ScPif1解旋酶的结构与功能研究
人类重组PIF1解螺旋酶C-末端多肽的纯化及其抗体制备
人类重组PIF1解螺旋酶C-末端多肽的纯化及其抗体制备顾永清;Kenji Kamiya【期刊名称】《农垦医学》【年(卷),期】2008(30)6【摘要】目的:表达纯化人类PIF1解螺旋酶c-末端的338-641氨基酸的多肽PIF338-641,同时用纯化蛋白制备特异抗体.方法:从HeLa细胞的cDNA文库中PCR扩增得到PIF1解螺旋酶c-末端1012-1926的cDNA片段(对应氨基酸338-641),插入N-末端融合有六聚组氨酸的表达载体pET15b产生pET15b-PIF338-641重组质粒,转化RosettaTM2(DE3)感受态细胞,使PIF338-641蛋白在大肠杆菌中表达,用自制的镍亲和柱纯化PIF338-641蛋白,并以纯化蛋白免疫家兔制备抗血清.结果:PIF338-641蛋白在大肠杆菌中成功表达,纯化了PIF338-641蛋白并制备了PIF338-641蛋白抗血清.结论:制备的PIF338-641蛋白抗体能与蛋白发生特异的免疫反应.【总页数】4页(P449-452)【作者】顾永清;Kenji Kamiya【作者单位】石河子大学医学院,新疆石河子,832002;Department of Experimental Oncology,Research Institute for Radiation Biology and Medicine,Hiroshima University,Hiroshima 734-8553,Japan;Department of Experimental Oncology,Research Institute for Radiation Biology and Medicine,Hiroshima University,Hiroshima 734-8553,Japan【正文语种】中文【中图分类】Q814【相关文献】1.组蛋白脱乙酰化酶4N-末端和C-末端片段的原核表达及纯化 [J], 杨洋;覃小翠;刘书虎;黄威;王雪敏2.人CAP1蛋白与PIF1解螺旋酶及其剪接体蛋白的相互作用 [J], 张莹;刘旭;王彬;潘秀颉;杨陟华;周平坤;朱茂祥;顾永清3.酵母双杂交技术筛选人PIF1解螺旋酶相互作用蛋白 [J], 王攀;王建校;李珊珊;刘晓丹;王豫;周平坤;顾永清4.不含氨基末端的PIF1解螺旋酶的纯化和初步功能研究 [J], 顾永清5.人类PIF1蛋白质N-末端多肽的表达纯化和 [J], 顾永清;朴金莲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酶的结构与功能解析降低化学反应活化能的关键
酶的结构与功能解析降低化学反应活化能的关键酶是具有生物催化作用的特殊蛋白质分子，能够加速化学反应的速率。
它们在维持生物体正常代谢过程中发挥着重要的作用。
本文将对酶的结构与功能进行解析，探讨降低化学反应活化能的关键。
一、酶的结构解析酶的结构通常由氨基酸链形成，具有三级结构，也称为原生、二级和三级结构。
原生结构是指蛋白质链的线性序列，由一系列的氨基酸残基组成。
每个氨基酸残基都具有特定的物理和化学性质，这些性质将决定酶的最终结构。
二级结构是指酶蛋白链的局部结构，由氢键和其他非共价键的相互作用稳定。
常见的二级结构包括α-螺旋和β-折叠片等。
这些结构使得蛋白质在水中具有稳定的形状。
三级结构是指酶整体的立体构型，是由原生和二级结构的相互作用形成的。
这些相互作用包括疏水作用、离子键、氢键和范德华力等。
酶的三级结构决定了它的功能和催化活性。
二、酶的功能解析酶能够降低化学反应的活化能，使反应更容易发生。
这种功能主要基于酶分子的活性位点。
活性位点是酶分子上能够与底物结合并催化反应的区域。
酶和底物之间通过亲和力相互作用，形成酶底物复合物，从而引发化学反应。
酶的功能解析需要重点关注酶催化机理，常见的酶催化机理包括酸碱催化、共价催化和金属离子参与等。
1. 酸碱催化：酶可以提供氢离子或接受氢离子，从而改变底物分子的电荷或能级。
这样一来，底物分子之间的相互作用就会发生变化，从而促使反应发生。
2. 共价催化：酶能够通过与底物形成临时的共价键来改变反应的速率。
酶与底物形成的共价中间体能够降低反应的活化能，加速反应的进行。
3. 金属离子参与：一些酶需要金属离子作为辅助因子来发挥功能。
金属离子能够和底物或酶分子形成复合物，从而改变反应的速率。
三、降低化学反应活化能的关键降低化学反应的活化能是酶的重要功能之一，其关键在于酶的亲和力和催化机制。
首先，酶通过与底物形成亲和力相互作用，使底物能够稳定地结合在酶的活性位点上。
这就使底物分子更容易接近并与其它底物分子发生反应。
酵母双杂交技术筛选人PIF1解螺旋酶相互作用蛋白
