲R∖A或DMt¾Λ⅛樓核合总互⅜b⅛∣DNA f⅛I)MAJK 却fr 移B⅜DhlA terminal DeOXyrLUC ICatidy transferase 44^LM4⅛⅛ 巴加到了进性双K或*ι⅛DNΛ⅛ 子⅛⅛3'- Oll 卓娴减IΛA⅛⅛Y-来姗减性辑酸酶BΛP Or ClP 核酸外⅛^b⅛III CXOnUCICaSe TrTF⅜j⅛⅞ħ⅛Slnucl p^ιse S I核酸酶RHl 31IiuulcastJ Ikil.31Taq DNA M⅛i⅛Iaq DNA p∩IynlCrrLSC核摘核瞋隔Rλcise脱氧4⅛4⅛⅛⅛aifi⅛DvISe去除［Γ⅛ KK九dNTF j⅛⅛5,⅞⅛ι⅛^≡lF^MIΛA3,-0HX⅛⅛的孩昔酸⅛也移解单链加A或R∖A,产生带亍璘酸的单械甘酸或專聚才茫昔百罠，祠时电可切害J J空t⅛棱酸分子的单1⅛ 护琳双ι⅛l)∖A, RKΛ⅛⅛5f及3'末端.高专—性单健核昔酸能在高温(72C ) -F⅛⅛⅛MDλA>⅛⅛板.从3'方向令咸新生的互补谜专一懺降解RMA内切械肢晦.4⅛M4tl⅛或双1⅛DNA2•说明限制性内切核酸酶命名原则(举例)ECORl属毛种类 株系 编号3. 限制内切核酸酶的星活性是指什么？在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列， 这个改变的特殊性称星星活性。
星星活性是限制性内切酶的一般性质， 任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型 位点。
引起星星活性的因素：甘油浓度高（＞5%）,酶过量（＞100U∕ml ）,离子强度低（＜25 mmol/L ）， PH 值过高（＞8.0），或是加了有机溶剂如DMSo （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺，或是用其它2价阳离子如 Mn2+、Cu2+、Co2+或Zn2+代替了 Mg2+。
4. T4 DNA IigaSe 和 E.coli IigaSe 有什么异同？基本廉则 3-4个宇母组咸M 方式是：毛+种希+俅毛+序号首字母 取属名的第1个字毎*且大电 第2宇母 取种名的耶1个字母” 小写第3字母①車科毛的第2个字毎*小写；②若种名有词头，且 巨會电过內切δ⅛* 则耳又词头后■的第一宇母代替第］字母若有株毛F 株名则作为第4字母* 绘否大＜h 写” 杭J⅛ 原来的情况而定 顺冷号若在同一茵株中方离了几个限制性内切核酸酶，则按 先后顺库冠以1∖ IT.TTT ............................................................... 夺条目 耍点ESChenChia COIiRy 135. 连接酶的反应温度如何选择，为什么？连接酶最适的反应温度应是37C ,但在这一温度下粘性末端的氢键结合不稳定，因此连接反应常采用的最佳温度一般在4-16 C间，通常多选用12-16 C 30分钟到16小时。
6. 什么是Klenow酶？有什么作用？Klenow DNA聚合酶是从全酶中除去5'—3'外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和3' —5'外切活性不受影响。
也称为Klenow片段(KlenOWfrgment ),或E.coli DNA聚合酶I 大片段(E.coli DNA polymerase I large fragment)。
它也可以通过基因工程得到，分子量为76 kDa。
由于没有5'—3'外切活性，使用范围进一步扩大。
①补平3 '凹端，如果使用带标记的dNTP,则可对DNA进行末端标记。
②抹平DNA3'凸端在3'—5'外切活性③通过置换反应对DNA进行末端标记④在CDNA克隆中合成第二链⑤随机引物标记⑥在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA••• 7.如何利用工具酶来研究某一个基因内含子的存在？••• 8.哪些工具酶可以用于探针标记？T4 DNA聚合酶的替代合成法标记DNA探针。
反转录酶还可利用单链DNA或RNA作模板合成分子探针。
第三章分子克隆载体1. 基因工程载体应具备哪些特点？能在宿主细胞中独立复制；有一定的选择标记，易于识别和筛选；有合适的限制酶位点，可插入一段较大的外源DNA,而不影响其本身的复制；最好有较高的拷贝数，便于载体制备。
2. 作为一个最基本的载体，它必须具备哪些功能元件？能独立复制的单链或双链DNA;选择标记基因；合适的限制酶位点。
••• 3•请简要描述λ噬菌体溶原状态和裂解循环的基因调控模式及其在构建载体中的作用。
4•丝状噬菌体载体克隆中经常遇到哪些问题？丝状噬菌体载体的优点a. 可产生单链DNA或双链DNA,分别用于不同的目的单链：为丝状噬菌体，可分泌到细胞外，用于测序或制备探针双链：为含双链RF DNA存在于细菌菌落中，可供基因操作，如酶切，重组、提取、转化均应为双链DNA O具有质粒的优点b. 丝状噬菌体所能包装的DNA长度没有一定的限制，有些噬菌体颗粒可包装比野生型丝状噬菌体DNA长7倍的DNA O缺点a. 较大的外源DNA片段被克隆以后，在噬菌体扩增过程中往往不稳定，很容易发生缺失的现象，这可能是由于感染较短的噬菌体比长的噬菌体更具竞争优势所致。
