ScPif1解旋酶的结构与功能研究

ScPif1解旋酶的结构与功能研究

Pif1解旋酶作为一种依赖于ATP供能的DNA解旋酶,广泛分布于原核生物和真核生物体内,在基因组稳定性的维持和核酸代谢调控等方面发挥着重要作用。酿酒酵母Pif1（Saccharomyces cerevisiae Pif1,ScPif1）解旋酶作为Pif1家族中的典型成员,是该家族中被最早鉴定并且深入研究的成员之一。体内研究表明,ScPif1解旋酶参与端粒稳定性的维持、冈崎片段的成熟、DNA复制过程中G4 DNA的解除以及同源重组修复等多种重要代谢途径。体外研究则显示ScPif1同时拥有5’-3’方向的双链DNA、RNA/DNA杂交链以及G4 DNA的解旋活性,其中最为引人注目的是其高效的G4DNA解旋功能,在体内条件下,G4 DNA因其高度的稳定性而成为生物体生理代谢的一大阻碍,ScPif1通过其高效的G4 DNA解旋功能而在多种生理代谢途径中发挥着重要作用。目前,关于ScPif1的研究主要集中在体内或体外的生理生化实验中,对于ScPif1结构的研究则非常有限。本研究针对以上难点,首先采用多序列比对的方式鉴定了ScPif1的解旋核心结构域,并通过二级结构预测的方式,对全长ScPif1蛋白进行了合理的截短设计,通过大肠杆菌表达系统对截短后的

ScPif1^237-780蛋白进行了表达纯化,获得了可用于结晶实验的高纯度蛋白样品,并在随后的结晶实验中获得了多种DNA复合物的晶体,结合硒代蛋白晶体的反常散射数据获得的相位,首次解析了ScPif1解旋核心结构域的高分辨率三维结构。之后,基于解析的晶体结构,本研究综合利用定点突变实验、凝胶过滤层析技术、X射线

小角散射技术、基于荧光各向异性的DNA结合技术、快速停留FRET 技术以及单分子实验技术等多种实验方法对ScPif1的解旋核心结构域的功能机制进行了深入地研究,取得了如下主要成果:1)首次在ScPif1的晶体结构中观察到了可以特异结合ATP的保守Q基序,并通过对该基序的突变实验证实了这类基序的缺失会极大地削弱ScPif1对ATP的特异性识别功能。2)首次通过突变体实验揭示了ScPif1特异性结合DNA的分子机制,即His303和His705选择性的识别DNA而不是RNA。这一发现从结构上解释了ScPif1在体内对端粒酶的移除机制。3)通过对ScPif1多种DNA复合物结构的DNA结合位点分析,首次揭示了ScPif1对鸟嘌呤偏好性的结构基础。ScPif1拥有的这类鸟嘌呤碱基偏好性,使其可以更为有效地进行G4 DNA的解旋。4)首次在ScPif1的结构中发现了一段存在于2B结构域外侧并具有独特折叠模式的2C结构域,并证实了该结构域拥有对ScPif1解旋和易位活性的调控作用。5)首次从晶体结构中成功鉴定出了生物学相关的二聚体形式,并在此基础上提出了一种G4 DNA诱导的ScPif1二聚体形成机制。6)首次在晶体结构中发现了一段潜在的G4 DNA结合位点,并通过突变实验验证了该位点中多个氨基酸参与G4 DNA的特异性结合和解旋活性。从结构上解释了ScPif1所具有的G4 DNA识别机制。综上所述,本论文通过对ScPif1解旋核心结构的深入研究,阐明了ScPif1对多种生理底物的识别机制以及结合底物后的寡聚状态,为进一步理解ScPif1在体内发挥的多种功能提供了理论依据。