酵母双杂交技术筛选人PIF1解螺旋酶相互作用蛋白王攀;王建校;李珊珊;刘晓丹;王豫;周平坤;顾永清【摘要】目的应用酵母双杂交技术研究筛选与人类PIF1解螺旋酶相互作用的蛋白.方法应用酵母双杂交技术,以人PIF1蛋白PINT功能域(1～180氨基酸)和解螺旋酶模序(167～926氨基酸)为诱饵,与HeLa细胞cDNA文库杂交,筛选能与人PIF1蛋白不同功能域相互作用的蛋白.结合生物信息学分析,一对一酵母回复性杂交及β-galactosidase实验等确定阳性克隆.结果 PIF1蛋白PINT功能域杂交共获得17个阳性克隆,生物信息学分析有3个阳性基因,它们分别是CCNDBP1、OTUD5、CAP1.而PIF1蛋白解螺旋酶模序未获得阳性克隆.结论 PIF1蛋白的PINT功能域对调控PIF1的生理功能具有非常重要的作用.【期刊名称】《西安交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2013(034)005【总页数】4页(P595-598)【关键词】人PIF1解螺旋酶;PINT功能域;酵母双杂交;蛋白质相互作用【作者】王攀;王建校;李珊珊;刘晓丹;王豫;周平坤;顾永清【作者单位】军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京,100850;石河子大学医学院,新疆石河子,832003;石河子大学医学院,新疆石河子,832003;石河子大学医学院,新疆石河子,832003;军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京,100850;军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京,100850;军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京,100850;军事医学科学院放射与辐射医学研究所,北京,100850;石河子大学医学院,新疆石河子,832003【正文语种】中文【中图分类】Q78解螺旋酶是催化DNA双链解开的酶，几乎参与包括DNA复制、转录、重组修复等所有的核酸代谢过程，在生物体内具有重要的生理功能。
一些解螺旋酶的突变会导致人类遗传病，包括着色性干皮肤病、Werner综合征、Bloom综合征等［1］。
Pif1解旋酶家族功能的研究进展王攀
解螺旋 酶 在 所 有 生 物 体 都 广 泛 存 在，参 与 几 乎 所有的核酸代谢过程。Pif1 解旋酶家族存在于所有 的真核生物中，具有 5'-3'方向活性，且依赖 ATP。解 旋酶根据其模序不同可分为超级家族Ⅰ和Ⅱ，Pif1 解 旋酶家族属于超级家族Ⅰ。1983 年，酿酒酵母 Pif1 基因被分离出来［1］，并且最终确定酿酒酵母 Pif1 蛋 白（ ScPif1） 为解旋酶［2］，对解旋酶 Pif1 家族的研究主 要集中在其维持细胞核和线粒体基因组稳定性方面 的作用。在 酵 母 菌、寄 生 虫 及 哺 乳 动 物 中 均 有 对 ScPif1 和其同源蛋白的研究。 1 酿酒酵母 Pif1 蛋白
ScPif1 在细胞核的功能主要有： 在双链断裂添加 端粒重复序列，抑制端粒酶［5，8］参与 G-四链 DNA 的 形成［9-10］，参与冈崎片段的成熟［11］，阻断 rDNA 的复 制［12］。在线粒体的功能主要是维持野生型 mtDNA 的稳定［13-17］。 2 酿酒酵母 Rrm3 蛋白
酿酒酵母 Rrm3 蛋白是在筛选影响 rDNA 重组的 基因时首次发现的［18］。酿酒酵母 Rrm3 蛋白突变导 致有丝分裂重组刺激，不仅在 rDNA，也包括部分其 他串联重复位点（ 如 CUP1 基因就不是 Ty 成分） 。后 来发现，酿酒酵母 Rrm3 基因突变位于 tRNA 基因上 游时能够使 Ty1 的流动性增加 100 倍［19］，最近研究 表明，这 种 现 象 取 决 于 特 定 的、稳 定 的、能 影 响 复 制 叉进程的蛋白质复合物［18］。在维持核基因组稳定的 作用中，酿酒酵母 Rrm3 基因作为复制体组分可能靠 它的催化活 性 催 进 复 制 叉 运 动，在 复 制 叉 破 坏 稳 定 的蛋白-DNA 复合结构中起作用。 3 裂殖酵母 SpPfh1
人类重组PIF1解螺旋酶C-末端多肽的纯化及其抗体制备
【 摘要 】 目的 ： 表达纯化人类 Ｐ １ Ｉ 解螺旋酶 Ｃ 末端 的 ３８ ６１ Ｆ 一 ３ — ４ 氨基 酸的多肽 ＰＦ Ｉ ３ ， 同时用 纯化蛋 白制备
１ 材 料 与 方 法
１ １ 所用 菌 株 与 质 粒 ．
Ｒ ｓｔ ０ｅ
构 建 Ｐ Ｉ
表 达 重 组 体
的 质 粒 为 ｐ Ｔ ５ （ ｏａｅ ） 表 达 菌 株 为 Ｅ ｃｌ Ｅ １ ｂ Ｎ ｖｇｎ ， ． ｏｉ
２ Ｄ ３ （ ｏａｅ ） （ Ｅ ） Ｎ ｖｇｎ 。
体 ＰＦ 蛋白参与线粒体 Ｄ Ａ的重组及线粒体 Ｄ Ａ Ｉ１ Ｎ Ｎ 的稳 定 ＿ ， 粒体 ＰＦ 蛋 白缺 失 可导 致 酵母 失 去 线 ２线 ｊ ＩＩ 粒体 Ｄ Ａ并使 Ｄ Ａ的修复受阻。线粒体 Ｐ １ 白 Ｎ Ｎ Ｉ 蛋 Ｆ 与碱 基 切 除 修 复 蛋 白共 同 作 用 ， 以拮 抗 线 粒 体 可 Ｄ Ａ 自发 的氧化损 伤 ，， 于 或 防止 双 链 Ｄ Ａ断 Ｎ ４参 ｊ Ｎ
２０ ０ ８年 １ ２月
农
垦
医
学
Ｄｅ ２ ８ ｃ． ０ｏ
第３ ０卷 ｎ ｋ ｎ Ｍｅ ｉｉ ｅ ｏｒ ｌ ｆ ｎ Ｎｏ ｇ ｅ ｄ ｃｎ
Ｖ０ ． ０ Ｎｏ． １３ ６
论著 ・
人 类 重 组 ＰＦ 解 螺 旋 酶 Ｃ一末 端 多 肽 的纯 化 Ｉ１ 及 其 抗 体 制备
因的 １１ ０２—１２ ９６的 ｃＮ Ｄ Ａ片 段 （ 应 氨 基 酸 ３８— 对 ３ ４ ） ６１ 。经 Ｄ Ａ测序 证 明序列 正 确 后 ， 入 带 有六 聚 Ｎ 插 组氨 酸 的融 合 表 达 载 体 ｐ Ｔ ５ Ｎ ｖｇｎ ， 生 重 Ｅ １ｂ（ ｏａｅ） 产