b. 单链载体分子感染的细胞中往往单双链混杂，纯化某种类型的分子（尤其是双链分子）比较费力，同时由于重组DNA容易产生缺失，培养时间不能长，故所得DNA的量有限。
C.重组中，经常出现一些能以两种可能方向插入的载体却仅以一种特定方向插入外源DNA 片段的情况，这是因为外源DNA反向链的序列，在不同程度上干扰了载体基因间区域的功能所致。
克服“缺失”的办法a. 侵染菌应避免在液体培养基中连续继代培养b. 应用贮存于-70C ,重组Phage M13感染细菌后铺板，再从噬菌斑中央部分挑取细菌后进行小规模培养c. 培养时间应尽可能短（通常4-8h）d. 收获噬菌体的培养液不能再做为原液继续培养（因在重组子和野生型噬菌体共培养中，野生型具有选择优势，几代培养后可消除重组子）。
第四章人工染色体载体1. 大容量克隆载体有哪些种类，各有何特点？表4-1 5种常见Λ,⅛⅛Λ⅛tt体及其基本特性....... 3•简述黏粒、YAG BAC克隆载体、P1噬菌体载体的基本构成元件。
4. 黏粒载体具有哪些优缺点？怎样克服其缺点？黏粒的优点(1)同时具有λ噬菌体和质粒载体的特性(2)具有高容量的克隆能力柯斯质粒的缺点a. 两个粘粒之间，当存在同源序列时，可能会发生重组，结果使克隆的外源DNA片段重排或丢失。
b. 含不同重组DNA的菌落生长速度不一。
当柯斯质粒文库复制扩增时，由于不同的插入片段对宿主细胞作用的情况不同，结果会出现各种外源DNA 片段间的比例失调。
另外不同重组柯斯质粒的产量相差悬殊。
c. 包装蛋白制备过程较复杂，每批包装蛋白的包装效率不稳定。
而且，购买包装蛋白的费用较高。
第五章表达载体•••• 1.以大肠杆菌为例，表达载体比克隆载体多了哪些功能元件，各有什么生物学功能？2. 简述利用T7噬菌体启动子的PET系列表达载体的工作原理。
••• • 3.何为穿梭载体，在遗传结构上有何特点？••• 4 .将人的某个基因在大肠杆菌中表达应注意哪些问题？••• 5.分泌表达载体需要哪些基本元件？••• 6.什么是融合表达？有什么优点？第8章PCR技术及其应用••• 1简述PCR扩增的原理和过程？PCR反应特点：特异性强灵敏度高简便、快速对标本的纯度要求低PCR的基本原理是什么？用PCR r增时，必须预先得知什么信息？a. DNA的半保留复制原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。
b. 至少要知道足够合成一对引物的靶DNA序列。
•过程：a. 变性(den aturation ):将模板DNA置于92-96 C,使dsDNA在高温下解链成为ssDNA,且热变性不改变其化学性质；b. 退火(ann eali ng):将温度降至37-72 C,使引物与模板的互补区相结合；c. 延伸(extension ):在72C条件下，DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3 ‘-OH端，合成DNA。
这三个热反应过程的重复称为一个循环，经过20-40 个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的DNA片段。
PCR引物有哪些基本要求？在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各 1 μ M ,即1pmol∕ μ l ,在100 μ l反应体系中相当于6x1013个分子。
如果5%用于扩增1 kb的DNA片段，可得到3.3 μ g的产物，足以用于常规分析。
引物设计要考虑的几个问题①长度：至少16 bp ,通常为18-30 bp ,更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。
②解链温度（Tm值）：两个引物之间的Tm值差异最好在2-5C o③避免引物内部或引物之间存在互补序列（3个碱基）④G+ C含量尽量控制在40%-60%之间，4种碱基的分布应尽可能均匀。
尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及T在3 '末端的重复排列。
⑤引物的3 '末端最好是G或G但不要GC连排。
• PCR技术产生污染的主要原因和预防方法？污染原因：1、样本间交叉污染2、PCR试剂污染3、PCR扩增产物污染4、实验室中克隆质粒的污染预防方法：A. 防止污染：试剂小量分装，吸头及EP管一次性使用；器皿及工作区域要分开；无菌操作B、设立对照：阳性对照阴性对照包括：标本对照和试剂对照。
∙∙∙PCR技术有哪些应用？∙∙∙ 2.T/A克隆的基本原理是什么？第九章DNA 序列分析1. 简述化学降解法测序的基本原理以及主要应用范围。
a. 原理：将待测DNA片段的5 ‘端磷酸基团作放射性标记，再分别采用不同的化学方法对特定碱基进行化学修饰并在该位置打断核酸链，从而产生一系列长度不一且分别以不同碱基结尾的DNA 片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过并列点样（lane-by-lane ）的方式用凝胶电泳进行分离，再经放射自显影，即可读出目的DNA的碱基序列。