黑曲霉

黑曲霉的分离筛选

一、实验简介

黑曲霉广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。黑曲霉的最适温度为37℃，黑曲霉对营养要求较低,只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好，实验中采用察氏培养基进行培养。黑曲霉的菌落蔓延迅速，但生长稍局限，菌丝初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色。顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗双层褐色，梗基较短，上长有成串褐黑色的球状分生孢子。孢子直径2.5～4.0μm。分生孢子头球状，直径700～800μm，褐黑色。黑曲霉的个体形态和菌落形态都比较特殊，容易分辨，可利用平板划线法或稀释涂布法，得到单菌落，并结合显微镜检测，多步鉴定、纯化，得到的纯的菌种。

二、实验试剂与材料

1、材料：黑曲霉

2、溶液和试剂：PDA液体与固体培养基、1mol/L氢氧化钠溶液、1mol/L 氯化氢溶液、75%乙醇

3、器材和其他用品：三角瓶、试管、搪瓷杯、无菌培养皿（6组）、接种环、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、试管架、恒温培养箱、牛皮纸（报纸）、pH试纸、移液枪枪头（100ul、1ml各5个）、无菌水（蓝瓶子装100ml,两瓶，灭菌）

三、实验步骤和过程

（一）培养基的准备

1、PDA培养基的制备：按照PDA的配方，称量40.1g样品于大烧杯中，加入去离子水1L，搅拌加热煮沸至完全溶解，测试PH值（待培养基稍冷却后，用精密pH试纸测量培养基的原始pH，若偏酸，用1mol/L NaOH边滴加边搅拌，使之达到（6.0±0.2）。若偏碱，则用1mol/L HCl调节。）

2、分装：用分装装置将培养基装入试管，高度为试管总长的1/5-1/4，共x支。余下培养基转入锥形瓶中，培养基的量为三角瓶容量的1/3-1/2。

3、加塞、包扎、标记：试管加胶塞（封口膜将接口处封紧），一捆包扎好，用玻璃杯装着以固定试管；三角瓶用保鲜膜蓬松的塞住瓶口，并用报纸和线绳包扎好瓶口处。

4、灭菌：121℃，20min高压蒸汽灭菌。

5、斜面培养基制作：待已灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁置在有合适高度的器具上，使培养基斜面长度不超过试管总长的一半为宜。

6、无菌检查：灭菌培养基放入37℃培养箱中一天，若无细菌污染则说明灭菌彻底。

7、培养基放置于冰箱4 ℃保存备用。

（二）黑曲霉菌激活

用接种环从黑曲霉保存斜面培养基，接种于小试管斜面中培养（2支）。然后放37℃培养箱中培养24小时。

（三）黑曲霉菌拓培

用接种环从黑曲霉小试管斜面培养基，接种于锥形瓶PDA液体锥形瓶培养基中，然后37℃浴摇床培养2天（在液体培养基中是没办法观察其生长的状况的）

（四）稀释菌液：用无菌移液枪吸取分别100ul和200ul菌液到100ml的无菌水中稀释，摇床摇动30min.

（五）涂布平板：先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在平板上（每个编号设两个重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，37℃保温培养，观察其生长情况。

（六）平板划线：先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号。左手拿培养皿，右手拿接种环，分别蘸取经过稀释后的菌液，左手抿开培养皿，进行划线造作。（线条尽可能多，但不许交叉，平行划线，规律分布）划线完毕后，盖上培养皿盖，20—30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，37℃保温培养，观察其生长情况。

附：