用酵母双杂交技术筛选PIF1解螺旋酶的相互作用蛋白
用酵母双杂交技术筛选PIF1解螺旋酶的相互作用蛋白引言在细胞中，蛋白质之间相互作用是维持生命活动正常进行的重要基础。
因此，研究蛋白质的相互作用关系对于了解生物学过程的调控机制以及疾病发生发展具有重要意义。
酵母双杂交技术（yeast two-hybrid，Y2H）是一种重要的蛋白质相互作用筛选技术，已被广泛应用于生物学研究。
本文将介绍酵母双杂交技术在筛选PIF1解螺旋酶的相互作用蛋白中的应用。
PIF1解螺旋酶简介PIF1解螺旋酶是一种高度保守的DNA螺旋酶家族成员，广泛存在于真核生物中。
该酶在DNA复制和DNA损伤修复等生物学过程中发挥着重要作用。
具体来说，PIF1解螺旋酶可以解旋DNA双链结构，促进DNA复制过程的进行。
此外，它还参与单链断裂修复和基因组稳定性的维持等功能。
PIF1解螺旋酶的相互作用蛋白筛选为了揭示PIF1解螺旋酶在细胞中的功能调控机制，研究者可以利用酵母双杂交技术筛选出与其相互作用的蛋白质。
以下是筛选过程的具体步骤。
第一步：构建Y2H载体酵母双杂交技术涉及到两个重要的载体：pGBKT7和pGADT7。
其中，pGBKT7负责编码DNA结合域（DNA binding domain，BD）和目标蛋白的融合蛋白，而pGADT7则负责编码激活域（activation domain，AD）和候选蛋白的融合蛋白。
在本研究中，研究者将PIF1解螺旋酶的编码序列克隆到pGBKT7载体中，从而获得PIF1-BD融合蛋白。
第二步：构建基因文库基因文库是由大量表达了细胞中的蛋白质编码序列的DNA片段构成。
在酵母双杂交筛选中，构建一个与PIF1-BD融合蛋白进行相互作用的候选蛋白文库非常关键。
一般通过提取细胞中RNA，合成cDNA，将其与载体pGADT7连接而得到候选蛋白文库。
第三步：酵母转化与筛选将PIF1-BD载体和候选蛋白文库共同转化到酿酒酵母细胞中，通过培养在选择性培养基上进行筛选。
在这个过程中，只有与PIF1-BD融合蛋白发生相互作用的融合蛋白才能启动报告基因的表达，从而使细菌在选择性培养基上生长。
解旋酶
不同生物解旋酶的氨基酸序列分析发现它们有9 个高度保守的序列，分别称为Q、I、Ia、Ib、II、III、IV、V 和VI（Fairman-Williams et al., 2010）（图1-2），这说明所有的解旋酶可能起源于相同的基因。
这些保守区域是ATP 酶、解旋酶活性以及NTP 和DNA 结合的功能区。
其中基序Ia 区通常是GTP 和ATP 结合区；Ⅱ区是ATP 结合蛋白B 区的特殊翻版；I 区可形成一套索结构与NTP 磷酸结合，其结构属ATP 结合蛋白的A区；而Ⅱ区保守的天冬氨酸与镁离子介导的磷酸结合有关；Ia 以及Ⅵ区的保守酪氨酸与可能的DNA 结合蛋白相关，提示涉及多核苷酸的结合；基序VI 则参与ATP 磷酸盐的结合；其他的基序（Ia、Ib、IV、V）则参与RNA 结合以及通过RNA 结合激活ATP 水解的活性；III 是RNA 解旋酶活性必需的结构。
依据以上Motif 的不同，真核生物的解旋酶分为两个大家族Helicase superfamily I和II （SFI 和SFII）（图1-3），其中多数RNA 解旋酶属于SFII，少数属于SFI（Fairman-Williams et al., 2010）。
SFI 一般是真菌中的解旋酶；高等植物、酵母、动物中一般都是SFII，它又分为DEAD-box、DEAH-box、DExH、RecQ 和SW1/SNF。
解旋酶SF1 和SF2 的家族分类，引自Fairman-Williams et al., 2010Figure1-5, Helicase SF1 and SF2 family classification .2006 年，RIKEN 基因组科学中心、冈崎研究所的研究人员发现，果蝇DEAD-boxprotein Vasa 的催化核的结构，该催化核与一个单链RNA 和一个ATP 类似物形成复合体。
ATP 类似物紧密与这两个结构域结合，并使他们变成更为紧密的形式，而且保守残基间发生域间相互作用。
拓扑异构酶i和ii名词解释
拓扑异构酶i和ii名词解释拓扑异构酶I和II名词解释导论在人类体内，存在着一种重要的酶类物质，被称为拓扑异构酶，它在维持DNA的结构和功能中起着至关重要的作用。
本文将对拓扑异构酶I和II进行详细解释，并分析它们在细胞中的功能和影响。
一、拓扑异构酶I的定义和特点1.1 定义拓扑异构酶I（Topoisomerase I）是一种能够介导DNA断裂和连接的酶，它能够调节DNA的拓扑结构，维持DNA的超螺旋状态。
该酶通过在DNA链上切割，松弛或整合 DNA 的连结，帮助细胞进行染色体复制、转录和重组。
1.2 功能拓扑异构酶I具有以下几个主要功能：（1）解旋：在DNA复制和转录过程中，DNA链的双螺旋结构需要解开，以使DNA聚合酶获得访问基因序列的机会。
拓扑异构酶I能够切割一个DNA链未配对部分的DNA，减小其超螺旋的紧张程度，从而实现DNA的解旋。
（2）断链：拓扑异构酶I能够切割DNA链中的磷酸二酯键，从而在DNA链上产生一个短暂的断裂。
这对于染色体重组和机械性拓扑学变化等过程至关重要。
（3）连接：拓扑异构酶I不仅能够断裂DNA链，还能够在适当的时间和位置上重新连接它们，以确保DNA链的完整性。
1.3 影响拓扑异构酶I的功能异常或缺陷可能导致多种疾病的发生和发展。
在肿瘤细胞中，拓扑异构酶I的活性增强可能导致DNA拓扑结构的不稳定，从而促进染色体异常和癌症的发生。
一些抗肿瘤药物，如喜树碱，通过抑制拓扑异构酶I的活性，阻碍了肿瘤细胞的DNA复制和修复，进而抑制了肿瘤细胞的生长和扩散。
二、拓扑异构酶II的定义和特点2.1 定义拓扑异构酶II（Topoisomerase II）是一种双链DNA分子的切割和连接酶，它在DNA复制和细胞分裂中发挥着关键作用。
拓扑异构酶II 可以解开DNA双链，对染色体进行结构改变，并帮助维持染色体的拓扑构型。
2.2 功能拓扑异构酶II的功能主要包括：（1）DNA切割：拓扑异构酶II能够切割DNA的两个链，并且在需要的时候重新连接这些链。
非洲猪瘟病毒解旋酶结构与功能研究进展
中P兽医科学 2021,51(02):135-143Chinese Veterinary Science网络首发时间：2020-12-18 DOI:10•16656/j.issn.1673-4696.2021.0028 中图分类号：S852.659.1文献标志码：A文章编号：1673-4696(2021)02-0135-09非洲猪瘟病毒解旋酶结构与功能研究进展张婷，申超超，杨博，张大俊，侯景，史喜绢，崔卉梅，张克山*，郑海学*，刘湘涛(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室，甘肃兰州730046)摘要：目前对非洲猪瘟病毒(ASFV)编码的5个解旋酶（〇11331^、〇?50礼、〇7061、89621^和八859匕）的结构和功能知之甚少，了解ASFV解旋酶结构和功能有助于明确ASFV致病机制。
本文通过结合生物信息学 的方法综述了 ASFV解旋酶的结构和功能的研究进展，从解旋酶的角度加深了对该病毒复制调控的认识^ 关键词：#洲猪瘟病毒；解旋酶；功能；结构预测；研究进展Research advances on the structure and function ofAfrican swine fever virus helicasesZHANG Ting,SHEN Chao-chao, YANG Bo，ZHANG Da-jun，H0U Jing，SHI Xi-juan，CUI Hui-mei，ZHANG Ke-shan*，ZHENG Hai-xue*，LIU Xiang-tao{National Foot-and-Mouth Disease Reference Laboratory .State Key Laboratory oj Veterinary Etiological Biology,Lanzhou Veterinary^ Research Institute of Chinese Academy of A griculture Science .Lanzhou 130046, China)Abstract：At present,The structure and function of the five helicases encoded by African swine fever virus (ASFV) (D1133L,QP509L,Q706L,B962L and A859L) are acquaint scarcely. To understand the structure and function of ASFV helicase will help to indicate the pathogenesis of ASFV. In this review,the advance structure and function of ASFV helicases were reviewed and analyzed by bioinformatics methods. From the point of view of helicase,we have deepened our understanding of the regulation of virus replication.Key words：African swine fever virus ；helicase；function；structural predict ion ；research advances * Corresponding authors:ZHANG Ke-shan,E-mail ：zks009@126. com；ZHENG Hai-xue,E-mail ：zhenghaix- **********非洲猪瘍病毒（African swine fever virus，ASFV)首次在肯尼亚被发现并报道'非洲猪瘟病毒是双 链DNA病毒，ASFV的衣壳结构属于二十面体对 称。
recqdna解旋酶结构与功能及其相互关系的研究
recqdna解旋酶结构与功能及其相互关系的研究【序号1】recqdna解旋酶结构与功能及其相互关系的研究在现代生命科学领域，DNA修复和重组是一个备受关注的研究方向。
recqdna解旋酶是这一领域中的重要分子，它在DNA修复和重组过程中发挥着关键的作用。
为了更好地理解recqdna解旋酶的结构、功能和其与其他分子的相互关系，科学家们进行了广泛而深入的研究。
本文将从简单到复杂、由表及里地介绍recqdna解旋酶，并探讨其结构和功能以及与其他分子的相互作用。
【序号2】recqdna解旋酶是一种拥有重要生物学功能的酶。
在DNA 修复和重组过程中，它起到了解旋双链DNA的关键作用。
研究表明，recqdna解旋酶在细胞中具有多种功能，包括DNA损伤修复、染色体稳定性维持和基因组稳定性的维护等。
这些功能使得recqdna解旋酶在生物体内发挥着重要的生物学作用。
【序号3】关于recqdna解旋酶的结构研究，科学家们发现，其结构由多个功能模块组成。
其中包括一个N末端单链结合模块、一个内旋酶模块和一个ATP酶活化模块。
这些模块相互作用并协同工作，形成了recqdna解旋酶的完整结构。
通过解析recqdna解旋酶的结构，我们可以更好地理解其功能和与其他分子的相互关系。
【序号4】recqdna解旋酶在DNA修复和重组过程中的功能主要有两个方面：一是识别和结合双链DNA上的损伤位点，二是通过解旋酶活性将损伤的DNA链进行解卷。
识别和结合损伤位点的过程中，recqdna解旋酶通过其N末端单链结合模块与DNA发生相互作用，从而将其定位于损伤位点。
而解旋酶活性则是通过其内旋酶模块和ATP酶活化模块的协同作用实现的。
这两个功能的发挥使得recqdna解旋酶能够高效地修复和重组DNA。
【序号5】recqdna解旋酶还与其他分子之间存在相互作用和相互调节的关系。
研究表明，recqdna解旋酶可以通过与其他DNA结合蛋白、核酸修复酶和修饰酶等发生相互作用来调节其功能。
一种嗜热菌Pif1解旋酶的表达纯化及活性分析
一种嗜热菌Pif1解旋酶的表达纯化及活性分析赵正阳;刘娜女;李海红;奚绪光;范三红【摘要】[目的]利用大肠杆菌表达纯化嗜热脱铁去硫弧菌(De erribacter desul uricans)解旋酶DePif1,并对其结合与解旋DNA的活性进行分析,为Pif1家族解旋酶结构和功能的阐明奠定基础.[方法]将促溶标签SUMO编码序列和人工合成的DePif1解旋酶编码序列依次连人pET15b载体,获得重组融合表达载体pET15b-SUMO-De-Pif1,然后将其导入E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达;利用Ni-NTA 亲和层析柱获得融合蛋白,SUMO蛋白酶酶切去除融合标签,再经Heparin和Ni-NTA柱分离获得无标签的纯化重组DePif1蛋白;采用荧光各向异性分析,研究pH 和NaCl浓度对DePif1与DNA结合的影响及DePif1与不同底物(单链DNA、双链DNA和G4-DNA)的结合特性;使用基于荧光共振能量转移的stopped-flow技术,分析DePif1对不同底物(G4-DNA with 5'26 nt tail和dsDNAwith 5'26 nt tail)的解旋活性.[结果]每升菌液可获得9 mg纯度大于95％的DePif1解旋酶.DePif1结合不同DNA底物的强度依次为G4-DNA＞单链DNA＞双链DNA,其对G4-DNA的解旋活力大于双链DNA.[结论]成功表达并纯化了嗜热脱铁去硫弧菌Pif1解旋酶,并证明其具有特异的G4-DNA结合和解旋能力.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(044)001【总页数】8页(P169-176)【关键词】嗜热脱铁去硫弧菌;Pif1解旋酶;G4-DNA;表达纯化;解旋活性【作者】赵正阳;刘娜女;李海红;奚绪光;范三红【作者单位】西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】Q71解旋酶是生物体内一类参与几乎所有核酸代谢过程的分子马达，通常能结合并水解ATP，并利用水解释放的能量打开核酸双链间的氢键，为复制、转录、修复和重组等过程提供单链模板或反应中间物[1]。
Pif1解旋酶家族功能的研究进展
Pif1解旋酶家族功能的研究进展王攀【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2013(19)2【摘要】Helicases are ubiquitous enzymes found in all organisms necessary for all ( or virtually all) aspects of nucleic acid metabolism. The Pifl helicase family is a group of 5'-3'directed, ATP-dependent, found in nearly all eukaryotes. Here is to make a review on the discovery, evolution, and currently known facts about these enzymes in Saccharomyces cerevisiae( ScPifl and ScRrm3 ), Schizosaccha-romyces pombe ( SpPfhl ), Trypanosoma brucei( Tbplel ,2,5, and 8 ), mice ( mPif1 ), and humans( hPif1 ). Pifl helicases variously affect telomeric, ribosomal, and mitochondrial DNA replication, as well as Okazaki fragment maturation , and in at least some cases affect these processes by using their helicase activity to disrupt stable nucleo-protein complexes. While the functions of these enzymes vary within and between organisms, it is evident that Pifl family helicases are crucial for both nuclear and mitochondrial genome maintenance.%解旋酶是一种所有生物体都广泛存在的酶,对于几乎所有的核酸代谢都是必需的.Pif1解旋酶家族存在于所有的真核生物,是5'-3'方向依赖ATP的解旋酶.Pif1解旋酶影响端粒、核糖体和线粒体的DNA复制以及冈崎片段的成熟,其影响机制很多是利用其解螺旋活性破坏核蛋白复合体的稳定性.不同的生物Pif1解旋酶功能不同,但其对细胞核和线粒体基因组稳定性的维持是非常重要的.目前已知,酿酒酵母(ScPif1和ScRrm3)、裂殖酵母(SpPfh1)、布氏锥虫(TbPIF1、2、5、8)、小鼠(mPif1)和人类(hPif1)均属于Pifl解旋酶家族,现对上述Pifl解旋酶进行综述.【总页数】3页(P219-221)【作者】王攀【作者单位】新疆石河子大学医学院,新疆,石河子,832000【正文语种】中文【中图分类】R34;R55【相关文献】1.厌氧棒菌Pif1解旋酶的表达纯化及解旋条件优化 [J], 郭海磊;刘娜女;段晓雷;奚绪光2.一种嗜热菌Pif1解旋酶的表达纯化及活性分析 [J], 赵正阳;刘娜女;李海红;奚绪光;范三红3.嗜热厌氧杆菌 Ana. Pif1解旋酶核心结构域蛋白与DNA底物结合的反应特性[J], 段晓雷;许欢;姚淼;曾洁;申丽;刘娜女;张涛;肖代敏;;;;;;;;;4.ATP依赖性染色质域解旋酶DNA结合蛋白家族在肿瘤发病中作用的研究进展[J], 罗嘉欣;陈晓铭;郭润民5.脆弱拟杆菌Pif1解旋酶的表达纯化与晶体生长 [J], 曹汝菲;李泽轩;许欢;张莎;张敏敏;戴枫;段晓雷因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
解旋酶-引物酶
解旋酶-引物酶的相互作用来调控细菌DNA复制的引发和子链DNA的合成众所周知，细菌DNA的复制是半保留半不连续的，其中复制体在DNA复制中发挥重要的作用，其主要组成是解旋酶和引物酶，两种酶构型的不同决定了它们结合方式的特异性。
首先解旋酶是一个同源六聚环，每个亚基含有两个主要的功能域，C端与ATP酶活性和成环有关，能有效的维持其空间结构，同时又能解决解链过程中耗能的问题，N端主要是与引物酶结合。
其次引物酶含有三个独立的功能域，N端的锌结合域主要是识别模板DNA 的三核苷酸起始位点,C端主要是与解旋酶N端结合，中间的区域主要是RNA聚合酶的结合域，指导引物的合成。
目前两种酶的相互作用主要有三种不同的形式，第一种是借助于相对敏感度方法测得二者之间是一种非共价的不太稳定的结合，第二种是凝胶过滤法测得二者之间是一种非共价但稳定的结合，第三种是二者之间的结合域共价结合形成单一多肽链。
采用不同的方法探究得知单个解旋酶与多个引物酶结合。
例如ITC等温滴定量热法的体外实验研究蛋白质与蛋白质间的相互作用，这种方法通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续、准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，原位、在线和无损伤地同时提供热力学和动力学信息。
其次用超速离心和凝胶过滤技术分析嗜热脂肪菌的两种酶的复合体。
最后对大肠杆菌的两种酶复合体借助荧光各相异性和交联凝胶过滤分析同样支持以上观点，其中荧光各向异性是一个与荧光偏振有关的物理量, 它描述荧光分子对时间平均的旋转运动, 从而反映生物大分子的形状、大小以及分子在溶液中的转动，可以用于研究蛋白质间的相互作用，例如相关文献，荧光各向异性法研究有机小分子与血清白蛋白的结合作用。
目前关于二者复合物对复制的作用主要有两种观点，第一是二者的结合增加了单链DNA的局部浓度，第二是临近引物酶亚基间的协同作用。
主要是引物酶的锌结合域与邻近的引物酶的RNA聚合酶结合域结合发挥作用，同时在复制叉处结合解旋酶表达其活性，启动冈崎片段的生成，它在DNA损伤区链缺口处研究的比较清楚。
解螺旋酶和拓扑异构酶
解螺旋酶和拓扑异构酶蛋白质是生物体内功能最为重要的分子之一，它们在细胞的结构和功能中起着关键作用。
在蛋白质的折叠过程中，解螺旋酶和拓扑异构酶扮演着重要的角色。
本文将分别介绍解螺旋酶和拓扑异构酶的特点和功能。
解螺旋酶是一类酶，主要作用是将蛋白质中的螺旋结构解开。
蛋白质的折叠过程中，螺旋结构的形成对于蛋白质的稳定性和功能至关重要。
然而，在某些情况下，螺旋结构的形成可能会受到一些外界因素的干扰，导致蛋白质无法正常折叠。
这时，解螺旋酶就会发挥作用，通过将螺旋结构解开，使蛋白质恢复到正确的折叠状态。
解螺旋酶在细胞中广泛存在，它们可以通过识别特定的螺旋结构并结合到蛋白质上，然后通过水解酶活性将螺旋结构解开。
解螺旋酶的活性对于维持蛋白质结构的稳定性和功能的正常发挥具有重要意义。
拓扑异构酶是另一类重要的酶，它们主要作用是调整蛋白质的拓扑结构。
蛋白质的拓扑结构是指蛋白质中各个残基之间的连接方式和空间排布。
在蛋白质的折叠过程中，拓扑结构的正确形成对于蛋白质的稳定性和功能至关重要。
然而，由于各种原因，蛋白质的拓扑结构可能会发生错误，导致蛋白质无法正常折叠。
这时，拓扑异构酶就会发挥作用，通过调整蛋白质的拓扑结构，使蛋白质恢复到正确的折叠状态。
拓扑异构酶在细胞中广泛存在，它们可以通过酶活性将蛋白质中的键断裂或重新连接，从而调整蛋白质的拓扑结构。
拓扑异构酶的活性对于维持蛋白质结构的稳定性和功能的正常发挥具有重要意义。
解螺旋酶和拓扑异构酶在细胞中起着互补的作用。
解螺旋酶主要负责蛋白质中螺旋结构的解开，而拓扑异构酶主要负责蛋白质的拓扑结构调整。
在蛋白质的折叠过程中，解螺旋酶和拓扑异构酶相互配合，使蛋白质能够正确地折叠成功能性的形态。
这一过程对于维持细胞内蛋白质的正常结构和功能至关重要。
总结起来，解螺旋酶和拓扑异构酶是细胞中两类重要的酶，它们在蛋白质的折叠过程中发挥着关键的作用。
解螺旋酶主要负责将螺旋结构解开，而拓扑异构酶主要负责调整蛋白质的拓扑结构。
解旋酶的结构,功能与人类疾病
解旋酶的结构,功能与人类疾病
孙逸琥;焦新福
【期刊名称】《国外医学：遗传学分册》
【年(卷),期】1998(021)006
【摘要】解旋酶细胞内参与ＤＮＡ复制，围录，修复，重组以及ＲＮＡ拼接，核糖体组装，在转录和蛋白质翻译过程中也起关键和用。
本文主要阐述解决酶的结构，功能，作用机制的研究进展以及解旋酶缺陷疾病。
【总页数】5页(P289-293)
【作者】孙逸琥;焦新福
【作者单位】上海第二医科大学附属瑞金医院;上海第二医科大学附属瑞金医院【正文语种】中文
【中图分类】Q55
【相关文献】
1.人类RecQ解旋酶在DNA损伤修复通路中的作用 [J], 肖芸;张爱华
2.丙酸睾酮对大肠杆菌RecQ解旋酶结构和功能的影响 [J], 段丽霞;许厚强;陈祥;
骆衡
3.人类女性乳晕区生理解剖结构的新功能--经乳晕透皮吸收给药治疗乳房疾病 [J], 张健;刘连新;李爱东;宋春芳;姜洪池;杨志杰;高峰
4.非洲猪瘟病毒解旋酶结构与功能研究进展 [J], 张婷;申超超;杨博;张大俊;侯景;史喜绢;崔卉梅;张克山;郑海学;刘湘涛
5.封闭蛋白的结构、功能及其与人类疾病 [J], 颜昊;霍正浩
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鞘氨醇-1-磷酸裂解酶的生化特性、生物学功能及在肝脏疾病中的作用
鞘氨醇-1-磷酸裂解酶的生化特性、生物学功能及在肝脏疾病中的作用发表时间：2019-11-07T15:33:12.833Z 来源：《中国医学人文》(学术版)2019年第10期作者：章敬1 肖娟1 金俊飞1，2，3（通讯作者）[导读] 在今后的工作中，我们将深入研究SPL及相关下游信号在肝脏疾病中的作用及机制，为肝脏疾病的治疗提供新的方法。
1桂林医学院附属医院肝胆胰外科实验室广西桂林 541001；2桂林医学院广西肝脏损伤与修复分子医学重点实验室广西桂林 541001；3桂林医学院中美健康与疾病脂质研究中心广西桂林 541001【摘要】鞘氨醇-1-磷酸裂解酶（SPL）是一种广泛表达的酶，其催化信号分子鞘氨醇-1-磷酸的不可逆裂解，产生脂肪醛（十六碳烯醛）和磷酸乙醇胺。
有文献报道SPL在多种癌症及缺血再灌注损伤中都有不同程度的作用，而其在肿瘤细胞中的作用因细胞类型和肿瘤类型的不同而不同。
本文就SPL的生物学功能及其在肝脏疾病的作用进行综述。
【关键词】鞘氨醇-1-磷酸裂解酶；鞘氨醇-1-磷酸；肝脏疾病Abstract：Sphingosine-1-phosphate lyase（SPL）is a widely expressed enzyme that catalyzes the irreversible cleavage of the signaling molecule sphingosine-1-phosphate to produce fatty aldehydes（hexadecenal）and phosphoethanolamine. It has been reported that SPL influences cancer or ischemia-reperfusion injury to some extent. Meanwhile，the roles of SPL in tumor depend on cell type and tumor type. This article summarizes the biological functions of SPL and its role in liver disease.Key words：Sphingosine-1-phosphate lyase；Sphingosine-1-phosphate；Liver diseases近年来，越来越多的研究发现神经鞘脂（Sphingolipid）及其代谢物在肿瘤的发生发展过程起重要作用。
嗜热厌氧杆菌 Ana. Pif1解旋酶核心结构域蛋白与DNA底物结合的反应特性
嗜热厌氧杆菌 Ana. Pif1解旋酶核心结构域蛋白与DNA底物结合的反应特性段晓雷;许欢;姚淼;曾洁;申丽;刘娜女;张涛;肖代敏【期刊名称】《贵州医科大学学报》【年(卷),期】2018(043)011【摘要】目的：探究嗜热厌氧杆菌的 Ana. Pif1解旋酶核心结构域蛋白（ Ana. Pif1-HD）与DNA底物结合的反应特性。
方法：利用DNAman、CluxtalX等软件，对 Ana. Pif1的核心结构域蛋白进行系统进化树分析与同源序列比对； Ana. Pif1-HD表达载体构建后转入大肠杆菌进行原核表达，并通过Ni-NTA、SUMO 酶切、S200分子筛等层析柱纯化获得 Ana. Pif1-HD蛋白；利用Stopped-flow FRET技术监测 Ana. Pif1-HD蛋白的解旋活性，利用荧光偏振检测技术分析 Ana. Pif1-HD与不同长度、不同结构DNA底物的结合反应各向异性值，并进行拟合分析与统计。
结果： Ana. Pif1的核心结构域蛋白为靠近N-端的448氨基酸，通过原核表达与纯化获得纯度为97%、浓度为 5 g/L 的 Ana. Pif1-HD蛋白，并利用Stopped-flow FRET与荧光偏振等技术验证其具有 Ana. Pif1全长蛋白90%的解旋活性与95%的结合活性； Ana. Pif1-HD的最佳结合反应条件是42 ℃在pH 6.0含20 mmol/L NaCl及 3 mmol/L MgCl 2的溶液中进行； Ana. Pif1-HD与不同长度ssDNA底物结合时的解离速率常数递增，并明确其ssDNA的binding-size为10.34 nt；研究首次揭示 Ana. Pif1-HD与不同复制中间体DNA结合反应的底物特异性ss-G4 DNA〉G4 DNA〉3′-ssDNA-dsDNA ≈ Y-型〉其它底物。
结论：成功表达纯化具有全长活性的 Ana. Pif1解旋酶核心结构域蛋白，首次揭示该解旋酶核心蛋白与各类不同DNA底物的结合反应特性。
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ScPif1解旋酶的结构与功能研究
Pif1解旋酶作为一种依赖于ATP供能的DNA解旋酶,广泛分布于原核生物和真核生物体内,在基因组稳定性的维持和核酸代谢调控等方面发挥着重要作用。
酿酒酵母Pif1（Saccharomyces cerevisiae Pif1,ScPif1）解旋酶作为Pif1家族中的典型成员,是该家族中被最早鉴定并且深入研究的成员之一。
体内研究表明,ScPif1解旋酶参与端粒稳定性的维持、冈崎片段的成熟、DNA复制过程中G4 DNA的解除以及同源重组修复等多种重要代谢途径。
体外研究则显示ScPif1同时拥有5’-3’方向的双链DNA、RNA/DNA杂交链以及G4 DNA的解旋活性,其中最为引人注目的是其高效的G4DNA解旋功能,在体内条件下,G4 DNA因其高度的稳定性而成为生物体生理代谢的一大阻碍,ScPif1通过其高效的G4 DNA解旋功能而在多种生理代谢途径中发挥着重要作用。
目前,关于ScPif1的研究主要集中在体内或体外的生理生化实验中,对于ScPif1结构的研究则非常有限。
本研究针对以上难点,首先采用多序列比对的方式鉴定了ScPif1的解旋核心结构域,并通过二级结构预测的方式,对全长ScPif1蛋白进行了合理的截短设计,通过大肠杆菌表达系统对截短后的
ScPif1<sup>237-780</sup>蛋白进行了表达纯化,获得了可用于结晶实验的高纯度蛋白样品,并在随后的结晶实验中获得了多种DNA复合物的晶体,结合硒代蛋白晶体的反常散射数据获得的相位,首次解析了ScPif1解旋核心结构域的高分辨率三维结构。
之后,基于解析的晶体结构,本研究综合利用定点突变实验、凝胶过滤层析技术、X射线
小角散射技术、基于荧光各向异性的DNA结合技术、快速停留FRET 技术以及单分子实验技术等多种实验方法对ScPif1的解旋核心结构域的功能机制进行了深入地研究,取得了如下主要成果:1)首次在ScPif1的晶体结构中观察到了可以特异结合ATP的保守Q基序,并通过对该基序的突变实验证实了这类基序的缺失会极大地削弱ScPif1对ATP的特异性识别功能。
2)首次通过突变体实验揭示了ScPif1特异性结合DNA的分子机制,即His303和His705选择性的识别DNA而不是RNA。
这一发现从结构上解释了ScPif1在体内对端粒酶的移除机制。
3)通过对ScPif1多种DNA复合物结构的DNA结合位点分析,首次揭示了ScPif1对鸟嘌呤偏好性的结构基础。
ScPif1拥有的这类鸟嘌呤碱基偏好性,使其可以更为有效地进行G4 DNA的解旋。
4)首次在ScPif1的结构中发现了一段存在于2B结构域外侧并具有独特折叠模式的2C结构域,并证实了该结构域拥有对ScPif1解旋和易位活性的调控作用。
5)首次从晶体结构中成功鉴定出了生物学相关的二聚体形式,并在此基础上提出了一种G4 DNA诱导的ScPif1二聚体形成机制。
6)首次在晶体结构中发现了一段潜在的G4 DNA结合位点,并通过突变实验验证了该位点中多个氨基酸参与G4 DNA的特异性结合和解旋活性。
从结构上解释了ScPif1所具有的G4 DNA识别机制。
综上所述,本论文通过对ScPif1解旋核心结构的深入研究,阐明了ScPif1对多种生理底物的识别机制以及结合底物后的寡聚状态,为进一步理解ScPif1在体内发挥的多种功能提供了理论依据。